TWI488661B - 崩解抑制病毒細菌感染增殖之物質及方法 - Google Patents

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Description

崩解抑制病毒細菌感染增殖之物質及方法
本發明關於一種廣效性崩解抑制病毒細菌感染增殖之物質及其相關方法，特別是抑制有套膜者諸如流感病毒H1N1,H5N1,H5N1亞型及無套膜者諸如腸病毒71型，與其他如葡萄球菌等之增殖感染之物質及其相關方法。
造成全世界100多餘國疫情、並引起國際間高度重視的新型流感H1N1亞型在歐美已經造成千分之二到四的死亡率，及近幾年來世界各地仍頻傳局部性或全球性的禽流感H5N1亞型，或是一直持續存在於人類生活環境，分佈於全球各地，在可預見的未來尚不可能將之滅絕的重症腸病毒71型，都正在威脅著人類生命。並且，所有專家都對於已經產生抗藥性的新型流感(H1N1)即將為全球帶來的疫情隱憂，各國的衛生單位僅能進行消極的防堵，卻對如何更有效的第一線阻抗該病毒束手無策。在某些情況下，人可感染流感病毒但不顯示症狀，卻仍可將病毒傳播給其他人。因此，在體外防止病毒入侵被認為是預防抑制病毒感染增殖的第一線。因此，提出有效性且廣效性的體外防止病毒或細菌感染增殖的方法，對台灣亞洲及世界公共衛生具有重大的貢獻。
體外防止病毒或細菌感染的方法，大致可區分為物理性及化學性的破壞抑制病毒或細菌感染增殖(消毒法)。物理性消毒法一般分(1)放射線(2)過濾(3)加熱(4)冷凍(5)乾燥等，物理性消毒法受到使用上空間範圍之限制；相對而言化學消毒法之應用較為廣泛。通常被使用當成化學消毒劑(disinfectant)者基本上包括酸,、鹼、酒精、甲醚、表面活性劑(surfactants)、鹵化物(halogen)、氧化物、重金屬、與染料等。基本上，這些消毒劑藉由以下四種機制來達到抑制病毒細菌的感染增殖：(1)破壞病毒衣殼(capsid)或套膜(envelope)或細菌細胞壁/膜(2)解垮其輸送(3)使病毒細菌蛋白質變性(4)抑制酵素活性及/或接受器親和性。
化學消毒劑(disinfectant)的有效性與廣效性與否，基本上越有效則有可能對人類越危險，消毒劑的選用則依賴以下幾個參數做決定：包括(1)針對何種微生物?(2)使用消毒劑之處其特性為何?(3)疾病預防需求等等。
一般而言，一個理想的化學消毒劑(disinfectant)應該符合下列的特質：對廣泛性種類的傳染性微生物(infectant microbes)具有效性(effectiveness)；對有機化合物不敏感或可忽略；對微生物表面穿透能力奇佳；不具腐蝕性；不具毒性；對人類不具刺激性；具有持續性消毒效能的化學穩定性；高水溶性；待消毒物體表面好的吸附力與持續的抑制增殖感染作用；並且量產的價格合理。
然而，目前對於具有上列特質，且可有效性及廣效性破壞有/無套膜病毒及細菌、降低感染率以及對人體無害的抑制病毒/細菌感染增殖之方法，仍有需求。
中華民國專利公告號I304338揭露一種破壞冠狀病毒致病性之活性劑，活性成份為8-氫氧基辛烷酸(HO(CH2 )7 COOH)。該化合物破壞冠狀病毒的外膜，使冠狀病毒無法黏附宿主細胞而失去致病能力。
美國專利申請案US20090035339A1揭露一種使病毒喪失活性的方法，包括局部投與有機酸、短鏈烷基的陰離子界面活性劑混合物、鈣離子螯合劑及減泡劑的組合物。利用有機酸使病毒吸附於該陰離子界面活性劑上，再經由該陰離子界面活性劑與病毒磷脂質套膜或外殼作用，破壞病毒。
近數十年來，世界各地仍頻傳局部性或全球性的禽流感或近年的新型流感病毒H1N1亞型流行，威脅人類生命。而流感病毒也開始對已知藥物產生抗藥性。因此，提出(1)有效性且(2)廣效性具實用性的體外防止病毒/細菌感染增殖的方法，特別是抑制(1)有套膜的流感病毒H1N1,H5N1,H5N1亞型及(2)無套膜的腸病毒71型與(3)細菌增殖感染之方法，對世界公共衛生具有重大貢獻。
本發明關於一種廣效性崩解抑制病毒細菌感染增殖之物質及其相關方法，包括使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)或其鹽類，特別是抑制(1)有套膜的流感病毒H1N1,H5N1,H5N1亞型及(2)無套膜的腸病毒71型與(3)金黃色葡萄球菌增殖感染之方法。
本發明亦提供一種2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之製造方法，包括使2-(10-溴癸基)丙二酸乙酯(ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate)與硫脲(thiourea)及乙醇反應後，再與NaOH水溶液反應。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
本發明提供一種廣效性抑制病毒細菌感染增殖之方法，包括使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)或其鹽類。
化合物2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之製造，如第1圖所示，先使2-(10-溴癸基)丙二酸乙酯(ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate)與硫脲(thiourea)及95%乙醇反應後，該反應物再與NaOH水溶液反應。該反應物經調整pH值為約2之後，以乙醚萃取。移除萃取物中的溶劑之後，獲得2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)。該製造方法中，2-(10-溴癸基)丙二酸乙酯與硫脲的莫耳比為1:1.2，反應溫度較佳為乙醇沸點，約78~79℃。
本發明之2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的鹽類沒有特別限制，例如鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、硝酸鹽、鹽酸鹽或碳酸氫鹽等。上述2-(10-氫硫基癸基)丙二酸本身或其鹽類可將病毒表面的套膜(envelope)或外殼(coat)部份或全部分解，喪失對宿主細胞親和性結合的感染能力。
本發明之2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類較佳以溶液型態存在，可溶於水、C1 -C3 醇類、四氫呋喃(THF)、二甲基亞碸(DMSO)、或這些的混合溶劑中，但不限於此。較佳溶於乙醇及水的混合液。
本發明中，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類的濃度較佳為溶液總重的大於20ppm至小於1000ppm，不包含20ppm及1000ppm。更佳為溶液總重的45-750ppm。當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類的濃度低於20ppm時，無法產生抑制病毒感染功效；超過1000ppm時，則對宿主細胞產生細胞毒性。
本發明所述之「病毒」係生物學上定義之病毒，由核酸分子與蛋白質外殼所構成，根據外型及感染的表面組成結構基本上可區分為兩種類(1)有套膜(envelope)的病毒與(2)無套膜(envelope)的病毒。本發明之抑制病毒細菌感染增殖之方法較佳，可使有套膜的流行性感冒病毒喪失活性，該流感病毒包括H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H3N8、H5N1、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2及H10N7亞型，但不限於此。該流感病毒尚包括通常稱為"西班牙(Spanish)流行性感冒"、"亞洲(Asian)流行性感冒"、"香港(Hong Kong)流行性感冒"、"禽類流行性感冒"(avian influenza)、"豬流行性感冒"(swine influenza)、"馬流行性感冒"及"犬流行性感冒"之亞型等。本發明之實施例中，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類可有效使具有套膜(envelope)的人流感病毒H1N1亞型及禽流感病毒(avian influenza virus)H5N1亞型、H5N2亞型喪失活性，並且不產生使宿主細胞變形、溶解(lysis)或死亡(apotosis)等的細胞毒性(cytotoxic)。
本發明之抑制病毒細菌感染增殖之方法較佳，更可使無套膜的腸病毒(enterovirus)喪失活性。腸病毒屬於小RNA病毒科(Picornaviridae)，為一群病毒的總稱，該腸病毒依據基因序列分析結果，歸類分為人類腸病毒A、B、C、D(Human enterovirus A、B、C、D)型，其中腸病毒71型(enterovirus type 71)被歸類於人類腸病毒A型。在所有腸病毒中，除了小兒麻痺病毒之外，以腸病毒71型(Enterovirus Type 71)最容易引起神經系統的併發症。本發明之實施例中，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類可有效使無套膜(envelope)的腸病毒包括71型崩解喪失活性，並且不產生使宿主細胞變形、溶解(lysis)或死亡(apotosis)等的細胞毒性(cytotoxic)。
本發明之抑制病毒細菌感染增殖之方法較佳，更可使葡萄球菌(Staphylococcus )喪失活性失去感染能力。於葡萄球菌屬中包含有二十六種葡萄球菌。其中分別以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis )、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus )為最常見且可致病之葡萄球菌，但不限於此。金黃色葡萄球菌除了是食品工業污染的主要病原菌外，亦是醫院中造成慢性院內感染的致病菌，常造成手術部位感染或其他全身性感染。本發明之實施例中，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類可有效使金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )喪失活性失去致病能力。
本發明所述之「宿主細胞」包括人類細胞，但不限於此。該宿主細胞也可來自非人的動物，例如鳥類，包括家禽或野生候鳥；哺乳類動物，包括鼠、羊、牛、豬、或馬；非人靈長類動物，包括猴、猿、或黑猩猩；或其他動物。
本發明之抑制病毒細菌感染增殖之方法，包括使2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)或其鹽類在活體外與病毒接觸。
本發明所述之「活體」包括人體，但不限於此。該活體也可包括非人的動物，例如鳥類，包括家禽或野生候鳥；哺乳類動物，包括鼠、羊、牛、豬、或馬；非人靈長類動物，包括猴、猿、或黑猩猩；或其他動物。
本發明所述之「活體外與病毒細菌接觸」包括使2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類與病毒或細菌在含有活性的人或非人的動物組織或細胞之試管或培養皿等的動物體外接觸。
本發明之抑制病毒細菌感染增殖之方法，更包括將2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)或其鹽類添加於空氣清淨用品、個人衛生用品、或纖維材料中。
本發明之2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類可添加於個人衛生用品或空氣清淨用品，例如洗手乳、沐浴乳、洗髮精、乳液、或空氣清淨噴劑。當應用於個人衛生用品或空氣清淨用品時，可根據該用途所屬技術領域中慣用的調配方法，與其他添加劑適當混合。
本發明之2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類亦可添加於纖維材料中。該纖維材料可包括高分子不織布、天然纖維材料、或此等之混織物，但不限於此。該纖維材料可應用於口罩、隔離衣或空氣濾網等用途。而且，該纖維材料可視需要設置於口罩、隔離衣或空氣濾網的最外層或內層。
[實施例1]2-(10-氫硫基癸基)丙二酸製程
將2-(10-溴癸基)丙二酸乙酯(ethyl 2-(10-bromo-decyl)malonate)(5.5mmole)、硫脲(thiourea)(6.6mmole)及95%的乙醇(25mL)放置於50mL圓底瓶中，加熱迴流5小時。再加入2.0M NaOH水溶液(25mL)繼續加熱迴流約15小時。反應完成後，加入2M HCl水溶液，使溶液pH值約為2。該溶液以乙醚萃取三次，收集有機層，以飽和食鹽水清洗。再用無水硫酸鎂除去有機層中的水分，濃縮後於真空系統乾燥，移除有機溶劑，獲得2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)(圖1)。
[實施例2]抑制流感病毒株H1N1亞型感染增殖試驗
將狗腎(Madin-Darby canine kidney;MDCK)(ATCC CCL-34)細胞(數目約5×105 )培養於6孔微量細胞培養盤(Nunc)中，直到細胞培養完全，留待以下使用。
之後，選取流感病毒株H1N1亞型(A/WSN/33)(購自美國ATCC)，該病毒株為具有病毒力價105 PFU/mL(定義為每1mL含有10萬個病毒，使50%細胞感染的力價)。將此種病毒加入500μl的2倍濃度的細胞培養液(Eagle's minimum essential medium(MEM)，含有胎牛血清、非必須胺基酸、L-麩醯胺酸(glutamine)，盤林西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin))。
另外，將實施例1製造的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸分別以濃度0ppm,6ppm,20ppm,60ppm,200ppm,600ppm,2000ppm,及6000ppm濃度溶於乙醇水溶液(乙醇：水=1:10)中。將此溶液分別與上述含有病毒之細胞培養液1:1等量混合，室溫(約25℃)下靜置30分鐘。此為病毒處理組。總溶液中的細胞培養液和2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度均減半。
另外，以相同的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸濃度，與等量未添加病毒的2倍濃度的細胞培養液進行如上述相同的作用，作為對照組。總溶液中的細胞培養液和2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度均減半。
於上述混合病毒及2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之混合液以及作為對照的混合液，分別加入上述具有MDCK細胞的培養盤上。37℃恆溫感染2小時，使病毒吸附於感染細胞上。
抽出上述培養盤中的作用液，以PBS(磷酸緩衝生理鹽水；phosphate buffered saline)(Invitrogen)清洗細胞一次。同時也洗掉未感染、吸附細胞的病毒。
培養盤上各孔再分別加入2mL的上述的1倍濃度的細胞培養液(不含胎牛血清(fetal bovine serum))。於37℃恆溫培養36小時後，於倒立顯微鏡(Zeiss)下觀察各孔的細胞病變效應(cytopathic effect;CPE)。產生細胞病變效應的細胞呈現圓形化、脫落及壞死現象(如圖2)。三重覆結果歸納如表1所示。
結果顯示，在添加流感病毒H1N1型與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的病毒處理組中，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過30ppm時，細胞未發生病變(呈陰性)。此現象的形成可解釋為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用而喪失活性失去致病力所造成，因此細胞未出現病變。
另外，在未添加上述流感病毒H1N1型的對照組中，低濃度的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(≦300ppm)未使細胞呈現病變(CPE呈陰性)。此可解釋為在低於300ppm的濃度下，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸不會傷害細胞。當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過1000ppm，才出現細胞毒性。
[實施例3]抑制具克流感(TamifluTM )抗藥性的流感病毒株H1N1亞型感染增殖試驗
將狗腎(Madin-Darby canine kidney;MDCK)(ATCC CCL-34)細胞(數目約5×105 )培養於6孔微量細胞培養盤(Nunc)中，直到細胞培養完全，留待以下使用。
之後，選取具克流感(TamifluTM )抗藥性的流感病毒株H1N1亞型(A/TW/066/09)(購自美國ATCC)，該病毒株為具有病毒力價7x105 PFU/mL(定義為每1mL含有10萬個病毒，使50%細胞感染的力價)。
將前述兩種病毒分別加入500μl的2倍濃度的細胞培養液(Eagle's minimum essential medium(MEM)，含有胎牛血清、非必須胺基酸、L-麩醯胺酸(glutamine)，盤林西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin))。
另外，將實施例1製造的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸分別以0ppm,6ppm,20ppm,200ppm,600ppm,2000ppm,及6000ppm的濃度溶於乙醇水溶液(乙醇：水=1:10)中。將此溶液分別與上述含有病毒之細胞培養液等量混合，室溫(約25℃)下靜置30分鐘。此為病毒處理組。總溶液中的細胞培養液和2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度均減半。
另外，以相同的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸濃度，與等量未添加病毒的2倍濃度的細胞培養液進行如上述相同的作用，作為對照。總溶液中的細胞培養液和2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度均減半。
於上述混合病毒及2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之混合液以及作為對照的混合液，分別加入上述具有MDCK細胞的培養盤上。37℃恆溫感染2小時，使病毒吸附於感染細胞上。
抽出上述培養盤中的作用液，以PBS(磷酸緩衝生理鹽水；phosphate buffered saline)(Invitrogen)清洗細胞一次。同時也洗掉未感染、吸附細胞的病毒。
培養盤上各孔再分別加入2mL的上述的1倍濃度的細胞培養液(不含胎牛血清(fetal bovine serum))。於37℃恆溫培養36小時後，於倒立顯微鏡(Zeiss)下觀察各孔的細胞病變效應(cytopathic effect;CPE)。產生細胞病變效應的細胞呈現圓形化、脫落及壞死現象。三重覆結果歸納如表2所示。
結果顯示，在添加上述具克流感抗藥株流感病毒H1N1型與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的病毒處理組中，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過30ppm時，細胞未發生病變(呈陰性)。此現象的形成可解釋為克流感抗藥株的流感病毒H1N1與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用而喪失活性失去致病力所造成，因此細胞未出現病變。
另外，在未添加上述克流感抗藥株的流感病毒H1N1型的對照組中，低濃度的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(≦300ppm)未使細胞呈現病變(CPE呈陰性)。此可解釋為在低於300ppm的濃度下，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸不會傷害細胞。當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過1000ppm，才出現細胞毒性。
[實施例4]崩解具克流感(TamifluTM )抗藥性的流感病毒株H1N1亞型試驗
具克流感(TamifluTM )抗藥性的流感病毒株H1N1亞型(簡稱克流感抗藥株H1N1)(A/TW/066/09)(購自美國ATCC)，該病毒株為具有病毒力價7x105 PFU/mL(定義為每1mL含有10萬個病毒，使50%細胞感染的力價)。
接著，克流感抗藥株H1N1檢體透過靜電作用力方式，固定於已修飾完成並帶正電L-聚離胺酸溴化氫(poly-L-lysine hydrobromide)之雲母片上，進行原子力顯微技術之探討，比較未經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理前與經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理後之H1N1病毒影像，證明H1N1病毒在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理後病毒表面產生崩解而喪失對宿主親合結合失去致病力的現象。
經過甲醇以及去離子水清潔的雲母片後，將含有0.01%(wt/vol)L-聚離胺酸溴化氫溶液滴於雲母片上並反應30分鐘之後，用去離子水清洗雲母片表面數次。再將克流感抗藥株H1N1於室溫下加入至雲母片上5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。
透過多重模式中掃描式探針顯微鏡中的原子力顯微鏡進行研究，所使用的是輕敲式原子力顯微鏡(SPI300 HV,Seiko Instruments Inc.,Chiba,Japan)，其中並結合光學顯微鏡(Mitotoyo,Japan)觀察樣本。原子力顯微鏡使用的探針其頻率為140kHz。透過標準衍射光柵(Seiko Instruments Inc.,Chiba,Japan)進行AFM探針之校正。輕敲式原子力顯微技術是透過維持懸臂樑振幅之高低進行掃描。掃描先從20μm x 20μm區域大小開始，控制其中包含上百個克流感抗藥株H1N1病毒顆粒，之後逐漸將掃描影像大小，縮減至單一病毒區域大小(300nm x 300nm)。當未掃描至單一病毒顆粒影像時，會先來回掃描克流感抗藥株H1N1樣本，確認探針掃描不會出現加工影像，例如遲滯現象。第3圖A為克流感抗藥株H1N1病毒之原子力顯微術三度空間影像，可清楚看到單一克流感抗藥株H1N1病毒顆粒。第3圖A’為其側面剖析圖。
接者處理經過2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用過的克流感抗藥株H1N1病毒。經過甲醇以及去離子水清潔的雲母片後，將含有0.01%(wt/vol)L-聚離胺酸溴化氫溶液滴於雲母片上並反應30分鐘之後，用去離子水清洗雲母片表面數次。再將克流感抗藥株H1N1於室溫下加入至已修飾之雲母片上5分鐘，接著將2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(30ppm)加入至雲母基材上的病毒樣本上反應5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。掃描結果如第3圖B三度空間影像所示。第3圖B’為其側面剖析圖。
另外使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(1000ppm)，以相同方式加入雲母片上的病毒樣本上反應5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。掃描結果如第3圖C所示，第3圖C為三度空間影像，第3圖C’為側面剖析圖。
第3圖中的A,B及C圖可清楚看到，經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理之克流感抗藥株H1N1病毒已有崩解之現象。由第3圖之側面剖析圖A’分析得知，未處理的克流感抗藥株H1N1病毒高度為約54奈米，在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(30ppm)處理後，扁平化成為約7奈米的高度，在經過2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(1000ppm)處理後，扁平化成為約5奈米的高度。而且，比較第3圖之側面剖析圖B’與C’後得知，經較高濃度(1000ppm)處理者(第3圖B)，H1N1病毒高度較低，顯示崩解程度較高。此兩現象的形成可了解是因為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用病毒外部套膜遭受破壞，內容物流失而扁平化所造成。
[實施例5]抑制禽流感病毒株H5N1亞型感染增殖試驗
將狗腎(Madin-Darby canine kidney;MDCK)(ATCC CCL-34)細胞培養於96孔微量細胞培養盤(Nunc)中，直到細胞培養完全，留待以下使用。
另外，選取禽流感病毒株H5N1亞型(TW1209/03(H5N2)AIV)(家畜衛生試驗所分離台灣野外株)，該病毒株為具有病毒力價107 EID50 /0.1mL(定義為每0.1mL含有1000萬個病毒，使50%雞胚感染的力價)或者血球凝集單位力價64HAU/25μL(定義為每25μL含有64個血球凝集單位的力價)者。
將此病毒株以PBS(Sigma)稀釋1：100後，與溶於乙醇水溶液(乙醇：水=1:10)之濃度為0ppm,6ppm,20ppm,200ppm,600ppm,2000ppm,及6000ppm的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸，分別等量混合，室溫(約25℃)下靜置30分鐘。此為病毒處理組。總溶液中2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度減半。
另外以相同的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸濃度，與等量未添加病毒的PBS溶液進行相同的作用，作為對照。總溶液中2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度減半。
於上述混合病毒及2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之混合液以及作為對照的混合液中，各自加入100μL的MEM(minimum essential medium)培養液(GIBCO)，再分別加入上述具有MDCK細胞的培養盤上。37℃恆溫感染2小時，使病毒吸附於感染細胞上。
抽出上述培養盤中的作用液，以MEM培養液清洗細胞。同時也洗掉未感染、吸附細胞的病毒。
培養盤上各孔再分別加入100μL的MEM培養液，於37℃恆溫培養7天後，於倒立顯微鏡(Nikon)下觀察各孔的細胞病變效應(cytopathic effect;CPE)。產生細胞病變效應的細胞呈現圓形化、脫落及壞死現象。同時檢測各孔培養液的血球凝集活性(hemagglutination activity)。取各孔培養液50μL放在96孔微量V底盤(Nunc)，加入25μL的1%雞紅血球懸浮液(雞紅血球懸浮於PBS，自行配製)。混合均勻後置於室溫30分鐘判讀是否產生血球凝集現象，血球均勻分布於試驗盤底部表示為陽性，血球沉降於試驗盤底部呈現日本國旗樣表示為陰性。三重覆結果歸納如表3所示。
在添加禽流感病毒H5N1型與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的病毒處理組中，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過100ppm時，細胞未發生病變(呈陰性)。此現象的形成可了解是因為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用而喪失活性，失去致病力所造成。因此細胞未出現病變及血球凝集的現象。
另外，在未添加禽流感病毒H5N1型的對照組中，低濃度的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(≦300ppm)未使細胞呈現病變(CPE呈陰性)。此可解釋為在低於300ppm的濃度下，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸不會傷害細胞。當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過1000ppm，才出現細胞毒性(CPE呈陽性)。
從血球凝集力價(HA)的結果來看，濃度在100ppm以上時，血球未出現凝集(HA呈陰性)。亦可說明為，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度在100ppm以上時，有效使禽流感病毒H5N2型喪失活性，因此病毒未增殖，血球凝集呈現陰性。
[實施例6]抑制禽流感病毒株H5N2亞型感染增殖試驗
將狗腎(Madin-Darby canine kidney;MDCK)(ATCC CCL-34)細胞培養於96孔微量細胞培養盤(Nunc)中，直到細胞培養完全，留待以下使用。
選取禽流感病毒H5N2亞型株(TW1209/03(H5N2)AIV；家畜衛生試驗所分離台灣野外株)，該病毒株為具有病毒力價107 EID50 /0.1mL(定義為每0.1mL含有1000萬個病毒，使50%雞胚感染的力價)或者血球凝集單位力價64HAU/25μL(定義為每25μL含有64個血球凝集單位的力價)者。
將此病毒株以PBS(Sigma)稀釋1：100後，與溶於乙醇水溶液(乙醇：水=1:10)之濃度為0ppm,6ppm,20ppm,200ppm,600ppm,2000ppm,及6000ppm的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸，分別等量混合，室溫(約25℃)下靜置30分鐘。此為病毒處理組。總溶液中2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度減半。
另外以相同的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸濃度，與等量未添加病毒的PBS溶液進行相同的作用，作為對照。總溶液中2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度減半。
於上述混合病毒及2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之混合液以及作為對照的混合液中，各自加入100μL的MEM(minimum essential medium)培養液(GIBCO)，再分別加入上述具有MDCK細胞的培養盤上。37℃恆溫感染2小時，使病毒吸附於感染細胞上。
抽出上述培養盤中的作用液，以MEM培養液清洗細胞。同時也洗掉未感染、吸附細胞的病毒。
培養盤上各孔再分別加入100μL的MEM培養液，於37℃恆溫培養7天後，於倒立顯微鏡(Nikon)下觀察各孔的細胞病變效應(cytopathic effect;CPE)。產生細胞病變效應的細胞呈現圓形化、脫落及壞死現象。同時檢測各孔培養液的血球凝集活性(hemagglutination activity)。取各孔培養液50μL放在96孔微量V底盤(Nunc)，加入25μL的1%雞紅血球懸浮液(雞紅血球懸浮於PBS，自行配製)。混合均勻後置於室溫30分鐘判讀是否產生血球凝集現象，血球均勻分布於試驗盤底部表示為陽性，血球沉降於試驗盤底部呈現日本國旗樣表示為陰性。三重覆結果歸納如表4所示。
在添加禽流感病毒H5N2型與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的病毒處理組中，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過100ppm時，細胞未發生病變(呈陰性)。此現象的形成可了解是因為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用而喪失活性，失去致病力所造成。因此細胞未出現病變及血球凝集的現象。
另外，在未添加禽流感病毒H5N2型的對照組中，低濃度的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(≦300ppm)未使細胞呈現病變(CPE呈陰性)。此可解釋為在低於300ppm的濃度下，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸不會傷害細胞。當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量超過1000ppm，才出現細胞毒性(CPE呈陽性)。
從血球凝集力價(HA)的結果來看，濃度在100ppm以上時，血球未出現凝集(HA呈陰性)。亦可說明為，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度在100ppm以上時，有效使禽流感病毒H5N2型喪失活性，因此病毒未增殖，血球凝集呈現陰性。
[實施例7]崩解禽流感病毒株H5N2亞型試驗
選取禽流感病毒株H5N2亞型(TW1209/03(H5N2)AIV)(家畜衛生試驗所分離台灣野外株)，該病毒株為具有病毒力價107 EID50 /0.1mL(定義為每0.1mL含有1000萬個病毒，使50%雞胚感染的力價)或者血球凝集單位力價64HAU/25μL(定義為每25μL含有64個血球凝集單位的力價)者。接著，禽流感病毒H5N2檢體透過靜電作用力方式，固定於已修飾完成並帶正電L-聚離胺酸溴化氫(poly-L-lysine hydrobromide)之雲母片上，進行原子力顯微技術之探討，比較未經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理前與經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理後之H1N1病毒影像，證明H1N1病毒在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理後病毒表面產生崩解而喪失對宿主親合結合失去致病力的現象。
經過甲醇以及去離子水清潔的雲母片後，將含有0.01%(wt/vol)L-聚離胺酸溴化氫溶液滴於雲母片上並反應30分鐘之後，用去離子水清洗雲母片表面數次。再將禽流感病毒H5N2亞型於室溫下加入至雲母片上5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。
透過多重模式中掃描式探針顯微鏡中的原子力顯微鏡進行研究，所使用的是輕敲式原子力顯微鏡(SPI300 HV,Seiko Instruments Inc.,Chiba,Japan)，其中並結合光學顯微鏡(Mitotoyo,Japan)觀察樣本。原子力顯微鏡使用的探針其頻率為140kHz。透過標準衍射光柵(Seiko Instruments Inc.,Chiba,Japan)進行AFM探針之校正。輕敲式原子力顯微技術是透過維持懸臂樑振幅之高低進行掃描。掃描先從20μm x 20μm區域大小開始，控制其中包含上百個禽流感H5N2亞型病毒顆粒，之後逐漸將掃描影像大小，縮減至單一病毒區域大小(300nm x 300nm)。當未掃描至單一病毒顆粒影像時，會先來回掃描禽流感病毒H5N2亞型樣本，確認探針掃描不會出現加工影像，例如遲滯現象。第4圖A為禽流感H5N2亞型病毒之原子力顯微術三度空間影像，可清楚看到單一禽流感H5N2亞型病毒顆粒。第4圖A’為其側面剖析圖。
接者處理經過2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用過的禽流感H5N2亞型病毒。經過甲醇以及去離子水清潔的雲母片後，將含有0.01%(wt/vol)L-聚離胺酸溴化氫溶液滴於雲母片上並反應30分鐘之後，用去離子水清洗雲母片表面數次。再將禽流感病毒H5N2亞型於室溫下加入至已修飾之雲母片上5分鐘，接著將2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(100ppm)加入至雲母基材上的病毒樣本上反應5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。掃描結果如第7圖B三度空間影像所示。第4圖B’為其側面剖析圖。
另外使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(1000ppm)，以相同方式加入雲母片上的病毒樣本上反應5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。掃描結果如第4圖C所示，第4圖C為三度空間影像，第4圖C’為側面剖析圖。
第4圖中的A,B及C圖可清楚看到，經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理之禽流感H5N2亞型病毒已有崩解之現象。由第4圖之側面剖析圖A’分析得知，未處理的禽流感H5N2亞型病毒高度為約32奈米，在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(30ppm)處理後，扁平化成為約14奈米的高度，在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(1000ppm)處理後，扁平化成為約6奈米的高度。而且，比較B及C圖之側面剖析圖B’及C’可知，經較高濃度(1000ppm)處理者(C’圖)，H1N1病毒顆粒高度較低，顯示崩解程度較高。此現象的形成可了解是因為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用套膜受破壞內容物流失而扁平化所造成。
此兩現象的形成可了解是因為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用病毒遭受破壞，內容物流失而扁平化所造成。
[實施例8]崩解無套膜腸病毒71型試驗
選取人腸病毒病毒株71型，該病毒株為具有病毒力價約106 PFU/mL(定義為每1mL含有10萬個病毒，使50%細胞感染的力價)。接著，腸病毒71型檢體透過靜電作用力方式，固定於已修飾完成並帶正電L-聚離胺酸溴化氫(poly-L-lysine hydrobromide)之雲母片上，進行原子力顯微技術之探討，比較未經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理前與經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理後之H1N1病毒影像，證明H1N1病毒在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理後病毒表面產生崩解而喪失對宿主親合結合失去致病力的現象。
經過甲醇以及去離子水清潔的雲母片後，將含有0.01%(wt/vol)L-聚離胺酸溴化氫溶液滴於雲母片上並反應30分鐘之後，用去離子水清洗雲母片表面數次。再將腸病毒71型於室溫下加入至雲母片上5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。
透過多重模式中掃描式探針顯微鏡中的原子力顯微鏡進行研究，所使用的是輕敲式原子力顯微鏡(SPI300 HV,Seiko Instruments Inc.,Chiba,Japan)，其中並結合光學顯微鏡(Mitotoyo,Japan)觀察樣本。原子力顯微鏡使用的探針其頻率為140kHz。透過標準衍射光柵(Seiko Instruments Inc.,Chiba,Japan)進行AFM探針之校正。輕敲式原子力顯微技術是透過維持懸臂樑振幅之高低進行掃描。掃描先從20μm x 20μm區域大小開始，控制其中包含上百個腸病毒71型病毒顆粒，之後逐漸將掃描影像大小，縮減至單一病毒區域大小(300nm x 300nm)。當未掃描至單一病毒顆粒影像時，會先來回掃描腸病毒71型樣本，確認探針掃描不會出現加工影像，例如遲滯現象。第5圖A為腸病毒71型病毒之原子力顯微術三度空間影像，可清楚看到單一腸病毒71型病毒顆粒。第5圖A’為其側面剖析圖。
接者處理經過2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用過的腸病毒71型病毒。經過甲醇以及去離子水清潔的雲母片後，將含有0.01%(wt/vol)L-聚離胺酸溴化氫溶液滴於雲母片上並反應30分鐘之後，用去離子水清洗雲母片表面數次。再將腸病毒71型於室溫下加入至已修飾之雲母片上5分鐘，接著將2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(30ppm)加入至雲母基材上的病毒樣本上反應5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。掃描結果如第5圖B三度空間影像所示。第5圖B’為其側面剖析圖。
另外使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(1000ppm)，以相同方式加入雲母片上的病毒樣本上反應5分鐘，之後迅速進行原子力顯微術實驗。掃描結果如第5圖C所示，第5圖C為三度空間影像，第5圖C’為側面剖析圖。
第5圖中的A,B及C圖可清楚看到，經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理之腸病毒71型病毒已有崩解之現象。由第5圖之側面剖析圖A’分析得知，未處理的腸病毒71型病毒高度為約75奈米，在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(30ppm)處理後，扁平化成為約10奈米的高度，在經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(1000ppm)處理後，扁平化成為約8奈米的高度。而且，比較第5圖之側面剖析圖B’與C’後得知，經2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(30ppm與1000ppm)處理後腸病毒71型病毒其崩解高度已經相差不多(兩者高度均約8-10奈米)，顯示崩解程度相同。此兩現象的形成可了解是因為病毒與2-(10-氫硫基癸基)丙二酸作用病毒遭受破壞，內容物流失而扁平化所造成。
[實施例9]抑制金黃色葡萄球菌增殖試驗
選取金黃色葡萄球菌標準菌株Staphylococcus aureus (ATCC-25923)(簡稱(S. aureus )，接種於LB培養液中，置入37℃培養箱培養達到生長對數期(約12～18小時)，透過分光光度計進行，並使用固定波長620nm控制S. aureus -25923 吸光值於0.1。計算溶液中總生菌數至10000CFU，以提供之後生物感受性(susceptibility)測試時使用。
將此S. aureus 葡萄球菌於LB培養液中取出500μL與溶於乙醇水溶液(1:10)做為溶劑的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸以等體積量混合，做為S. aureus 葡萄球菌實驗組。總溶液中2-(10-氫硫基癸基)丙二酸的濃度減半。實驗組完成反應後，分別取100μL反應後之S. aureus 混合液滴入含有LB洋菜膠培養基中進行塗盤，再置放於37℃培養箱中進行O/N培養(約12～18小時)，觀察2-(10-氫硫基癸基)丙二酸是否對S. aureus 產生抑制效果。三重覆結果歸納如表5所示。
由表5得知，在上述S. aureus 葡萄球菌與添加2-(10-氫硫基癸基)丙二酸實驗組的數據中發現，當2-(10-氫硫基癸基)丙二酸添加量最終濃度超過20ppm時，2-(10-氫硫基癸基)丙二酸使S. aureus 葡萄球菌失去活性抑制增殖，致使其喪失致病能力所得到之結果。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示製造2-(10-氫硫基癸基)丙二酸之方法。
第2圖顯示流感病毒H1N1亞型感染細胞病變效應後細胞呈現圓形化、脫落及壞死現象。
第3圖顯示未經處理的克流感抗藥株H1N1病毒顆粒之奈米結構原子力顯微圖(A)及其側面剖析圖(A’)。分別經30ppm與1000ppm的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理之克流感抗藥株H1N1病毒顆粒之奈米結構原子力顯微圖(B與C)及其側面剖析圖(B’與C’)。
第4圖顯示未經處理的禽流感H5N2病毒顆粒之奈米結構原子力顯微圖(A)及其側面剖析圖(A’)。分別經30ppm與1000ppm的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理之禽流感H5N2病毒顆粒之奈米結構原子力顯微圖(B與C)及其側面剖析圖(B’與C’)。
第5圖顯示未經處理的腸病毒71型病毒顆粒之奈米結構原子力顯微圖(A)及其側面剖析圖(A’)。分別經30ppm與1000ppm的2-(10-氫硫基癸基)丙二酸處理之腸病毒71型病毒顆粒之奈米結構原子力顯微圖(B與C)及其側面剖析圖(B’與C’)。

Claims (16)

  1. 一種於活體外抑制病毒之方法，包括使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)或其鹽類；其中該病毒為人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒、人豬或人禽基因重組流感病毒、無套膜的腸病毒(enterovirus)、或其組合；其中該2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類溶於一溶劑中；其中該2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類的濃度為大於30ppm、小於1000ppm，但不包含30ppm及1000ppm，以2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類及溶劑的總重為基礎。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該病毒為H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N3、H5N8、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7亞型、或其組合。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該溶劑包括水、C1 -C3 醇類、四氫呋喃(THF)、二甲基亞碸(DMSO)、或前述之混合。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其係抑制人或非人的動物受病毒感染。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，更包括將2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽添加於個人衛生用品、空氣清淨用品或纖維材料。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該個人衛生用品包括洗手乳、沐浴乳、或乳液。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該空氣清淨用品包括空氣清淨噴劑。
  8. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該纖維材料包括口罩、隔離衣、或空氣濾網。
  9. 一種使用2-(10-氫硫基癸基)丙二酸(2-(10-mercaptodecyl)malonic acid)或其鹽類於製備抑制病毒之組合物的用途，其中該病毒為人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒、人豬或人禽基因重組流感病毒、無套膜的腸病毒(enterovirus)、或其組合；其中於該組合物中，該2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類溶於一溶劑中；其中於該組合物中，該2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類的濃度為大於300ppm、小於1000ppm，但不包含300ppm及1000ppm，以2-(10-氫硫基癸基)丙二酸或其鹽類及溶劑的總重 為基礎。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該病毒為H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N3、H5N8、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7亞型、或其組合。
  11. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該溶劑包括水、C1 -C3 醇類、四氫呋喃(THF)、二甲基亞碸(DMSO)、或前述之混合。
  12. 如申請專利範圍第9項之用途，其中前述組合物係抑制人或非人的動物受病毒感染。
  13. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該組合物係使用於個人衛生用品、空氣清淨用品或纖維材料。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該個人衛生用品包括洗手乳、沐浴乳、或乳液。
  15. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該空氣清淨用品包括空氣清淨噴劑。
  16. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該纖維材料包括口罩、隔離衣、或空氣濾網。
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，林志成，二-(十-氫氧基癸烷基)丙二酸及其衍生物對金黃色葡萄球菌活性及物性之研究，碩士論文，淡江大學生命科學研究所 *

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