CN104003345A - 一种具有三维微纳米结构表面的载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有三维微纳米结构表面的载体及其制备方法和应用，包括基底和与其连接的高分子三维微纳米结构表面层，所述高分子三维微纳米结构表面层的微纳米结构的尺度为100nm~100μm，所述高分子三维微纳米结构表面层的厚度为10nm~1μm，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：先在基底上进行微纳米加工形成具有微纳米结构的引发剂层，然后添加可聚合单体混合液形成高分子三维微纳米结构表面层；或先在基底上形成引发剂层，然后添加可聚合单体混合液，并在高分子膜层形成的过程中进行微纳米加工；或先在基底上形成高分子膜层，然后对高分子膜层进行微纳米加工。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种载体及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有三维微纳米结构表面的载体及其制备方法和应用。
背景技术
生物芯片一般指将生物样品高密度的固定在基底表面而得到的微阵列芯片，包括蛋白质阵列、DNA阵列、细胞与组织阵列、微流控芯片以及其他集成了生物相关功能的芯片。生物芯片具有高通量分析、低样品消耗、分析时间短和易于集成等诸多优点。随着近年来的不断发展，生物芯片技术在基因组学研究、蛋白质组学研究、药物筛选、疾病检测和个性化医疗等领域正发挥着越来越大的作用。
生物芯片由于需要将蛋白质、多肽、核酸等生物分子及细胞、组织等生物样品固定在芯片表面，因此通常在生物芯片的基底上进行一定的表面化学修饰。合理的化学修饰可以使生物样品固定的更为高效、稳定。为了进一步增强生物芯片对生物样品的固定能力，提高检测的信号强度，人们进行了大量表面化学方面的研究。其中，在生物芯片基底上构建一层具有三维结构的富含各种活性基团的高分子薄膜便是其中非常重要的一个研究方向。这类修饰方式所制备的表面通常被称作三维表面。
三维表面大大提高了生物样品在三维空间的结合位点数量，具有三维表面的生物芯片对生物样品的固定量可以达到普通芯片的数十甚至数百倍。然而，人们在进行检测时却发现，虽然利用三维表面可以得到非常大的固定信号，但是检测时的结合信号却并没有明显的提高，甚至更低。这说明，通过单纯的化学方法得到的三维表面无法同时为生物样品的固定和检测提供充足的空间。为此，人们提出了在三维表面上进行微纳米结构加工的解决方法。
表面微纳米结构加工是指，在生物芯片基底上进行表面化学修饰时，利用刻蚀、印刷等多种技术手段，构建出具有特定尺寸和形状微纳米结构的化学表面。通过控制这些结构的具体尺寸和形状，可以为固定物和检测物提供充足的固定和结合空间，在保证固定量的同时，大大提高检测信号的强度，从而充分发挥三维表面的作用。
虽然目前人们已经提出许多表面微纳米结构加工的方法，但这些方法都存在着一些问题。有的无法严格控制所获得结构的尺寸或形状，有的制备过程非常复杂繁琐，有的则需要特别定制的加工设备，而且这些方法在应用过程中都具有很大的局限性，适用范围小，不能较好的与三维表面的制备过程相兼容。这些问题大大限制了已有表面微纳米结构加工方法的可行性和实用性，影响了表面微纳米加工技术在三维表面上的使用效果。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术无法严格控制所获得芯片的结构，以及适用范围小，不能较好的与三维表面的制备过程相兼容，检测能力低等缺点，提供一种具有三维微纳米结构表面的载体及其制备方法和应用，从而能够得到微纳米结构和高分子膜密度厚度等参数均十分易于控制的三维表面，并且该载体制备出的生物芯片对生物样品的检测能力有极大的提高。
除非特别指明，本发明中的“基底”，包括一切可以用于制备生物芯片支持物的物质，例如玻璃、硅片、石英、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯等等。
除非特别指明，本发明中的“引发剂”，是指具有引发高分子进行聚合，或是可以促进高分子聚合反应进行的物质，同时引发剂还应当具有可以固定到上述基底上的基团，例如巯基末端的硫醇可固定在金膜表面，硅烷可固定在玻璃、硅片或聚二甲基硅氧烷的表面等等。
除非特别指明，本发明中的“可聚合单体”，是指可以通过聚合反应形成高分子聚合物的单体化合物，例如丙烯酸酯类、苯乙烯类和丙烯酰胺等。
除非特别指明，本发明中的“催化剂及其他物质”，是指引发、维持和终止高分子聚合反应进行的物质。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种具有三维微纳米结构表面的载体，包括基底1和与其连接的高分子三维微纳米结构表面层2，所述高分子三维微纳米结构表面层的微纳米结构的尺度为100nm~100μm，所述高分子三维微纳米结构表面层的厚度为10nm~1μm，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
先在基底上进行微纳米加工形成具有微纳米结构的引发剂层21，然后添加可聚合单体混合液形成高分子三维微纳米结构表面层；或
先在基底上形成引发剂层21，然后添加可聚合单体混合液，并在高分子膜层形成的过程中进行微纳米加工；或
先在基底上形成高分子膜层22，然后对高分子膜层进行微纳米加工。
优选地，所述微纳米加工的方法选自微接触印刷、光刻、紫外刻蚀和等离子刻蚀中的一种或多种。
优选地，所述基底由选自玻璃、硅片、石英、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种材料制成。
优选地，所述引发剂选自卤代化合物，该卤代化合物中含有可与基底键合的基团。
更优选地，所述卤代化合物为硫醇化合物和/或卤代硅烷化合物；
还优选地，所述硫醇化合物包括氯代烷烃硫醇化合物、溴代烷烃硫醇化合物和碘代烷烃硫醇化合物。
优选地，所述硫醇化合物的结构式如下述式Ⅰ所示：HS-(CH2)6-COO-CH2-M（式Ⅰ），其中M为Cl、Br或I。
进一步优选地，所述硅烷化合物为氯代烷烃硅烷化合物、溴代烷烃硅烷化合物和碘代烷烃硅烷化合物。
还优选地，所述硫醇化合物的结构式如下述式Ⅱ所示：H3Si-(CH2)6-COO-CH2-M（式Ⅱ），其中M为Cl、Br或I。
还优选地，当所述引发剂为硫醇化合物时，所述基底上还镀有金属膜、金属氧化物薄膜或颗粒层。
进一步优选地，所述金属膜选自金膜、银膜和三氧化二铝膜一种或多种。
更优选地，所述金膜除上层的金膜外，还包括下层的铬膜。
优选地，所述可聚合单体混合液中含有可聚合单体、催化剂和有机还原剂。
还优选地，所述可聚合单体混合液含有以摩尔数计的有机还原剂10~50份，催化剂10~50份和可聚合单体2~100份。
更优选地，所述可聚合单体选自丙烯酸酯、苯乙烯和丙烯酰胺中的一种或多种，进一步优选地，所述丙烯酸酯选自甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸N,N-二甲基乙酯中的一种或多种。
优选地，所述催化剂为过渡金属盐。
还优选地，所述过渡金属盐为铁盐或铜盐。
更优选地，所述铁盐为FeCl3，或所述铜盐为CuCl2。
优选地，所述有机还原剂选自单糖、苯酚及其衍生物、辛酸亚锡和抗坏血酸中的一种或多种。
还优选地，所述单糖选自葡萄糖、果糖和甘露糖中的一种或多种。
另一方面，本发明提供一种生物芯片，包括本发明所述的具有三维微纳米结构表面的载体和处于所述载体上的生物样品。
还一方面，本发明提供一种具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，包括以下步骤：配制引发剂溶液，然后在基底上形成高分子微纳米结构表面层，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
先在基底上进行微纳米加工形成具有微纳米结构的引发剂层，然后添加可聚合单体混合液形成具有三维微纳米结构的高分子膜层；
或先在基底上形成引发剂层，然后添加可聚合单体混合液，并在高分子膜层形成的过程中进行微纳米加工；
或先在基底上形成高分子膜层，然后对高分子膜层进行微纳米加工；
优选地，所述高分子膜层形成的时间为2-20h，还优选地，所述高分子膜层形成的时间为6-12h优选于无氧条件下生长高分子膜。
更优选地，所述引发剂溶液的浓度为0.1~100mM。
优选地，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将预制好的设有微纳米结构的模板浸泡于引发剂溶液中，取出，吹干；还优选地，浸泡30s~10min；更优选地，用氮气吹干；进一步优选地，所述预制好的设有微纳米结构的模板为微接触印刷印章；
2）再将步骤1）得到的、设有微纳米结构的模板贴于基底上并放置，形成设有微纳米结构的基底，取下设有微纳米结构的模板，再将基底清洗干净；还优选地，放置0.1~10min；更优选地，用乙醇和水将基底交替清洗干净；
3）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
4）再将步骤2）得到的、设有微纳米结构的基底浸泡于步骤3）制得的可聚合单体混合液中，生长高分子膜层后，取出，再将基底清洗干净，即得；还优选地，用乙醇和水将基底交替清洗干净。
优选地，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将基底浸泡于引发剂溶液中，还优选地，浸泡于引发剂溶液中10~30min，在基底上生成引发剂层后，取出后，再将基底清洗干净；还优选地，用乙醇和水将基底交替清洗干净；
2）将预制好的设有微纳米结构的模板贴于步骤1）制得的基底上，再利用紫外光或等离子体刻蚀或处理形成微纳米结构；还优选地，等离子体刻蚀或处理1~30min；进一步优选地，紫外光刻蚀或处理1小时以上；更优选地，所述设有微纳米结构的模板为掩膜；再优选地，所述掩膜为微孔滤膜或利用光刻形成光刻胶的掩膜；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm；
3）然后，从步骤2）制得的基底上取下预制好的设有微纳米结构的模板，将基底清洗干净，再用氮气吹干；优选地，当用紫外光或等离子体处理后，优选用乙醇和/或水将所述基底清洗干净；更还优选地，当利用紫外光刻蚀或等离子体刻蚀后，用乙醇和水交替将所述基底清洗干净前，还优选包括用乙醇或丙酮浸泡所述基底或超声处理将所述基底清洗干净；
4）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
5）再将步骤3）得到的、设有微纳米结构的基底浸泡于步骤4）制得的可聚合单体混合液中，生长高分子膜层后，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体取出后，清洗干净，即得；还优选地，用乙醇和水将所述载体交替清洗干净。
优选地，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将基底浸泡于引发剂溶液中，在基底上生成引发剂层后，再将基底清洗干净；还优选地，浸泡于引发剂溶液中10~30min，更优选地，用乙醇和水交替冲洗干净；
2）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
3）再将步骤1）得到的、上面生成有引发剂层的基底浸泡于步骤2）制得的可聚合单体混合液中，生长高分子膜层后，取出，清洗干净，优选地，用乙醇和水交替清洗干净；
4）将预制好的设有微纳米结构的模板贴于步骤3）制得的基底上，再利用紫外光刻蚀或等离子体刻蚀或处理形成微纳米结构，还优选地，等离子体刻蚀或处理1~30min，进一步优选地，紫外光刻蚀或处理1小时以上，更优选地，所述设有微纳米结构的模板为掩膜，再优选地，所述掩膜为微孔滤膜或利用光刻形成光刻胶掩膜；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm；
5）然后，从步骤4）制得的基底上取下预制好的设有微纳米结构的模板，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体清洗干净后，即得；优选地，当用紫外光或等离子体处理后，优选用乙醇和/或水将所述载体清洗干净；更还优选地，当利用紫外光刻蚀或等离子体刻蚀后，用乙醇和水交替将所述载体清洗干净前，还优选包括用乙醇或丙酮浸泡载体或超声处理所述载体。
优选地，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将基底浸泡于引发剂溶液中，还优选地，浸泡于引发剂溶液中10~30min，在基底上生成引发剂层，取出；
2）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
3）将预制好的具有微纳米管道的微流控芯片贴在步骤1）制得的、上面形成有引发剂层的基底上；所述微流控芯片上设有至少一个微纳米管道，所述微流控芯片上还设有与微纳米管道两端相连的出样口和进样口；
4）将步骤2）制得的可聚合单体混合液加入步骤3）制得的基底的所述微流控芯片的微纳米管道中，生长高分子三维微纳米结构表面层；再将水或乙醇通入步骤3）制得的基底的所述微流控芯片的微纳米管道中10~60min，清洗残留可聚合单体溶液；
5）从步骤4）制得的基底上去掉所述微流控芯片，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体清洗干净，吹干后，即得；还优选地，用水和乙醇清洗干净。
优选地，加入的所述有机还原剂溶液的浓度为10~1000mM，体积为1~50ml。
更优选地，加入的所述催化剂溶液的浓度为10~1000mM，体积为1~50ml。
进一步优选地，加入的所述可聚合单体溶液的浓度为0.1~1000mM，体积为2~100ml。
另一方面，本发明提供一种本发明所述的具有三维微纳米结构表面的载体在制备生物芯片中的应用。
再一方面，本发明提供一种本发明所述的具有三维微纳米结构表面的载体或本发明所述的芯片在制备用于检测生物样品的试剂盒中的应用。
本发明所述的载体的制备方法并不影响高分子膜本身的生长，因此这种将微纳米结构加工与高分子膜本身的生长相结合的制备方法，可得到微纳米结构和高分子膜密度厚度等参数均十分易于控制的三维表面，并且与普通的芯片相比，其对生物样品的检测能力有极大的提高；此外，通过试验证明，通过控制合适的长膜时间可以控制高分子膜的厚度，通过控制引发剂溶液的浓度可以控制合适的高分子膜密度，合适的高分子膜厚度和密度将有利于进行蛋白质等生物分子的检测，尤其是，高分子膜层形成的时间为6-12h，引发剂溶液的浓度为0.1~100mM时，其形成的载体上的高分子膜层厚度和密度更合适，利于检测。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中通过微接触印章在基底上印刷引发剂层的方法流程图；
图2为实施例2-4中通过掩膜刻蚀的微纳米加工方法制得本发明所述的具有三维微纳米结构表面的载体的方法流程图，图2A为利用掩膜在基底上刻蚀具有三维微纳米结构的引发剂层的流程图；图2B为利用掩膜刻蚀在图2A制得的具有三维微纳米结构的引发剂层的基底上形成高分子三维微纳米结构表面层的流程图；
图3为实施例5中通过具有微纳米管道的微流控芯片的微纳米加工方法制得本发明所述的具有三维微纳米结构表面的载体的方法流程图；
图4为图3中具有微纳米管道的微流控芯片的结构示意图；
图5为本发明实施例2所述的方法的制备的具有三维微纳米结构表面的载体的原子力学显微镜表征图；
图6为本发明实施例3所述的方法制备的三维微纳米结构表面作为保护层进行金刻蚀后的光学显微镜表征图；
图7为本发明实施例8中的具有三维纳米管道的微流控芯片用于蛋白质检测的结果；
图中，1为基底，2为高分子三维微纳米结构表面层，21为引发剂层，22为高分子膜层。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析级纯试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1.利用微接触印刷控制引发剂生长在金膜基底上制备具有三维
微纳米结构表面的载体
步骤如下：
1.在玻璃基底上用热蒸镀的方法（参见：热蒸镀法与溶胶-凝胶法制备的WO3薄膜，谢红；杨修文）制备一层2nm厚度的铬膜层作为下层和一层42nm厚度的金膜层作为上层，作为生物芯片的基底。
2.配制1ml浓度为100mM的HS-(CH2)6-COO-CH2-Br溶液作为引发剂溶液，通过调节其浓度可控制表面高分子膜的密度。
3.将微接触印刷印章清洗干净，浸泡在硫醇引发剂溶液中30s（可选择地，浸泡30s-10min）后，取出，用氮气吹干备用。
4.将基底清理干净，将微接触印刷印章平整的贴在基底表面，放置1min后，取下微接触印刷印章，将基底用乙醇和去离子水交替清洗干净（参见：Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers,JamesL.Wilbur,et al.,Adv.Mat.,1994,6,600-604）），具体结果如图1所示。
5.配制可聚合单体混合液:加入50ml浓度为10mM的有机还原剂抗坏血酸溶液，再加入50ml浓度为10mM的氯化铜溶液，最后再加入20ml浓度为0.1mM的甲基丙烯酸甲酯单体；再将溶液混合均匀，备用。
6.将基底浸泡在步骤5配制的可聚合单体混合液中，放置在无氧环境下生长高分子12小时。
7.达到预定生长时间后，将基底取出，用乙醇和水交替冲洗干净。
8.若需将芯片用于蛋白质检测等应用，则可进一步对生物芯片表面进行功能化处理，如进行酸化等等。
9.至此，便制备出具有三维微纳米结构表面的载体，将该芯片用于蛋白质、多肽、核酸等检测时，其检测信号将有极大的提高。
实施例2.利用紫外光刻蚀控制引发剂生长在金膜基底上制备具有三维
微纳米结构表面的载体
步骤如下：
1.在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层1nm厚度的铬膜层作为下层和一层100nm厚度的金膜层作为上层，作为生物芯片的基底。
2.配制500μl浓度为50mM的HS-(CH2)6-COO-CH2-I溶液作为引发剂溶液。
3.将步骤1中制备出的基底浸泡在步骤2中配制的引发剂溶液中10min.随后用乙醇和水将基底交替冲洗干净，备用（参见：Self-assembled monolayersof thiolates on metals as a form of nanotechnology,J.Christopher Love,et al.,Chem.Rev.,2005,105,1103-1169）。
4.取一片0.22μm孔径的微孔滤膜作为模板，平整的铺在基底表面。
5.然后将步骤4中的基底放在紫外灯管下照射，总的照射剂量应当不小于50J/cm2（Photooxidation of thiols in self-assembled monolayers on gold,J.Huang,et al.,J.Am.Chem.Soc.,1993,115,3342-3343），照射2小时。
6.照射完毕后，将基底取出，取下微孔滤膜，将基底在水中浸泡30min，然后用氮气吹干。
7.配制可聚合单体混合液：加入适量的浓度为500mM的有机还原剂葡萄糖溶液，再加入适量的浓度为500mM的氯化铁溶液，最后再加入适量的浓度为500mM的丙烯酸丁酯；再将溶液混合均匀，备用。
8.如实施例1的步骤6，将基底浸泡在可聚合单体混合液中，生长高分子膜10小时。
9.如实施例1的步骤7，达到预定时间后，将基底取出，用乙醇和水将基底交替冲洗干净，氮气吹干。
10.用此方法得到的具有三维微纳米结构表面的载体适合用于小体积生物样品的检测，如低分子量蛋白、多肽分子和小分子物质等。
将上述方法制得的载体至于Vecco Dimension3100原子力显微镜下观察，结果如图5所示，其表面层为三维微纳米结构，且其结构均匀，表明基于此方法制备的基底其表面形貌具有很好的可控性。
实施例3.利用等离子体刻蚀控制引发剂生长在金膜基底上制备具有三
维微纳米结构表面的载体
步骤如下：
1.在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层5nm厚度的铬膜层作为上层和一层20nm厚度的金膜层作为上层，作为生物芯片的基底。
2.配制引发剂溶液：配制200μl浓度为30mM的HS-(CH2)6-COO-CH2-Cl溶液作为引发剂溶液。
3.将步骤1中制备出的基底浸泡在步骤2中配制的引发剂溶液中20min，随后用乙醇和水将基底交替冲洗干净，备用。
4.如实施例2的步骤4，将微孔滤膜模板固定在基底表面。
5.将带有模板的基底放置在等离子体清洗仪的腔体中，用等离子体处理180s以上，此处所述的处理时间与等离子体清洗仪的具体型号及所设置的功率大小有关，具体数值视情况而定，但总的能量应当不低于50J/cm2。
6.如实施例2的步骤6，将基底处理干净，备用。
7.加入适量的浓度为1000mM的有机还原剂辛酸亚锡溶液，再加入适量的浓度为1000mM的氯化铁溶液，最后再加入适量的浓度为1000mM的苯乙烯，再将溶液混合均匀，备用。
8.如实施例1的步骤6，将基底浸泡在可聚合单体混合液中，生长高分子膜8小时。
9.如实施例1的步骤7，达到预定时间后，将基底取出，用乙醇和水将基底交替冲洗干净，氮气吹干。
将上述方法制得的载体至于奥林巴斯BX-53光学显微镜下观察，结果如图6所示，高分子膜厚度均匀，线条清晰，线条宽度及间隔均一，表明结构参数易于控制。
实施例4.利用光刻控制引发剂生长在金膜基底上制备具有三维微纳米
结构表面的载体
步骤如下：
1.如实施例1的步骤1，制备设有金膜层的基底作为基底。
2.配制引发剂溶液：配制100μl浓度为0.1mM的HS-(CH2)6-COO-CH2-Br溶液作为引发剂溶液。
3.将步骤1中制备出的基底浸泡在步骤2中配制的引发剂溶液中30min，随后用乙醇和水将基底交替冲洗干净，备用。
4.在基底表面旋涂一层20μm厚的正型光刻胶AZ-P4620，在115℃的热台上加热10min，除去光刻胶中的有机溶剂。
5.使用紫外光刻机通过光刻机掩膜对基底上的光刻胶曝光2min。
6.用1:3稀释的AZ-300K显影液显影3min，将基底用乙醇或纯水清洗干净，氮气吹干，备用。
7.如实施例2的步骤5或实施例3中的步骤5，对光刻胶作为掩膜的基底用等离子体进行刻蚀30min。
8.刻蚀完毕后，用丙酮（或乙醇）将基底浸泡60min，或者在超声波清洗仪处理30min，将残余的光刻胶除去。
9.将基底取出，用乙醇和纯水交替冲洗干净后，氮气吹干，备用。
10.加入适量的浓度为200mM的有机还原剂果糖溶液，再加入适量的浓度为200mM的氯化铁溶液，最后再加入适量的浓度为200mM的甲基丙烯酸羟乙酯，再将溶液混合均匀，备用。
11.如实施例1的步骤6，将基底浸泡在可聚合单体混合液中，生长高分子膜20小时。
12.如实施例1的步骤7，达到预定时间后，将基底取出，用乙醇和水将基底交替冲洗干净，氮气吹干。
实施例5.利用微流控芯片控制高分子生长在硅片基底上制备具有三维
微纳米结构表面的载体
步骤如下：
1.用硅片的抛光面作为生物芯片的基底。
2.将硅片放在培养皿中，再配制1ml浓度为100mMH3Si-(CH2)6-COO-CH2-Br液体作为引发剂溶液，并取2μl加入培养皿中，将培养皿封口，放置8小时以上，即可在硅片表面形成一层卤代硅烷引发剂自组装单分子层。
3.加入适量的浓度为800mM的有机还原剂葡萄糖溶液，再加入适量的浓度为800mM的氯化铁溶液，最后再加入适量的浓度为800mM的甲基丙烯酸-N,N-二甲基乙酯。将溶液混合均匀，备用。
4.取一块聚二甲基硅氧烷基底的具有微纳米管道的微流控芯片（参见：Soft lithography,Y.Xia & G.M.Whitesides,Annu.Rev.Mater.Sci.1998.28,153–84.）贴在硅片表面，微流控芯片与硅片之间可以通过范德华力较为牢固的粘合在一起。
5.利用注射器或注射泵向微流控芯片的管道中通入可聚合单体混合液，开始生长高分子膜18小时；并且在高分子膜生长过程中，应当保持可聚合单体混合液在微流管道中的不停流动，以保证有充足的反应物维持高分子膜的正常生长。
6.达到预定生长时间后，开始向微流管道中交替通入纯水和乙醇，持续30min，将微流管道中的残留可聚合单体混合液清洗干净。
7.将微流控芯片揭下后，用乙醇和纯水进一步将硅片交替清洗干净，用氮气吹干，即可得到具有三维微纳米结构表面的载体。
实施例6.利用等离子体刻蚀高分子膜制备具有三维微纳米结构表面的
载体
步骤如下：1.如实施例1的步骤1中，制备设有金膜层的基底作为生物芯片的基底。
2.如实施例1的步骤2中，配制引发剂溶液。
3.如实施例2的步骤3中，将基底浸泡在引发剂溶液中，得到均匀的一层引发剂自组装单分子层。
4.加入适量的浓度为400mM的有机还原剂甘露糖糖溶液，再加入适量的浓度为400mM的氯化铁溶液，最后再加入适量的浓度为400mM的丙烯酸胺。将溶液混合均匀，备用。
5.如实施例1的步骤6中，将基底浸泡在可聚合单体混合液中，控制时间，开始生长高分子膜2小时。
6.如实施例1的步骤7中，达到预定时间后，将基底取出，用乙醇和水将基底交替冲洗干净，用氮气吹干，备用。
7.取一片孔径在0.22的微孔滤膜，平整的铺在基底表面。然后将基底放入等离子体清洗仪的腔体中，用等离子体处理5min。
8.处理完毕后，将微孔滤膜取下，用乙醇和纯水将芯片交替冲洗干净，用氮气吹干。
实施例7.利用光刻胶作为掩膜制备具有三维微纳米结构表面的载体
具体步骤：
1.如实施例1的步骤1，制备设有金膜层的基底作为生物芯片的基底。
2.如实施例1的步骤2中，配制引发剂溶液。
3.如实施例2的步骤3中，将基底浸泡在引发剂溶液中，得到均匀的一层引发剂自组装单分子层。
4.如实施例1的步骤5中，配制可聚合单体混合液。
5.如实施例1的步骤6中，将基底浸泡在可聚合单体混合液中，控制时间，开始生长高分子膜。
6.如实施例1的步骤7中，达到预定时间后，将基底取出，用乙醇和水将基底交替冲洗干净，用氮气吹干，备用。
7.如实施例的步骤4所述，在芯片表面旋涂一层光刻胶，并除去光刻胶中的有机溶剂，用于光刻机曝光。需要特别说明的是，此处所指的光刻胶既可以是光学曝光所用的光刻胶，也可以是电子束曝光或聚焦离子束曝光所用的光刻胶，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等。不同的光刻胶与不同类型的曝光技术的组合使用，可以得到不同尺寸精度的微纳米结构，并不影响本发明所述方法的适用性。
8.如实施例4的步骤5所述，使用光刻机对光刻胶进行曝光。
9.如实施例4的步骤6所述，对光刻胶进行显影，并清洗吹干。
10.如实施例的步骤5或实施例的步骤5所述，用50J/cm2的紫外光对光刻胶作为掩膜的基底上的高分子膜进行刻蚀1小时。
11.如实施例4的步骤8，刻蚀完毕后，将基底上残留的光刻胶除去。
12.将基底用乙醇和纯水交替冲洗干净，用氮气吹干。
实施例8.具有三维微纳米结构表面的生物芯片对蛋白质检测结果的提高
在如下所述的具体操作步骤中，所用的芯片点样仪型号为sciFLEXARRAYER DW，BioDot.所用的表面等离子体共振成像（SPRimaging）仪型号为Kx5，由PLEXERA公司生产。
具体步骤如下：
1.基于实施例1的方法制备出基底作为基底的具有三维微纳米结构表面的载体，并如实施例1的步骤8所述进行了酸化。
2.配制浓度为1mM比例为1∶1的EDC/NHS溶液，铺在载体表面，放置10min，然后用纯水将载体冲洗干净，并用氮气吹干。
3.用芯片点样仪将200μg/ml的Protein A（购自上海雅心生物技术有限公司）样品固定到载体表面，用于检测；同时将5mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）样品固定到载体表面，用于作为对照，制得生物芯片。
4.将固定有样品的芯片安装到表面等离子体共振成像仪上，首先通入5mg/ml的BSA溶液并用1:200的磷酸缓冲液重生，然后通入用于检测的10μg/ml的H-IgG溶液两次，之间同样用1:200的磷酸缓冲液重生。
5.将得到的检测信号与未经微纳米结构加工的同种三维表面作比较，结果如图7所示。
从图7中可以看出，具有微纳米结构三维表面的芯片对H-IgG的检测信号强度约为未经微纳米结构加工三维表面芯片的两倍。因此，利用本发明所提出方法得当的具有三维微纳米结构表面的生物芯片，对生物样品的检测能力有很大的提高。
Claims (14)
1.一种具有三维微纳米结构表面的载体，包括基底和与其连接的高分子三维微纳米结构表面层，所述高分子三维微纳米结构表面层的微纳米结构的尺度为100nm~100μm，所述高分子三维微纳米结构表面层的厚度为10nm~1μm，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
先在基底上进行微纳米加工形成具有微纳米结构的引发剂层，然后添加可聚合单体混合液形成高分子三维微纳米结构表面层；或
先在基底上形成引发剂层，然后添加可聚合单体混合液，并在高分子膜层形成的过程中进行微纳米加工；或
先在基底上形成高分子膜层，然后对高分子膜层进行微纳米加工。
2.根据权利要求1所述的具有三维微纳米结构表面的载体，其特征在于，所述微纳米加工的方法选自微接触印刷、光刻、紫外刻蚀和等离子刻蚀中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的具有三维微纳米结构表面的载体，其特征在于，所述基底由选自玻璃、硅片、石英、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或多种材料制成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体，其特征在于，所述引发剂为卤代化合物，并含有可与基底键合的基团；
优选地，所述卤代化合物选自硫醇化合物和硅烷化合物；更优选地，所述硫醇化合物包括氯代烷烃硫醇化合物、溴代烷烃硫醇化合物和碘代烷烃硫醇化合物；还优选地，所述硫醇化合物的结构式如下述式Ⅰ所示：式Ⅰ：HS-(CH2)6-COO-CH2-M，其中M为Cl、Br或I；进一步优选地，所述硅烷包括氯代烷烃硅烷化合物、溴代烷烃硅烷化合物和碘代烷烃硅烷化合物；还优选地，所述硫醇化合物的结构式如下述式Ⅱ所示：式Ⅱ：H3Si-(CH2)6-COO-CH2-M，其中M为Cl、Br或I；
还优选地，当所述引发剂为硫醇化合物时，所述基底上还镀有金属膜、金属氧化物薄膜或颗粒层；
进一步优选地，所述金属膜选自金膜、银膜和三氧化二铝膜一种或多种，更优选地，所述金膜除上层的金膜外，还包括下层的铬膜；
再优选地，所述可聚合单体混合液含有可聚合单体、催化剂和有机还原剂，还优选地，所述可聚合单体混合液含有以摩尔数计的有机还原剂10~50份，催化剂10~50份和可聚合单体2~100份；
更优选地，所述可聚合单体选自丙烯酸酯、苯乙烯和丙烯酰胺中的一种或多种，进一步优选地，所述丙烯酸酯选自甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸N,N-二甲基乙酯中的一种或多种；
或更优选地，所述催化剂为过渡金属盐，还优选地，所述过渡金属盐为铁盐或铜盐，进一步优选地，所述铁盐为FeCl3，或所述铜盐为CuCl2；
或更优选地，所述有机还原剂选自单糖、苯酚及其衍生物、辛酸亚锡和抗坏血酸中的一种或多种，还优选地，所述单糖选自葡萄糖、果糖和甘露糖中的一种或多种。
5.一种生物芯片，包括权利要求1至4中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体以及处于所述载体上的生物样品。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，包括以下步骤：配制引发剂溶液，然后在基底上形成高分子微纳米结构表面层，所述高分子三维微纳米结构表面层通过以下方法制得：
先在基底上进行微纳米加工形成具有微纳米结构的引发剂层，然后添加可聚合单体混合液形成具有三维微纳米结构的高分子膜层；
或先在基底上形成引发剂层，然后添加可聚合单体混合液，并在高分子膜层形成的过程中进行微纳米加工；
或先在基底上形成高分子膜层，然后对高分子膜层进行微纳米加工；
优选地，所述高分子膜层形成的时间为2-20h，还优选地，所述高分子膜层形成的时间为6-12h，优选地于无氧条件下生长高分子膜；
更优选地，所述引发剂的浓度为0.1~100mM。
7.根据权利要求6所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，其特征在于，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将预制好的设有微纳米结构的模板浸泡于引发剂溶液中，取出，吹干；优选地，浸泡30s~10min；还优选地，用氮气吹干；进一步优选地，所述预制好的设有微纳米结构的模板为微接触印刷印章；
2）再将步骤1）得到的、设有微纳米结构的模板贴于基底上并放置，形成设有微纳米结构引发剂层的基底，取下设有微纳米结构的模板，再将基底清洗干净；优选地，放置0.1~10min；还优选地，用乙醇和水将基底交替清洗干净；
3）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
4）再将步骤2）得到的、设有微纳米结构引发剂层的基底浸泡于步骤4）制得的可聚合单体混合液中，生长高分子膜层后，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体取出，清洗干净，即得；优选地，用乙醇和水将所述载体交替清洗干净。
8.根据权利要求6所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，其特征在于，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将基底浸泡于引发剂溶液中，在基底上生成引发剂层后，取出，再将基底冲洗干净；优选地，用乙醇和水将基底交替冲洗干净；
2）将预制好的设有微纳米结构的模板贴于步骤1）制得的基底上，再利用紫外光或等离子体刻蚀或处理形成微纳米结构；优选地，等离子体刻蚀或处理1~30min，或紫外光刻蚀或处理1小时以上；还优选地，所述设有微纳米结构的模板为掩膜；更优选地，所述掩膜为微孔滤膜或利用光刻形成光刻胶掩膜；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm；
3）然后从步骤2）制得的基底上取下预制好的设有微纳米结构的模板，将基底清洗干净；优选地，当用紫外光或等离子体处理后，优选用乙醇和/或水将所述基底清洗干净；更还优选地，当利用紫外光刻蚀或等离子体刻蚀后，用乙醇和水交替将所述基底清洗干净前，还优选包括用乙醇或丙酮浸泡所述基底或超声处理所述基底的步骤；
4）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
5）再将步骤3）制得的、设有微纳米结构的基底浸泡于步骤4）制得的可聚合单体混合液中，生长高分子膜层后，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体取出，清洗干净，即得；优选地，用乙醇和水将所述载体交替清洗干净。
9.根据权利要求6所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，其特征在于，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将基底浸泡于引发剂溶液中，在基底上生成引发剂层后，再将基底清洗，备用；优选地，用乙醇和水将基底交替清洗干净；
2）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
3）再将步骤1）制得的、上面生成有引发剂层的基底浸泡于步骤2）制得的可聚合单体混合液中，生长高分子膜层后，取出，再将基底清洗干净；优选地，用乙醇和水将基底交替清洗干净；
4）将预制好的设有微纳米结构的模板贴于步骤3）制得的基底上，再利用紫外光或等离子体刻蚀或处理形成微纳米结构；优选地，等离子体刻蚀或处理1~30min，进一步优选地，紫外光刻蚀或处理1小时以上；还优选地，所述设有微纳米结构的模板为掩膜；更优选地，所述掩膜为微孔滤膜或利用光刻形成光刻胶掩膜；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm；
5）然后从步骤4）制得的基底上取下预制好的设有微纳米结构的掩膜，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体清洗干净，即得；优选地，当用紫外光或等离子体处理后，优选用乙醇和/或水将所述载体清洗干净；更还优选地，当利用紫外光刻蚀或等离子体刻蚀后，用乙醇和水交替将所述载体清洗干净前，还优选包括用乙醇或丙酮浸泡载体或超声处理所述载体的步骤。
10.根据权利要求6所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，其特征在于，所述高分子三维微纳米结构表面层通过包括以下步骤的方法制得：
1）将基底浸泡于引发剂溶液中，在基底上生成引发剂层，取出；
2）将催化剂溶液加入有机还原剂溶液中，然后再加入可聚合单体溶液，制得可聚合单体混合液；
3）将预制好的具有微纳米管道的微流控芯片贴在步骤1）制得的、上面形成有引发剂层的基底上；所述微流控芯片上设有至少一个微纳米管道，所述微流控芯片上还设有与微纳米管道两端相连的出样口和进样口；
4）将步骤2）制得的可聚合单体混合液加入步骤3）制得的基底的所述微流控芯片的微纳米管道中，生长高分子膜层后；再将水或乙醇通入步骤3）制得的基底的所述微流控芯片的微纳米管道中10~60min，清洗残留可聚合单体混合液；
5）从步骤4）制得的基底上取下所述微流控芯片，制得具有三维微纳米结构表面的载体，再将所述载体清洗干净，吹干后，即得；优选地，用水和乙醇将所述载体交替清洗干净。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，其特征在于，加入的所述有机还原剂溶液的浓度为10~1000mM，体积为1~50ml；
优选地，加入的所述催化剂溶液的浓度为10~1000mM，体积为1~50ml；
还优选地，加入的所述可聚合单体溶液的浓度为0.1~1000mM，体积为20~100ml。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，将基底浸泡于引发剂溶液中10~30min。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体在制备生物芯片中的应用。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的具有三维微纳米结构表面的载体或权利要求5所述的芯片在制备用于检测生物样品的试剂盒中的应用。
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