CN103981255A - 一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQIDNO.1～12。本发明为LHON临床诊断提供快速、准确、廉价的基因水平检测手段，可实现LHON的预防和早期及时诊断，能够发现高危人群，提高LHON的诊断率，进行有效的产前遗传咨询和婚前咨讯，提高人口素质，降低家庭和国家的医疗开支。

Description

一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒，用于Leber遗传性视神经病变的体外诊断。
背景技术
Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种以母系遗传为特征的线粒体遗传病，是迄今临床上最常见的遗传性视神经疾病之一。LHON临床主要表现为双眼急性或亚急性中心视力下降，也是目前青少年致盲的主要原因之一，严重威胁青少年健康。
尽管目前许多临床检查手段如眼底荧光血管造影(FFA)、视网膜电图(ERG)等，有助于LHON的辅助诊断；但对于遗传性的LHON病变早期，大部分患者无家族史或家族史不清，临床表现轻微如仅有视神经损害，使得其早期临床诊断及治疗十分困难，这可能导致病情持续发展从而致盲，因此LHON的早期诊断尤为必要。
目前研究已经明确线粒体DNA(mtDNA)基因突变是LHON致病的主要分子机制，使得基因水平诊断成为LHON临床确诊的最直接手段。尽管目前已有部分基因分析方法在试图对LHON mtDNA突变进行了筛查分析，但由于费用昂贵、手续复杂、耗时长、漏诊率高等因素，限制了其在临床推广使用。
因此有必要开展一些新的基因诊断技术，并将其用于搭建LHON基因诊断检测平台，为LHON临床早期临床诊治提供重要依据；更重要的是对发现高危人群，进行有效的产前遗传咨询及诊断、婚前筛查，在提高人口素质方面具有极其重要的社会意义；而且可减少家庭和国家的医疗负担，具有重大的经济应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，能够一次鉴定正常与突变的DNA，以及其突变是纯合子或杂合子。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID NO.1～12。SEQID NO.1～4，SEQ ID NO.5～8，SEQ ID NO.9～12分别针对Leber遗传性视神经病变(LHON)致病相关的三个原发突变位点G3460A(ND1)、G11778A(ND4)与T14484C(ND6)，针对每一个突变位点分别采用四条引物-两条外引物和两条内引物，两条外引物扩增的片段作为PCR体系的内对照，排除体系自身原因造成的误诊，两条内引物分别反向扩增突变及正常的等位基因，能够一次鉴定正常与突变的DNA，以及其突变是纯合子或杂合子。
本发明试剂盒的诊断原理如图1所示，P1和P2为扩增含有突变点基因片段的外引物，S1和S2为两条特异性引物即内引物，分别与DNA双链的两条单链互补，其3’端正好与SNP位点重合，由引物的3’端控制着引物的延伸反应，根据延伸产物的长度确定SNP类型，并通过在引物的3’端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。野生型(W)基因只能与相匹配的特异性引物S2发生延伸反应。特异性引物S1由于其3’末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应，因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和P1S2；同理，突变型(M)基因仅与其配对的特异性引物S1发生延伸反应，特异性引物S2由于其3’末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应.因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和S1P2。
上述Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3：SEQ ID NO.4＝10：10：1：1，SEQ ID NO.5：SEQ ID NO.6：SEQ ID NO.7：SEQ ID NO.8＝20：20：1：1，SEQ ID NO.9：SEQ ID NO.10：SEQ ID NO.11：SEQ IDNO.12＝5：5：1：1，以摩尔比计。本试剂盒特定调整外引物与内引物用量，其效果在于有效的平衡外侧与内侧PCR产物扩增效率，提高结果的特异性，便于扩增结果的准确判读。
为了更简单方便的得到更清晰易辨的检测结果，上述Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒的使用方法是将引物SEQ ID NO.1～4、SEQ ID NO.5～8或SEQID NO.9～12分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95℃保温10min，然后按95℃30s、65℃或55℃30s、72℃30s的条件进行35个循环，在72℃保温10min进行成像或测序检测。
有益效果
1.使用本发明的试剂盒，可直接通过PCR扩增条带的长度，一次性鉴定Leber遗传性视神经病变正常与突变的DNA以及其突变是纯合子或杂合子。
2.本发明排除了多引物使用时对检测结果的交叉影响，特异性强，无假阳性、无杂带产生，准确率高，阳性检出率可达到95％以上。
3.本发明可进行三个单管PCR同时扩增，一次电泳得到检测结果，所需仪器简单，具有操作简单、观察简单、耗费低廉、检测快速而准确的优势，适合临床推广普及，产业化应用。
4.本发明为LHON临床诊断提供快速、准确、廉价的基因水平检测手段，可实现LHON的预防和早期及时诊断，能够发现高危人群，提高LHON的诊断率，进行有效的产前遗传咨询和婚前咨讯，提高人口素质，降低家庭和国家的医疗开支。
附图说明
图1本发明试剂盒的诊断Leber遗传性视神经病变的原理；
图2实施例1①PCR扩增产物成像结果；
图3实施例1②PCR扩增产物成像结果；
图4实施例1③PCR扩增产物成像结果；
图5为实施例1①m.11778G>A位点无突变的测序图局部；
图6为实施例1①m.11778G>A位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A；
图7为实施例1①m.11778G>A位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A；
图8为实施例1②14484T>C位点无突变的测序图局部
图9为实施例1②m.14484T>C位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为T突变为C
图10为实施例1②m.14484T>C位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为T突变为C
图11为为实施例1③m.3460G>A位点无突变的测序图局部
图12为实施例1③m.3460G>A位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A；
图13为为实施例1③m.3460G>A位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
1.样本：人全血提取的DNA(50～100ng/ul)。样本1和2为正常对照，是指扩增模板来源于来源于无下述三个突变的正常人血DNA；样本3和4为纯合突变体，是指扩增模板来源于三个位点的阳性参考品质粒DNA，阳性参考品质粒为m.11778G>A；m.14484T>C；m.3460G>A三位点的人工突变片段质粒；样本5和6为杂合突变，是指扩增模板来源于阳性参考品质粒与无突变的正常人血DNA混合模版。
2.试剂：Hot Start Green Master Mix，2×：包含2×Green Go TaqReaction Buffer(pH8.5)、400μM dATP、400μM GATP、400μM dCTP、400μM dTTP、4mM MgCl2、Nuclease-Free Water、DNA聚合酶。
3.T-ARMS-PCR反应体系及扩增程序
①采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图2所示。
外引物：P1：GCCTACCCCTTCCTTGTACTATCCCTATG
P2：TTAATAGTGGGGGGTAAGGCGAGGTT
内引物：S1：CAAACTACGAACGCACTCACAGGCA
S2：TTGAAGTCCTTGAGAGAGGATTATGAGGC
反应体系
PCR扩增程序
②采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图3所示。
外引物：P1：ACCCCTCTCCTTCATAAATTATTCAGCTT
P2：GTGGTCGGGTGTGTTATTATTCTGAATT
内引物：S1：CATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACAAT
S2：AATAGTTTTTTTAATTTATTTAGGGGGAAGGG
反应体系
PCR扩增程序
③采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图4所示。
外引物：P1：AGTATTATACCCACACCCACCCAAGAACA
P2：GATTGAGTAAACGGCTAGGCTAGAGGTG
内引物：S1：GCTACTACAACCCTTCGCTGCCA
S2：GGGCTCTTTGGTGAAGAGTTTTATTGC
反应体系
PCR扩增程序
4.用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
制备2.5％琼脂糖凝胶(含Go1dview)后，各取7ul PCR产物点样。稳压120V，35min，条件下电泳，完毕后在凝胶成像仪中观察结果并照相。
5.实验结果
①m.11778G>A位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出350bp、276bp两条带，m.11778G>A位点纯合突变的标本扩增出350bp、127bp两条带，杂合突变的标本扩增出350bp、276bp、127bp三条带，如图2所示。(M为500bp DNALadder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
②m.14484T>C位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出286bp、111bp两条带，m.14484T>C位点纯合突变的标本扩增出286bp、236bp两条带，杂合突变的标本扩增出286bp、236bp、111bp三条带，如图3所示(M为500bp DNA Ladder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
③m.3460G>A位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出460bp、292bp两条带，m.3460G>A位点纯合突变的标本扩增出460bp、217bp两条带，杂合突变的标本扩增出460bp、276bp、217bp三条带，如图4所示(M为1000bp DNALadder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医学大学附属儿童医院，黄轶
<120>一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒
<160>  <210> 1  <211> 29 <212> <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 1
gcctacccct tccttgtact atccctatg                                          29
 
 
<210> 2  <211> 26  <212>
<213> Artificial(人工序列)
 
<400> 2
ttaatagtgg ggggtaaggc gaggtt                                             26
 
<210> 3  <211> 25 <212> <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 3
caaactacga acgcactcac aggca                                              25
 
<210> 4  <211>  29  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 4
ttgaagtcct tgagagagga ttatgaggc                                          29
 
<210> 5  <211>  29  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 5
acccctctcc ttcataaatt attcagctt                                          29
 
<210>6 <211>  28  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 6
gtggtcgggt gtgttattat tctgaatt                                           28
 
<210>7 <211>   30  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 7
catcgctgta gtatatccaa agacaacaat                                         30
 
<210>8 <211> 32  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 8
aatagttttt ttaatttatt tagggggaag gg                                      32
 
<210>9 <211> 29  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 9
agtattatac ccacacccac ccaagaaca                                          29
 
<210>10 <211> 28  <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 10
gattgagtaa acggctaggc tagaggtg                                           28
 
<210>11 <211>  23 <212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 11
gctactacaa cccttcgctg cca                                                23
 
<210>12 <211>  27
<212>  <213> Artificial(人工序列)
 
<400> 12
gggctctttg gtgaagagtt ttattgc                                            27

Claims (3)

1.一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID NO.1～12。
2.如权利要求1所述的Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3：SEQ ID NO.4=10:10:1:1，SEQ ID NO.5：SEQ ID NO.6：SEQ ID NO.7：SEQ ID NO.8=20:20:1:1，SEQ ID NO.9：SEQ ID NO.10：SEQ ID NO.11：SEQ ID NO.12=5:5:1:1，以摩尔比计。
3.如权利要求1或2所述Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒的使用方法，将引物SEQ ID NO.1～4、SEQ ID NO.5～8或SEQ ID NO.9～12分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP、 MgCl2混合后在95℃保温10min，然后按95℃30s、65℃或55℃30s、72℃30s的条件进行PCR扩增35个循环，在72℃保温10min进行成像或测序检测。
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