CN103990424B - 一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法：蜡质淀粉溶于水加热糊化后冷却，加异淀粉酶完全脱支，离心后冷冻干燥得到直链糊精粉末；将直链糊精粉末溶解后置于结晶温度下，CLA溶于预热好的无水乙醇溶液中，然后加入到直链糊精溶液中并保温搅拌一定时间，取出冷却至室温离心后，沉淀物用无水乙醇/水混合液洗涤除去未复合的CLA，再次离心得到的沉淀真空干燥获得含有CLA的微胶囊包埋物。本方法提高了直链糊精和CLA复合物的溶解度、CLA的氧化稳定性和在水溶液中的生物利用度，从而解决了直链淀粉复合物溶解性差、CLA容易自动氧化及生物利用度低的问题，可作为一种营养强化剂添加到功能性营养强化食品及主食中。

Description

一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及功能性食品添加剂技术领域，尤其是涉及一种采用直链糊精包埋共轭亚油酸的方法。

背景技术

共扼亚油酸（CLA）是具有共轭双键的游离脂肪酸，是普遍存在于人和动物体内的天然活性营养物质，具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化、提高机体免疫力、促进生长、降低体脂等众多的生理功能，在药物、食品、保健品等领域有广阔的应用前景。然而，共轭亚油酸水溶性差，在含水体系中的利用率有限；化学稳定性较差，易被空气氧化变质，形成的氧化产物导致产品质量劣变和货架期缩短；因此不利于生产，储藏，运输和应用。

直链糊精是指葡萄糖以α-1,4-糖苷键连接而成的一系列具有不同聚合度的葡聚糖，可通过异淀粉酶水解支链淀粉得到。其基本结构单元与直链淀粉相同，但直链糊精的分子量更小、具有很好的水溶性。直链淀粉或直链糊精由于分子内氢键的作用，呈中空疏水的左手单螺旋状。现已发现直链淀粉或直链糊精能与醇类、芳香化合物、脂肪酸等生成复合物。这种复合物是V-型结晶结构。近年来关于直链淀粉作为微胶囊壁材的研究较多。但由于直链淀粉的分子量大，常温下不溶于水，制备微胶囊时需要有机溶剂助溶，会存在一定毒性，且形成的直链淀粉不饱和脂肪酸微胶囊溶解性差，限制了其应用范围。

由于与直链淀粉结构上的相似性，直链糊精可作为一种新型的包埋壁材，与不饱和脂肪酸形成V型结晶复合物，增大不饱和脂肪酸溶解度、提高不饱和脂肪酸的氧化稳定性和水中利用率。可应用食品级的淀粉脱支，形成直链糊精对极易氧化的共轭亚油酸进行包埋，扩大CLA应用范围，并为淀粉质资源的开发和利用开辟新的发展空间。

目前，还没有关于直链糊精作为微胶囊壁材的相关报道。这可能是因为，直链糊精及其包合物在制备过程中存在一些问题。制备直链糊精要求淀粉充分溶解，若使用有机溶剂助溶，也会存在毒性，而在高压下较高浓度的淀粉溶液不经搅拌容易成为胶状，黏在容器壁上；在制备微胶囊过程中，直链糊精容易再次凝沉，不易与被包埋物均匀混合；

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法。本方法提供了一种新型的包埋壁材，提高了直链糊精和CLA复合物的溶解度、CLA的氧化稳定性和在水溶液中的生物利用度，从而解决了直链淀粉复合物溶解性差、CLA容易自动氧化及生物利用度低的问题，可作为一种营养强化剂添加到功能性营养强化食品及主食中。

本发明的技术方案如下：

一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法，具体步骤如下：

（1）将蜡质淀粉均匀分散于水中，在沸水浴搅拌预糊化，再于110~130℃高压蒸煮10~30min至完全糊化后冷却；

（2）向糊化后的淀粉内加入异淀粉酶进行脱支，所述异淀粉酶的添加量为1~10U/g淀粉，反应温度为30~60℃，反应时间为12~48h；完全脱支后灭酶，离心、冷冻干燥得到直链糊精粉末；

（3）将直链糊精粉末加入NaOH溶液溶解，再依次加入蒸馏水和HCL溶液，稀释中和至pH=7，得到直链糊精溶液，直链糊精溶液含有直链糊精的质量百分比为0.5~3%，然后将其置于结晶温度下，所述结晶温度保持在20~90℃；

（4）将共轭亚油酸溶于预热至结晶温度的无水乙醇中，所述共轭亚油酸和无水乙醇的用量比为100g:1L~10g:1L，然后加入直链糊精溶液中并保温搅拌至少5min，所述直链糊精与共轭亚油酸的质量为8:1~15:1；

（5）搅拌后，取出混合物缓慢冷却至室温离心后，沉淀物用无水乙醇/水混合液洗涤除去未复合的共轭亚油酸，然后再次离心，将得到的沉淀真空干燥，即得直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊。

所述蜡质淀粉为蜡质玉米淀粉、蜡质马铃薯淀粉、蜡质大米淀粉。

所述步骤（2）中异淀粉酶的添加量优选7.50U/g淀粉；反应温度优选40℃；反应时间优选12h。

所述步骤（3）中直链糊精溶液含有直链糊精的质量百分比优选1%；结晶温度优选30℃。NaOH溶液的浓度为1M；HCL溶液的浓度为1M，蒸馏水和HCL溶液的体积比为8:1。

所述步骤（4）中乙醇的添加量优选0.5mL；保温搅拌时间优选2h；直链糊精与CLA的比例优选12:1。

所述步骤（5）中无水乙醇/水混合液中，无水乙醇和水的体积比为50:50。

所述共轭亚油酸用其他不饱和脂肪酸代替、或用抗氧化剂代替。所述不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、DHA；所述抗氧化剂包括辅酶Q10、绿原酸。

本发明有益的技术效果在于：

1、以往的直链淀粉制备包埋物时，需使用有机溶剂二甲亚砜（DMSO）溶解直链淀粉和脂肪酸分子；而本申请的包埋壁材直链糊精，可以在水溶液中溶解，针对在水中不溶解的共轭亚油酸可采用乙醇溶解后加入直链糊精水溶液中，这样可避免有机溶剂对人体造成的潜在毒性。

2、因为蜡质玉米淀粉的侧链链长聚合度为6-80葡萄糖残基，经异淀粉酶完全脱支后可得到直链糊精，该直链糊精分子量小、溶解性好且其基本结构与直链淀粉的螺旋结构相同。

3、步骤（1）中预先糊化搅拌使淀粉均匀分散于水中，防止静态高压蒸煮时，淀粉成胶状置于试管底部，难于均匀分散，影响异淀粉酶的作用效果。在110~130℃、优选121℃下高压蒸煮，可以使淀粉完全糊化，也可避免使用有机溶剂二甲亚砜（DMSO）溶解淀粉，造成对人体的潜在毒性。

4、现有技术中，有的是将玉米淀粉升温至75~85℃，然后加入异淀粉酶进行糊化，这样做无法保证淀粉脱支完全；而本申请的糊化方法可以保证淀粉完全脱支。

5、由于直链糊精在水中容易凝沉下来，因此步骤（2）中直链糊精粉末先加入NaOH溶液溶解，再用蒸馏水和HCL溶液稀释中和，防止溶解后的直链糊精再次析出凝沉。

6、步骤（4）中沉淀物用无水乙醇/水混合液（V:V=50:50）洗涤就可除去未复合的CLA，避免使用其他有毒的有机溶剂，如氯仿，乙醚等。

7、现有技术中有用环糊精来包埋CLA的，但是环糊精有自身缺陷，本申请采用的直链糊精和环糊精的区别在于：

（1）环糊精由淀粉酶法合成，是由D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接而成的一类环状低聚麦芽糖，由7个葡萄糖单元组成的环糊精最为常见。环糊精的疏水性空腔能够包埋各种疏水性化合物，形成稳定的复合物。但是由于环糊精空腔的刚性结构，只有一些分子大小正好合适的客体才能够被包埋，因此环糊精特别适合包埋带有芳香环的化合物。直链糊精是由D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接而成的链状生物大分子，与环糊精类似，直链糊精也具有内部疏水外部亲水的双亲性。与环糊精内部空腔的刚性结构不同，直链糊精呈现柔性结构，由于存在共轭双键，共轭亚油酸在空间上是弯曲的，因此直链糊精更适合作为包埋共轭亚油酸的壁材。

（2）酶法合成和分离纯化过程使得环糊精的价格高昂，而直链糊精是由价格低廉的蜡质淀粉完全脱支制得，无需分离，其成本相对较低；

（3）环糊精复合物的平均粒径为微米级（μm），在水溶液中产生大的凝集，延长储存时不稳定，很快沉淀下来；直链糊精复合物的平均粒径小于环糊精的复合物，为纳米级，悬浮液储存稳定性好；

（4）与环糊精复合物相比，直链糊精与CLA的相互作用强，对CLA起到更好的氧化保护作用；

（5）与环糊精相比，直链糊精易被肠道消化酶水解，因此直链糊精-CLA复合物在体内生物利用度更高，具有更好的靶向释放性。

附图说明

图1为实施例1制备得到的直链糊精的HPSEC图；

图2为实施例1制备得到的微胶囊的DSC图；

图3为实施例1制备得到的微胶囊的V型结晶X-RD衍射图谱

图4为实施例1制备得到的微胶囊在不同温度时间的溶解度变化；

图5为实施例1制备得到的微胶囊在60℃存放不同时间的过氧化值变化。

具体实施方式

实施例1

本申请提供了一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法，具体步骤如下：

（1）将1g蜡质淀粉均匀分散于90mL蒸馏水中，在沸水浴搅拌预糊化，再于121℃高压下蒸煮20min至完全糊化后冷却至室温；

（2）向糊化后的蜡质玉米淀粉内加入10mL醋酸钠缓冲液（0.1M，PH=3.5）及7.5U/g淀粉的异淀粉酶进行脱支，反应温度为40℃，反应时间为12h；完全脱支后，将完成水解反应的溶液于沸水浴中煮沸10min灭酶，5000r/min离心5min除去酶，旋转蒸发后冷冻干燥成粉末，即得直链糊精。

（3）将500mg直链糊精粉末加入5mL浓度为1M的NaOH溶液溶解，再加入40ml蒸馏水稀释，最后加入5mL浓度为1M的HCL溶液中和至混合溶液的pH=7，得到直链糊精的直链百分比为1%的溶液。所得溶液用N₂排气后在沸水浴中加热糊化，使溶液澄清透明，置于30℃的结晶温度下；

（4）将50mg共轭亚油酸溶于预热至结晶温度的1mL无水乙醇中，然后加入500mg的直链糊精溶液中并保温搅拌2h；

（5）搅拌后，取出混合物缓慢冷却至室温离心后（5000r/min，20min），沉淀物用无水乙醇/水混合液（50:50=V:V）洗涤两次，除去未复合的共轭亚油酸，然后再次离心，将得到的沉淀室温真空干燥，即得直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊。

将步骤（2）得到的直链糊精及原料蜡质玉米淀粉制成1%（w/v）的溶液，使用ShodexOHpakSB-804和SB-802.5柱，柱温50℃，超纯水为流动相，流速0.70mL/min，进样分析直链糊精链的聚合度。得到如图1所示的HPSEC图，从图中可以看到，蜡质玉米淀粉基本完全脱支，得到的直链糊精分子量较小。

将步骤（5）得到的微胶囊包埋物在Pris1DSC仪器上扫描，以5℃/min的速度从20℃扫描到110℃。得到如图2所示的DSC图谱，从图上可以看到，在83℃有吸热峰，证明了直链糊精-CLA的存在。

将步骤（5）得到的微胶囊包埋物在BrukerD8-AdvanceXRD仪器上测试，测试条件为扫描速度4°/min，扫描区域5°~35°，采样步宽0.02°。得到如图3所示的X射线衍射图谱。从图上可以看到，在2θ在7.6°、12.5°和19.8°具有特征衍射峰，证明了该直链糊精-CLA是V型结晶。

将步骤（5）得到的微胶囊包埋物0.50g样品分散于50ml蒸馏水中，分别在20℃、50℃、70℃、90℃的水浴中旋转震荡30min，然后1200r/min离心10min，将25ml的上清液倒入预先称重的称量瓶中，110℃干燥4h后称重。复合物在不同温度的溶解度变化如图4所示。其中，室温下包埋物的溶解度为62.64%，随温度的增大而增大，90℃时溶解度可达到90%。

将步骤（5）得到的微胶囊包埋物和物理混合物分别在63℃下保存0h、12h、1d、2d、3d、5d、10d后，使用硫氰酸铁法测定过氧化值，得到了如图5所示的在60℃存放不同时间的过氧化值变化。从图中可以发现该微胶囊复合物显著提高了共轭亚油酸的氧化稳定性。其中，经直链糊精包埋的共轭亚麻酸过氧化值为1.41meq/kg，未经包埋保护的共轭亚油酸过氧化值为28.86meq/kg，物理混合物过氧化值为22.75meq/kg。

实施例2

本申请提供了一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法，具体步骤如下：

（1）将1g蜡质淀粉均匀分散于90ml蒸馏水中，在沸水浴搅拌预糊化，再于110℃高压下蒸煮30min至完全糊化后冷却至室温；

（2）向糊化后的蜡质玉米淀粉内加入10mL醋酸钠缓冲液（0.1M，PH=3.5）及1U/g淀粉的异淀粉酶进行脱支，反应温度为30℃，反应时间为48h；完全脱支后，将完成水解反应的溶液于沸水浴中煮沸10min灭酶，5000r/min离心5min除去酶，旋转蒸发后冷冻干燥成粉末，即得直链糊精。

（3）将500mg直链糊精粉末加入10mL浓度为1M的NaOH溶液溶解，再加入80ml蒸馏水稀释，最后加入10mL浓度为1M的HCL溶液中和至混合溶液的pH=7，得到直链糊精的质量百分比为0.5%的溶液。所得溶液用N₂排气后在沸水浴中加热糊化，使溶液澄清透明，置于20℃的结晶温度下；

（4）将与直链糊精的质量为1:8的共轭亚油酸溶于预热至结晶温度的5mL无水乙醇中，然后加入500mg的直链糊精溶液中并保温搅拌至少5min；

（5）搅拌后，取出混合物缓慢冷却至室温离心后（5000r/min，20min），沉淀物用无水乙醇/水混合液（50:50=V:V）洗涤两次，除去未复合的共轭亚油酸，然后再次离心，将得到的沉淀室温真空干燥，即得直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊。

实施例3

本申请提供了一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法，具体步骤如下：

（1）将1g蜡质淀粉均匀分散于90ml蒸馏水中，在沸水浴搅拌预糊化，再于130℃高压下蒸煮10min至完全糊化后冷却至室温；

（2）向糊化后的玉米淀粉内加入10mL醋酸钠缓冲液（0.1M，PH=3.5）及10U/g淀粉的异淀粉酶进行脱支，反应温度为60℃，反应时间为12h；完全脱支后，将完成水解反应的溶液于沸水浴中煮沸10min灭酶，5000r/min离心5min除去酶，旋转蒸发后冷冻干燥成粉末，即得直链糊精。

（3）将500mg直链糊精粉末加入1.7mL浓度为1M的NaOH溶液溶解，再加入13.3ml蒸馏水稀释，最后加入1.7mL浓度为1M的HCL溶液中和至混合溶液的pH=7，得到直链糊精的质量百分比为3%的溶液。所得溶液用N₂排气后在沸水浴中加热糊化，使溶液澄清透明，置于90℃的结晶温度下；

（4）将与直链糊精的质量为1:15的共轭亚油酸溶于预热至结晶温度的0.5mL无水乙醇中，然后加入500mg的直链糊精溶液中并保温搅拌至多4h；

（5）搅拌后，取出混合物缓慢冷却至室温离心后（5000r/min，20min），沉淀物用无水乙醇/水混合液（50:50=V:V）洗涤两次，除去未复合的共轭亚油酸，然后再次离心，将得到的沉淀室温真空干燥，即得直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊。

实施例1~3中异淀粉酶的规格为1000U/mL，生产厂家是爱尔兰Megazyme公司，购买厂家是国内经销商上海超研生物科技有限公司。

实施例4

本申请还提供了一种直链糊精包埋辅酶Q10的微胶囊的制备方法，具体步骤如下：

（1）将1g蜡质淀粉均匀分散于90ml蒸馏水中，在沸水浴搅拌预糊化，再于121℃高压下蒸煮20min至完全糊化后冷却至室温；

（2）向糊化后的蜡质玉米淀粉内加入10mL醋酸钠缓冲液（0.1M，PH=3.5）及7.5U/g淀粉的异淀粉酶进行脱支，反应温度为40℃，反应时间为12h；完全脱支后，将完成水解反应的溶液于沸水浴中煮沸10min灭酶，5000r/min离心5min除去酶，旋转蒸发后冷冻干燥成粉末，即得直链糊精。

（3）将500mg直链糊精粉末加入5mL浓度为1M的NaOH溶液溶解，再加入40ml蒸馏水稀释，最后加入5mL浓度为1M的HCL溶液中和至混合溶液的pH=7，得到直链糊精的质量百分比为1%的溶液。所得溶液用N₂排气后在沸水浴中加热糊化，使溶液澄清透明，置于70℃的结晶温度下；

（4）将100mg辅酶Q10溶于预热至结晶温度的1mL无水乙醇中，然后加入500mg的直链糊精溶液中并保温搅拌24h；

（5）搅拌后，取出混合物缓慢冷却至室温离心后（5000r/min，20min），沉淀物用无水乙醇/水混合液（50:50=V:V）洗涤两次，除去未复合的辅酶Q10，然后再次离心，将得到的沉淀室温真空干燥，即得直链糊精包埋辅酶Q10的微胶囊。

Claims (10)

1.一种直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）将蜡质淀粉均匀分散于水中，在沸水浴搅拌预糊化，再于110~130℃蒸煮10~30min至完全糊化后冷却；

（2）向糊化后的淀粉内加入异淀粉酶进行脱支，所述异淀粉酶的添加量为1~10U/g淀粉，反应温度为30~60℃，反应时间为12~48h；完全脱支后灭酶，离心、冷冻干燥得到直链糊精粉末；

（3）将直链糊精粉末加入NaOH溶液溶解，再依次加入蒸馏水和HCL溶液，稀释中和至pH=7，得到直链糊精溶液，直链糊精溶液含有直链糊精的质量百分比为0.5~3%，然后将其置于结晶温度下，所述结晶温度保持在20~90℃；

（4）将共轭亚油酸溶于预热至结晶温度的无水乙醇中，所述共轭亚油酸和无水乙醇的用量比为100g:1L~10g:1L，然后加入直链糊精溶液中并保温搅拌至少5min，所述直链糊精与共轭亚油酸的质量比为8:1~15:1；

（5）搅拌后，取出混合物缓慢冷却至室温离心后，沉淀物用无水乙醇/水混合液洗涤除去未复合的共轭亚油酸，然后再次离心，将得到的沉淀真空干燥，即得直链糊精包埋共轭亚油酸的微胶囊。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述蜡质淀粉为蜡质玉米淀粉、蜡质马铃薯淀粉、蜡质大米淀粉。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中异淀粉酶的添加量7.50U/g淀粉；反应温度40℃；反应时间12h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中直链糊精溶液含有直链糊精的质量百分比1%；结晶温度30℃。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中乙醇的添加量0.5mL；保温搅拌时间2h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中NaOH溶液的浓度为1M；HCL溶液的浓度为1M，蒸馏水和HCL溶液的体积比为8:1。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中直链糊精与共扼亚油酸的比例12:1。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中无水乙醇/水混合液中，无水乙醇和水的体积比为50:50。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述共轭亚油酸用其他不饱和脂肪酸代替、或用抗氧化剂代替。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、DHA；所述抗氧化剂包括辅酶Q10、绿原酸。