CN103981129A - 一种复合微生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合微生物制剂及其制备方法和应用，该微生物制剂中含有屎肠球菌SC13，CCTCC NO：M2014060和马克思克鲁维酵母C2，CCTCC NO：M2014059，为发明人自行分离获得，将其与解淀粉芽胞杆菌、菊芋粉及食品级硅藻土复配后，通过菌剂之间及菌剂和填料之间的相互协同作用，不仅具有强化动物免疫系统，选择性促进动物肠道有益菌增殖，抑制有害菌的定殖和繁育，改善动物内微生物环境，刺激机体免疫应答，增强畜禽免疫力、提高畜禽生产性能，减少抗生素使用，对饲料霉菌毒素有很好的识别粘附和消除能力，提高饲料转化率的功能。

Description

一种复合微生物制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种微生物复合制剂，具体涉及一种用于畜禽防腹泻和脱毒的微生物复合制剂及其制备方法，属于微生态制剂及饲料添加剂技术领域。

背景技术

体内毒素积累和腹泻是导致畜禽死亡率高和养殖报酬率低的两大重要原因。世界上每次年大约有25％谷物遭受各种霉菌污染，因污染程度不同，不同地区差距很大，中国是霉菌毒素的重灾区。中国动保协会调查，在养殖过程中，经常遇到育肥猪生长速度缓慢、母猪假发情、哺乳仔猪拉稀、蛋鸡产蛋率下降、奶质不符合要求等这一系列的问题，都和我们所用的饲料原料有关，究其原因，主要是霉菌毒素惹的祸。另外，近年来，随着养殖规模的不断扩大，养殖环境日趋恶化，仔猪腹泻性疾病呈多发和频发态势。仔猪腹泻可导致仔猪成活率下降、生长发育受阻和饲料报酬降低，严重威胁着养猪业的健康发展。这两类类因素间的关系十分密切，在生产实践中常表现为多因素相互作用的结果，霉毒素损害机体的免疫系统和脏腑功能，导致动物容易感染疾病，发病率上升，而腹泻又导致肠道损伤，使毒素更易侵染，常呈多重感染或交叉混合感染，造成临床诊断与防制的困难，从而导致养殖大量死亡，使养殖户(场)蒙受巨大损失。口服抗生素已被广泛用于畜禽保健及防病、治病，然而普遍存在的滥用现象，造成的药物残留、细菌抗药性增强及仔猪自身免疫力下降等问题，已引起业界人士的高度重视。此外，抗生素的滥用还使得许多养殖场出现有病无药可医的情况。微生态制剂作为一种安全和高效的新型饲料添加剂，已逐渐得到广大养殖界同仁的首肯，且因其辅助防制疾病、增强机体免疫力、促进生长、绿色安全、无毒不良反应和无残留等优点正逐步替代抗生素类添加剂。

目前，市场上的饲用微生态制剂产品较多，作用效果主要集中在提供动物免疫力、增加动物生产能力等方面，能直接用于动物体内毒素清除兼具防治腹泻疾病的功能性用途的产品却鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合微生物制剂，该生物制剂具有清除出清体内毒素，兼具防治腹泻的功能。

本发明的另一目的是一种复合微生物制剂的制备方法，方法简便，易行，适于大规模生产。

本发明最后一个目的在于提供了一种复合微生物制剂在制备防腹泻和脱毒饲料添加剂中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

一种复合微生物制剂，它由以下组分按重量百分比混合而成：

所述的马克思克鲁维酵母为马克思克鲁维酵母C2kluyeromyces marxianus C2，CCTCCNO：M2014059，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏时间：2014年3月3日。

所述的菊芋粉和食品级硅藻土为市售的食品级原料。

优选的，以上所述的复合微生物制剂其按重量百分比的组成为：解淀粉芽胞杆菌菌粉30％，屎肠球菌菌粉30％，马克思克鲁维酵母20％，菊芋粉10％，食品级硅藻土10％。

优选的，解淀粉芽胞杆菌为：解淀粉芽胞杆菌H6，保藏编号为CCTCC NO：M2013249；

优选的，屎肠球菌为：屎肠球菌SC13，保藏编号为CCTCC NO：M2014060。

优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌，屎肠球菌和马克思克鲁维酵母均为菌粉，活菌数在1×10¹⁰CFU/g以上。

如上所述复合微生物制剂的制备方法，可购买市售的商品化菌粉及原料混合而成，或通过常规的发酵方法发酵后混合制成。

如上所述的复合微生物制剂的在制备防腹泻和脱毒饲料添加剂中的应用，包括将该复合微生物制剂以1-10‰添加进饲料。

本发明中所用的解淀粉芽胞杆菌(CCTCC NO.M2013249)具有对革兰氏阳性和阴性治病菌良好的生长抑制作用，并且具有很强的淀粉、蛋白及纤维素降解能力，环境耐受性强；.(申请号：201310240706.0)。

本发明中所用的屎肠球菌具有较强的产酸能力，屎肠球菌的加入，不仅可以创造微酸性环境，增强复合菌的稳定性，还可赋予饲料优良的感官性质，在增强动物肠道抵抗力，预防和治疗腹泻，提升饲料安全性方面有着良好的益生功效，另外该菌有突出的耐高温、低pH、耐干燥处理特性。为申请人从湖北黄陂某自然养殖土猪场采集健康猪新鲜粪便中分离、筛选、鉴定得到，并于2014年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M2014060，地址：中国武汉武汉大学，分类命名：屎肠球菌(Enterococcus faecium)SC13。

本发明中所用的马克思克鲁维酵母(CCTCC NO：M2014059)具有能降解去黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的功能，其单独作用时，黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A霉菌毒素生物降解率均达到80％以上。另外该菌有很强的菊芋粉降解活性，将菊芋粉中的高聚多糖降解成具有肠道保健功能的低聚多糖，促进肠道有益菌的增殖。

本发明中所用的食品级硅藻土，PH值中性、无毒，具有独特的孔隙结构，体重轻软，孔隙度大，吸附性能强，形成色泽浅淡柔和，拦入饲料中能均匀分散，并与饲料颗粒粘结混合，不易分离析出，畜禽食后促使消化，并能把畜禽肠胃道的有害毒素吸附后排出体外。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的微生态制剂有解淀粉芽胞杆菌、屎肠球菌、马克思克鲁维酵母粉剂及菊芋粉及食品级硅藻土复配而成，通过跟菌剂之间及菌剂和填料之间的相互协同作用，不仅具有强化动物免疫系统，选择性促进动物肠道有益菌增殖，抑制有害菌的定殖和繁育，改善动物内微生物环境，刺激机体免疫应答，增强畜禽免疫力、提高畜禽生产性能，减少抗生素使用，对饲料霉菌毒素有很好的识别粘附和消除能力，提高饲料转化率的功能；同时又可作为一种饲料防霉剂；还具有天尽量少，制备工艺简单，无副作用，无残留等优点，具有较高的市场价值。

具体实施方式

本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

屎肠球菌SC13的分离鉴定：

申请人从湖北黄陂某自然养殖土猪场采集健康猪新鲜粪便中分离、筛选、鉴定得到，并于2014年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014060。

该菌株为革兰氏染色阳性，卵圆形细胞、主要成对，偶尔成短链，能在10℃和45℃生长，发酵葡萄糖产酸最终pH为4.0～4.4，可生长于6.5％NaCl和pH9.6环境中，过氧化酶阴性，能分解蔗糖、密二糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、阿拉伯糖和山梨醇，分解精氨酸产氨，胆汁-七叶苷水解实验未阳性，不分解鼠李糖、松三糖，在基础合成培养基上生长需要叶酸，参照伯杰氏细菌手册(第八版)该菌符合屎肠球菌的生理生化特征。将其16SrRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blast比较，确定SC13为屎肠球菌。

屎肠球菌SC13在MRSB培养基中培养22小时pH最低达到4.0，菌体离心后做耐热、耐人工胃液、耐干燥等抗逆性测试，得出该菌可以在70℃热处理、pH2.5模拟胃酸及室温3个月储存条件下仍有80％以上的存活率。

屎肠球菌SC13离心菌体用0.9％生理盐水洗涤重新悬浮(活均量5×l0⁸cfu/ml)于60、65、70、75、80℃水浴中处理15min后，迅速流水冷却，然后采用稀释平板法测定处理前后活菌量，计算存活率。

表1SC13菌株在不同温度处理下的存活率

温度(℃)	60	65	70	75	80
						存活率(％)	91.3	86.7	80.5	64.8	39.0

取质量分数为10％的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值为2.5，每100mL盐酸溶液中加1g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，得到人工胃液。屎肠球菌SC13离心菌体用0.9％生理盐水洗涤重新悬浮后(活均量5×l0⁸cfu/ml)，按1：9(v/v)加入到人工胃液中，震荡混匀，37℃水浴孵育，每隔0.5h取样进行活菌计数，计算存活率。

表2SC13菌株在模拟胃酸条件下处理活菌量变化

处理时间(h)	0.5	1	2	3
					存活率(％)	97.4	90.8	83.2	77.6

屎肠球菌SC13离心菌体用0.9％生理盐水洗涤重新悬浮后(活均量1×l0¹¹cfu/ml)，按1：9(v/w)加入食品级硅藻土填料中，混合混匀，60℃烘干至含水率低于5％，于室温密封储存4个月，每月取样测定活菌量，计数存活率。

表3SC13菌株干燥后在室温下储存的存活率

存储时间(d)	30	60	180	240
					存活率(％)	91.5	85.2	80.9	70.7

马克思克鲁维酵母C2的分离鉴定：

从湖北黄陂自然养殖土猪场采集健康猪新鲜粪便及猪场周边菜地和水沟土壤的样品中分离、筛选鉴定得到，通过生理生化及26s鉴定，最终确定C2为一株马克思克鲁维酵母，命名马克思克鲁维酵母(kluyeromyces marxianus)C2(以下简称C2菌株)，该细菌已于2014年3月3日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：马克思克鲁维酵母C2kluyeromyces marxianus C2，保藏号为CCTCC NO：M2014059，地址中国武汉武汉大学。

C2菌株具体有典型的马克思克鲁维酵母生理生化特征：该菌株在麦芽汁琼脂平板上繁殖生长形成的菌落圆形，边缘全缘，脐状突起，乳白色，光滑湿润，直径4～6mm，通过镜检观察，细胞形态呈卵圆或椭圆形，两端出芽生殖。在生孢子培养基上，有子囊孢子形成。不形成假菌丝。在生理生化特征为：发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、棉籽糖等，不发酵可溶性淀粉、L-鼠李糖和海藻糖等。不同化硝酸钾，可同化盐酸乙胺和盐酸尸胺，在无维生素培养基上不能生长，在含100mg/L放线菌酮的培养基上生长良好。适宜生长温度35℃左右。

所述的马克思克鲁维酵母(CCTCC NO：M2014059)具有能降解去黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的功能，其单独作用时，黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A霉菌毒素生物降解率均达到80％以上，具体如下：

配制6000ng/ml的黄曲霉毒素无菌溶液，按1:9(v/v)比例加入以下三种试液中,A为按10⁶cfu/ml接种马克思克鲁维酵母C2后的YPD新鲜培养液，B为按10⁶cfu/ml接种马克思克鲁维酵母C2培养30h后的YPD发酵液，C为未接种马克思克鲁维酵母C2的YPD培养基，将以上溶液放入37度摇床，震荡60h后，用均质机均质破碎，甲醇浸提后待测。检测方法：免疫亲和层析净化高效液相色谱法，结果见表4,马克思克鲁维酵母C2可以在含黄曲霉毒素B1的培养基中生长，并可以代谢法分解黄曲霉毒素B1。

表4C2菌对黄曲霉毒素B1的降解率

样品	毒素浓度(ng/ml)	降解率
			对照C	580	/
样品A	89	84.6％
			样品B	68	88.3％

配制含500ng/ml玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素的YPD培养基溶液，灭菌处理后按10⁶cfu/ml接种马克思克鲁维酵母C2，以未接菌溶液为对照，将以上溶液放入37度摇床，震荡60h后，用均质机均质破碎，乙腈浸提后用免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定毒素浓度，计算降解率，结果见表5,马克思克鲁维酵母C2菌对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A也有很好的降解效果。

表5C2菌对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的降解率

毒素种类	对照液浓度ng/ml	实验组浓度ng/ml	降解率
				玉米赤霉烯酮	516	102	80.2％
赭曲霉毒素A	508	90	82.3％

实施例2：

一种用于畜禽的复合微生物制剂，其制备步骤如下：

解淀粉芽胞杆菌菌粉的制备：解淀粉芽胞杆菌(CCTCC NO：M2013249)接种于自配发酵培养基中，30℃通气搅拌发酵44h，实时消泡和控制溶氧在30％以上，至芽孢形成率达到75％。放罐后经陶瓷膜微滤，在压力0.2MPa浓缩至原体积1/5体积，进干燥塔，在165℃～175℃进风、60℃～70℃出风喷雾干燥塔内喷雾干燥而成得到解淀粉芽孢杆菌菌粉，活菌数在2×10¹⁰CFU/g，用于以下实施例；

发酵培养基组分/L：玉米粉20g/L、豆粕粉10～50g/L、酵母膏15g/L、蛋白胨10g/L、CaCO₃2.5g/L、NaCl5g/L、MgSO₄3g/L、KH₂PO₄5g/L、聚醚2ml，在线补加硅油消泡剂。

屎肠球菌的制备：屎肠球菌(CCTCC NO：M2014060)接种于自配发酵培养基中，38℃通气搅拌发酵28h，放罐后经陶瓷膜微滤，在压力0.2MPa浓缩至原体积1/8体积，按质量体积比加入3:1的硅藻土填料搅拌均匀，65℃热风烘干至含水率低于7％，得到屎肠球菌菌粉，活菌数在2×10¹⁰CFU/g，用于以下实施例。

发酵培养基组分：蛋白胨15g/L、酵母膏15g/L、蔗糖25g/L，MgSO₄3g/L。

马克思克鲁维酵母粉剂的制备：马克思克鲁维酵母(CCTCC NO：M2014059)接种于自配发酵培养基中，30℃通气搅拌发酵32h，至溶解氧DO值自然回升至85％，放罐后经陶瓷膜微滤，在压力0.2MPa浓缩至原体积1/5体积，按质量体积比加入1:1的菊芋粉，混合均匀37℃下降解24h后，45℃下造粒干燥而成，活菌量在2×10¹⁰CFU/ml，用于以下实施例。

自配发酵培养基配方：菊芋粉20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、MgSO₄3g/L、K₂HPO₄5g/L、聚醚2ml/L，在线补加硅油消泡剂。

菊芋粉和食品级硅藻土为市售的食品级原料。

按重量配比称取各成分原料，配比如下：解淀粉芽胞杆菌菌粉30％，屎肠球菌菌粉30％，马克思克鲁维酵母20％，菊芋粉10％，食品级硅藻土10％。将原料放入混合机中，其中，混合机优选混合均匀度变异系数小于5％的双轴桨叶式高效混合机，混合均匀，即得，用于以下实施例。

实施例3：

一种用于畜禽的复合微生物制剂在制备治疗腹泻药物中的应用，其应用过程如下：

从黄陂某腹泻发病猪场，选用240头平均体重为7.44±0.25kg的大白×长白二元杂交26日龄断奶仔猪，随机分为3组，每组80头猪，分组时遵循每组性别一致，分别喂饲喂基础日粮(空白对照组)，基础日粮+0.05％(w/w)的实施例2制备的饲料添加剂(实验组1)，基础日粮+0.2％(w/w)的实施例2制备的饲料添加剂，试验期为28天。试验开始和结束时称量仔猪个体空腹质量，计算平均日增重(ADG)，给料量，计算料增质量比(F/G)，腹泻率及死亡率。

从表6中可以看出试验期间试验组一比对照组平均多增重0.98kg，增重方面提高11.15％，料肉比下降6.88％，腹泻率降低23.8％，死亡率降低42.8％；试验组二比对照组平均多增重1.55kg，增重方面提高17.63％，料肉比下降9.38％，而腹泻率降低70.3％，试验期内死亡率降低100％。

表6：复合菌脱毒对仔猪腹泻及生长性能改善

项目	对照组	试验组一	试验组二
				平均初始重(kg)	7.72	7.34	7.27
平均末重(kg)	16.51	17.11	17.61
				平均增重(kg)	8.79	9.77	10.34
平均日增重(g)	314	349	369
				平均日采食量(g)	502	520	536
料肉比	1.60	1.49	1.45
				腹泻率	21.2％	16.3％	6.3％
死亡率	8.8％	5％	0

实施例4：

一种用于畜禽的复合微生物制剂在制备治疗霉菌中毒饲喂中的应用，其应用过程如下：

选择湖北黄陂某养殖猪场，该猪场母猪粪便和送检死胎中检测到有霉菌毒素，从该猪场挑选经产仔长白母猪30，已经配种怀孕，随机分成3组,其中一组饲喂常用饲料(对照组)，一组在常用饲料中添加0.1％(w/w)市售复合脱酶剂(试验组一)(主要成分为酵母细胞壁多糖，蒙脱石和中草药提取物)，另一组在常用饲料中添加0.1％(w/w)实施例2制备的饲料添加剂(实验组二),观察两组母猪从配种开始到产仔后断奶饲喂饲料期间所产仔猪数量与质量。结果几乎对照组中所有窝组都有弱仔和死亡,并且仔猪通常吮乳能力下降,甚至没有找奶头的欲望,在母猪食用含有脱霉剂和本发明复合菌剂的饲料后,所产仔猪的弱仔数和死亡数相对降低，而初生重和断奶重相对提高，详见表7。

表7：复合菌脱毒对母猪繁殖性能改善

实施例5：

一种用于畜禽的复合微生物制剂在制备治疗霉菌中毒饲喂中的应用，其应用过程如下：

将大小和健康状况基本相同的180只AA肉仔鸡随机分成3组，每组设3个重复，每个重复20只，其中一组饲喂正常玉米饲料(对照组)，一组饲喂霉变玉米饲料(实验组一)，另一组在霉变玉米饲料中添加0.3％(w/w)实施例2制备的饲料添加剂(实验组二)，试验期为21天，实验结束后，各组每个重复随机剖杀3只鸡，测定肠道大肠杆菌数，法氏囊指数，红细胞免疫功能(E-C_3bR和E-ICR)，结果见表8，可见复合菌能明显抑制鸡肠道致病菌的生长和促进鸡免疫器官的发育，提升免疫能力，解除霉菌毒素对鸡的毒害。

表8复合菌对鸡肠道和免疫功能的影响

Claims (8)

1.一种分离的菌株，其特征在于：屎肠球菌（Enterococcus faecium ）SC13，CCTCC NO：M 2014060。

2.一种复合微生物制剂，其配方如下：

组分                      重量百分比

解淀粉芽胞杆菌           30-50%

屎肠球菌                     20-40%

马克思克鲁维酵母C2    10-20%

菊芋粉                        1%-10%

食品级硅藻土               1%-10%；

所述的马克思克鲁维酵母C2为马克思克鲁维酵母C2 kluyeromyces marxianus C2，CCTCC NO：M 2014059。

3.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其按重量百分比的组成为：解淀粉芽胞杆菌菌粉30%，屎肠球菌菌粉30%，马克思克鲁维酵母菌粉20%，菊芋粉10%，食品级硅藻土10%。

4.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于：所述的屎肠球菌为屎肠球菌（Enterococcus faecium ）SC13，CCTCC NO：M 2014060。

5.权利要求3所述的复合微生物制剂在制备防腹泻饲料添加剂中的应用。

6.权利要求3所述的复合微生物制剂在制备脱毒饲料添加剂中的应用。

7.权利要求3所述的复合微生物制剂在制备同时防腹泻和脱毒的饲料添加剂中的应用。

8.权利要求3所述的复合微生物制剂在制备提高动物免疫力饲料添加剂中的应用。