CN103958690B - 控制在由合成气制备乙醇中由污染性有机体导致的不希望的副产物形成的方法 - Google Patents

控制在由合成气制备乙醇中由污染性有机体导致的不希望的副产物形成的方法 Download PDF

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Abstract

操作发酵区以由合成气制备乙醇的方法使用巴豆酸酯类化合物以防止或逆转产丁酸污染作用。巴豆酸酯类化合物在连续发酵方法中用于降低或消除合成气衍生的乙醇产物中的丁酸酯和丁醇污染。

Description

控制在由合成气制备乙醇中由污染性有机体导致的不希望的 副产物形成的方法
技术领域
本发明涉及通过在发酵系统中与微生物接触将气体基质料流中的氢气和一氧化碳低能、厌氧生物转化成氧合C2化合物如乙醇的方法，氢气和一氧化碳的转化效率都高。本发明方法降低了由发酵系统中的细菌污染产生的不希望的副产物如丁酸、丁醇和其它更长链有机酸或醇的产生。
发明背景
用作液体发动机燃料的生物乙醇生产在世界范围内日益提高。这类生物燃料包括例如可与具有宽组成范围的汽油混合的乙醇。生物乙醇的主要驱动之一是它通过发酵和生物方法技术衍生自可再生资源。通常，生物燃料由容易发酵的碳水化合物如糖和淀粉制备。例如，用于常规生物乙醇生产的两种主要农作物为甘蔗(巴西和其他热带国家)和玉米(corn)或玉米(maize)(美国和其他温带国家)。由于与食品和饲料生产竞争、耕地使用、水可得性和其他因素，提供易发酵碳水化合物的农业原料的可得性有限。因此，木质纤维素原料如林业余料、种植园树木、稻草、禾草和其他农业余料可被视为生物燃料生产的原料。不同于化石燃料的使用，由这类植物或甚至城市废物来源得到生物乙醇提供了对液体燃料的生产而言环境上可许可的资源。
生产生物乙醇的高效路线为生物质或其它有机物质气化成包含CO和/或氢气的基质气体，其后使用同型产乙酸(homoacetogenic)微生物将气体转化成乙醇。这类转化方法由US7,285,402B2、US20110059499A1、US20090215163A1及其它中已知。
通常，用于一氧化碳或氢气转化的基质气体衍生自合成气体(合成气)，所述合成气来自于含碳材料气化、天然气重整，和/或衍生自来自于厌氧发酵罐或来自各种工业方法的排出物流的生物气体。气体基质包含一氧化碳、氢气和二氧化碳，且通常包含其它组分如水蒸气、氮气、甲烷、氨、硫化氢等。(就本文而言，除非另外指出或者上下文明示，所有气体组合物基于干燥报告。)
通过这些方法由基质气体制备乙醇需要显著量的氢气和一氧化碳。例如，一氧化碳和氢气转化成乙醇的理论公式为：
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
6H2+2CO2→C2H5OH+3H2O
可以看出，一氧化碳的转化导致产生二氧化碳。氢气的转化涉及氢气和二氧化碳的消耗，该转化有时称为H2/CO2转化。就本文而言，它称为氢气转化。
合成气发酵方法的问题是气体基质，即一氧化碳和氢气，在发酵溶媒的液相中的溶解度差。Munasinghe等人在Biomass-derived Syngas Fermentation in Biofuels：Opportunities and Challenges，Biosource Technology,101(2010)5013-5022中，总结了在各种反应器构造和流体动力条件下，文献中报告的用于合成气和一氧化碳的发酵介质的体积传质系数。因此，制备乙醇的生物发酵方法需要大体积的发酵液。例如，商业规模装置，具有55,000,000加仑或更大的生产能力的那些装置需要使用容纳百万加仑或更多发酵液的容器的发酵区。此外，发酵方法需要以连续方式操作延长的时间。
为保持由这类发酵区制备乙醇的效率，需要使C2氧合产物的产生最大化，同时使较高碳链产物如C4、C6、C8和较高有机酸或醇的产生最小化。已知方法设法通过使用对C2产物的产生具有非常高选择性的同型产乙酸细菌实现该效率。由于它们的性质，将气体基质转化成乙醇的同型产乙酸有机体不具有制备这些较长碳链产物的路径。
同型产乙酸有机体在厌氧条件下与最少的介质存活于CO和H2基质上的能力提供保护以对抗需要许多不同环境的许多生物污染物。然而，工业乙醇生产所需发酵区和总设备的尺寸和规模使设备的无菌操不可能。因此，微生物污染不可避免地在一些点发生并可能由于产生这类更高链副产物而使生产劣化，这又严重降低乙醇或其它理想产物的收率。
尽管存在许多潜在的污染物，一类常见的潜在污染物会产生丁酸、丁醇和其它更长链有机酸或醇。产生这类化合物作为其主要代谢物的一部分的微生物称为产丁酸菌(butyrogen)。存在许多类产丁酸菌。一个主要类别利用碳水化合物和其它碳化合物如氨基酸、类脂等。另一类产丁酸菌利用合成气，又一类产丁酸菌可以以转移酶路径利用乙醇和乙酸酯。因为先前所述原因，不可能无菌操作这种大规模发酵，因此所有这些产丁酸菌污染源都将存在。
当产丁酸菌污染保持在大规模发酵容器中时，它可通过使进料转化从所需产物偏移以及使产物回收不可行而破坏方法的工业可行性。针对液体化合物组成和浓度宽泛变化涉及产物回收设备会增加高的惊人的成本。大体积的发酵液和培养微生物至生产浓度也使设备的冲洗和再启动不可行。
相反，常规乙醇装置，例如玉米乙醇装置操作多个间歇式反应器，因此固有地限制了竞争性微生物可用于种群增加的时间。实际上，分批发酵的持续时间通常基于乙醇效价(titer)和不想要的高级醇的浓度。此外，发酵罐可在批料之间灭菌以消除不想要微生物的存在。
因此，寻求消除或抑制大规模发酵区中产丁酸菌生长而不破坏由该发酵区生产乙醇或其它产物如乙酸、丙醇或丙酸的方法。
发明内容
通过本发明，已找到一类特定巴豆酸酯类化合物抑制产丁酸菌种群生长，同时不过度破坏产生轻质氧合产物如乙醇、乙酸、丙醇和丙酸的同型产乙酸或异型产乙酸(heteroacetogenic)微生物的生产率。实现该发现要求确定这些化合物充当产丁酸菌的抑菌或杀菌剂，同时不过度抑制同型产乙酸菌的生长。无论化合物充当杀菌剂还是抑菌剂，它体内作用的能力对其在连续操作延长时间的大规模发酵区中保持生产所需产物的效力同样重要。已发现，被发现的这类化合物是体内有效的，因此用于抑制或阻滞发酵容器内的产丁酸菌污染，并可根据需要作为添加剂引入方法中。本发明的以杀菌或抑菌方式作用的这些巴豆酸酯类化合物在本文中称为丁基阻滞剂。
有效的巴豆酸酯类化合物可由以下结构式表示：
I.R2(R3)C＝C(H)C(O)R1
或
II.R2-A-C(O)R1
其中：
R1为-OH、-OR5或-N(R4)2，其中R5为烃基，优选具有1-6个碳，且各R4可相同或不同并且为氢或烃基，优选具有1-6个碳的烃基；
R2为氢、-NH2、-OH或-CX3，其中各X可相同或不同且为氢或卤素，优选全卤化，最优选全氟化；
R3为具有1-18个碳且可未被取代或被-OH、具有1至约6个碳的烷氧基或卤素取代的烃基，优选全卤化，最优选全氟化；
A为具有5或6个环原子的芳族结构部分，所述环原子可以都是碳原子，或者可以为具有一个选自氧和氮的杂原子的杂环，所述芳族结构部分具有在2位上的–R2，其中–R2如上文所定义，且所述芳族结构部分可未被取代或者在更高碳位(例如苯基结构部分的3-、4-、5-和6-位)中的一个或多个上被如下取代基取代：(i)具有1-18个碳且可被-OH、具有1至约6个碳的烷氧基或卤素取代的烃基，(ii)-OR6，其中R6为低级烷基，或(iii)–N(R7)2，其中各R7为相同或不同的且为氢或烃基，优选具有1-6个碳的烃基，或(iv)卤素，优选氟；
条件是在结构式I中，R2和R3中的至少一个，优选两个为卤代烷基或者被卤代烷基取代，且在式II中，芳基结构部分的至少2或3碳位被选自卤素和卤代烷基的吸电子基团取代。烃基优选为烷基，最优选线性或支化烷基。
优选的巴豆酸酯类化合物可由以下结构式表示：
III.R2(R3)C＝C(H)C(O)R1
或
IV.R2-A-C(O)R1
其中在式III中，R2为–OH、-NH2或–CX3，其中X为卤素，优选氟，且R3为–CX3，其中X为卤素，优选氟，且
在式IV中，芳基为苯基，且苯基结构部分的2和3位碳中的至少一个为–CX3，其中X为卤素，优选氟。
不意欲限制，这些优选的巴豆酸酯类化合物不仅具有类似的空间构型，而且与巴豆酸酯阴离子的碳的电子密度相比，具有在式I的3位碳上以及芳基结构部分的2位上降低的电子密度。卤代取代基为吸电子的。给电子取代基如胺、羟基或烷氧基的存在可缓和吸电子取代基的作用。因此，在其中存在给电子取代基的优选实施方案中，使用强吸电子结构部分如全氟烷基。
一类巴豆酸酯类化合物为二卤素取代的巴豆酸酯化合物(具有两个末端全卤化甲基的巴豆酸酯)。二卤素取代的巴豆酸酯化合物包括酸、酰胺和酯。代表性化合物包括4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸；4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三氟-3-(三氯甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氟-3-(三氯甲基)巴豆酸；4,4,4-三氟-3-(三氯甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三氯-3-(三氟甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氯-3-(三氟甲基)巴豆酸；4,4,4-三氯-3-(三氟甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三氯-3-(三氯甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氯-3-(三氯甲基)巴豆酸；4,4,4-三氯-3-(三氯甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三溴-3-(三氟甲基)巴豆酸；4,4,4-三溴-3-(三氟甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三溴-3-(三氟甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氟-3-(三溴甲基)巴豆酸；4,4,4-三氟-3-(三溴甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三氯-3-(三溴甲基)巴豆酸；4,4,4-三氯-3-(三溴甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三碘-3-(三氟甲基)巴豆酸；4,4,4-三碘-3-(三氟甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三碘-3-(三氯甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氟-3-(三碘甲基)巴豆酸；4,4,4-三氟-3-(三碘甲基)巴豆酰胺；4,4,4-三氯-3-(三碘甲基)巴豆酸和4,4,4-三氯-3-(三碘甲基)巴豆酰胺，其中烷基为低级烷基，优选具有1-4个碳，优选乙基。
另一类巴豆酸酯类化合物为含苯基化合物，包括但不限于，2-三氟甲基苯甲酸；2-三氟甲基苯甲酰胺；2-三氟甲基苯甲酸烷基酯；3-三氟甲基苯甲酸；3-三氟甲基苯甲酰胺；3-三氟甲基苯甲酸烷基酯；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酸；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酰胺；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酸烷基酯；3-三氟-4-甲氧基苯甲酸；3-三氟-4-甲氧基苯甲酰胺；3-三氟-4-甲氧基苯甲酸烷基酯；3-三氟甲基-4-氟苯甲酸；3-三氟甲基-4-氟苯甲酰胺；3-三氟甲基-4-氟苯甲酸烷基酯；3-三氟甲基-5-三氟甲基苯甲酸；3-三氟甲基-5-三氟甲基苯甲酰胺；3-三氟甲基-5-三氟甲基苯甲酸烷基酯；2-三氯甲基苯甲酸；2-三氯甲基苯甲酰胺；2-三氯甲基苯甲酸烷基酯；3-三氯甲基苯甲酸；3-三氯甲基苯甲酰胺；3-三氯甲基苯甲酸烷基酯；2-氨基-3-三氯甲基苯甲酸；2-氨基-3-三氯甲基苯甲酰胺；2-氨基-3-三氯甲基苯甲酸烷基酯；3-三氯-4-甲氧基苯甲酸；3-三氯-4-甲氧基苯甲酰胺；3-三氯-4-甲氧基苯甲酸烷基酯；3-三氯甲基-4-氯苯甲酸；3-三氯甲基-4-氯苯甲酰胺；3-三氯甲基-4-氯苯甲酸烷基酯；3-三氯甲基-5-三氯甲基苯甲酸；3-三氯甲基-5-三氯甲基苯甲酰胺；和3-三氯甲基-5-三氯甲基苯甲酸烷基酯，其中烷基为低级烷基，优选具有1-4个碳，优选乙基。
另一类巴豆酸酯类化合物为3-氨基取代的巴豆酸酯，例如4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸；4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酰胺；4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氯-3-氨基巴豆酸；4,4,4-三氯-3-氨基巴豆酰胺；4,4,4-三氯-3-氨基巴豆酸烷基酯；4,4,4-三溴-3-氨基巴豆酸；4,4,4-三溴-3-氨基巴豆酰胺；4,4,4-三溴-3-氨基巴豆酸烷基酯；4,4,4-三碘-3-氨基巴豆酸；4,4,4-三碘-3-氨基巴豆酰胺；和4,4,4-三碘-3-氨基巴豆酸烷基酯，其中烷基为低级烷基，优选具有1-4个碳，优选乙基。
巴豆酸酯类化合物的作用随着它们的浓度而变化。根据本发明，巴豆酸酯类化合物在发酵方法中以低至50质量ppm的纯化合物浓度有效用于抑制产丁酸菌的生长。有效浓度可随着使用输送体系和试剂而显著降低，所述输送体系和试剂改进在包含微生物的介质中的分布并改进微生物对化合物的摄取。在大多数情况下，避免超过1000质量ppm的浓度以便不过度妨碍产生轻质氧合物如乙醇的微生物的生长。
本发明的一个宽泛方面为限制在气体基质的厌氧发酵中丁酸酯和丁醇以及更高分子量类似物(下文中集合性地称为较高级氧合物)产生的方法，所述气体基质包含CO和/或CO2与氢气的混合物中的至少一种。该方法包括使气体物流进入厌氧发酵区中，所述厌氧发酵区包含至少一种能够产生不同于或除较高级氧合物外的氧合液体产物的厌氧微生物物种。通过发酵区中的微生物与气体物流接触将至少一部分气体物流转化成液体产物。将巴豆酸酯类化合物作为产丁酸菌阻滞剂以有效限制较高级氧合物的产生的量加入发酵液中。该方法将包含液体产物的发酵液从发酵区中取出并从发酵液中回收液体产物。发酵区通常包含多种微生物物种，通常有用于制备液体产物的同型产乙酸微生物和产生丁酸酯和/或丁醇的产丁酸微生物。发酵区还可包含产生丁酸酯或丁醇以及液体产物如乙酸和/或乙醇或丙醇的异型产乙酸微生物。
本发明的另一宽泛方面为通过使用同型产乙酸微生物将包含CO和/或CO2与氢气的混合物的气体物流发酵以转化气体物流而生产乙醇的方法，其中抑制较高级氧合物的产生。该方法使气体物流进入包含同型产乙酸微生物和发酵液的发酵区中。同型产乙酸微生物与气体物流在发酵区中接触产生乙醇。将巴豆酸酯类化合物以足以抑制产丁酸菌生长和较高级氧合物产生的量引入发酵液中。基于间歇式或连续式，产丁酸菌阻滞剂浓度可为10-1000质量ppm。该方法将包含乙醇的发酵液从发酵区中取出并从发酵液中回收乙醇产物。
在另一形式中，本发明为通过使用同型产乙酸微生物将包含CO和/或CO2与氢气的混合物的气体物流发酵以将气体物流转化成乙醇而生产乙醇的方法。该方法使气体物流进入包含同型产乙酸微生物和发酵液的发酵区中，其通过与同型产乙酸微生物接触而将气体物流转化成乙醇。将包含巴豆酸酯类化合物的产丁酸菌阻滞剂加入发酵区中以破坏产丁酸菌的生长。产丁酸菌阻滞剂以产生50-1000质量ppm的巴豆酸酯类化合物浓度的量加入。该方法将包含乙醇的发酵液从发酵区中取出并从发酵液中回收乙醇产物。在本发明的优选形式中，产丁酸菌阻滞剂包含如下至少一种：4,4,4-三氟-3-三氟甲基巴豆酸；4,4,4-三氟-3-三氟甲基巴豆酰胺；4,4,4-三氟-3-三氟甲基巴豆酸乙酯；4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸；4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酰胺；4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸乙酯；2-三氟甲基苯甲酸；2-三氟甲基苯甲酰胺；2-三氟甲基苯甲酸乙酯；3-三氟甲基苯甲酸；3-三氟甲基苯甲酰胺；3-三氟甲基苯甲酸乙酯；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酸；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酰胺；和2-氨基-3-三氟甲基苯甲酸乙酯；且巴豆酸酯类化合物以50-500质量ppm的浓度加入发酵区中。
尽管本发明方法在使用合成气厌氧微生物生产轻质氧合物方面提供优异价值，该方法仍适用于制备轻质氧合物的其它方法。因此，本发明的另一宽泛方面涉及通过将有效量的某些巴豆酸酯类化合物供入发酵液中而限制由于在发酵方法中污染性产丁酸菌而导致的较高级氧合物产生的方法。特别地，本发明这一宽泛方面涉及基质转化成轻质氧合物的代谢转化方法的改进，所述基质可以为一种或多种糖或其它碳水化合物或一氧化碳或氢气和二氧化碳，所述方法包括使包含所述基质的发酵液与能够在需氧或厌氧发酵条件下将基质生物转化成轻质氧合物的微生物接触，所述发酵液对能够通过丁酰CoA酶由所述基质或所述轻质氧合物产生丁酸酯或丁醇中的至少一种的污染细菌的存在敏感，其中所述改进包括向所述发酵液中提供足量的巴豆酸酯类化合物以限制较高级氧合物的产生。
图
图1为阐述产生丁醇和丁酸酯的产丁酸菌代谢中的一些关键酶产物和中间产物的图。
图2为显示在不同浓度的巴豆酸酯衍生物的存在下，用异型产乙酸细菌发酵的产物分布的棒状图。
图3为显示在连续发酵罐运行中乙酸酯和丁酸酯化合物随时间的浓度的图，以及发酵液的光密度进行。
图4为显示经图3的连续发酵罐运行所选择的时间，丁酸酯化合物的产生和产生速率的图。
图5为图3的图在约500小时与640小时之间的放大部分。
图6为图3的图在约1660小时与1900小时之间的放大部分。
详述
定义
产丁酸菌指在厌氧条件下产生具有4个碳原子的化合物如丁酸酯和丁醇的微生物，该术语还可包括产生更长链(C6-C8)有机酸和醇的微生物。
产丁酸菌阻滞剂指用于抑制或杀灭产丁酸菌的化合物。该术语表明所述化合物作为杀菌剂或抑菌剂的活性。
丁基杂质指其结构中具有总计4个或更多碳原子的任何分子，其中碳原子作为链排列。
轻质氧合物指具有2或3个碳原子和至少一个碳-氧键的任何分子。
一般性描述
本发明适用于使用包含一氧化碳和氢气的气体基质厌氧发酵以制备轻质氧合物如乙醇、乙酸、丙醇和丙酸，且气体通常包含二氧化碳和氮气。合成气是该气体基质的一个来源。合成气可由许多含碳原料制备。这些包括烃来源，例如天然气、生物气体、通过含烃材料、泥炭、石油焦和煤重整而产生的气体。产生合成气的其它来源包括废料，例如建筑和拆除的碎屑、城市固体废物和填埋场气体。合成气通常通过气化器产生。天然气至合成气的转化也是有吸引力的合成气原料来源，所述转化例如通过部分氧化进行，例如2011年11月28日提交的美国专利申请序列号13/304,902中所公开的，通过引用将其全部并入本文中。任何上述生物质来源都适用于生产合成气。由此产生的合成气通常包含10-60摩尔％CO、10-25摩尔％CO2和10-60摩尔％H2。合成气还可包含N2和CH4以及痕量组分如H2S和COS、NH3和HCN。气体基质的其它来源包括通过石油和石油化学加工而产生的气体。这些气体可具有与通常的合成气实质性不同的组成，并且可以为基本纯氢气或基本纯一氧化碳。也可将基质气体处理以除去或改变组成，包括但不限于通过吸附、膜分离和选择性反应而除去组分。可将组分加入气体基质中，例如氮气或辅助气体如氨和硫化氢。术语合成气用于本文中且意欲包括这些其它气体基质。
本发明使用特别选择用于生产轻质氧合物，优选选择用于生产乙醇的同型产乙酸微生物和发酵条件。CO和H2/CO2生物转化成乙酸和乙醇和其它产物是已知的。合适的微生物在厌氧条件下生存和生长，这意味着发酵区中基本不存在气态和溶解的氧。厌氧生物转化的生物化学路径和能量的简述由Das，A.和L.G.Ljungdahl总结于Electron Transport System in Acetogens以及由Drake，H.L.和K.Kusel总结于Diverse Physiologic Potential of Acetogens中，分别在Biochemistry and Physiology of AnaerobicBacteria，L.G.Ljungdahl编辑，Springer(2003)的第14和13章。可使用具有通过转化合成气组分：CO、H2、CO2而生产乙醇的能力的任何微生物，所述合成气组分单独或彼此组合或与通常存在于合成气中的其它组分组合。合适的微生物和/或生长条件可包括名称为“Isolation and Characterization of Novel Clostridial Species”的美国专利7,704,723中所公开的那些，所述专利公开了具有所有识别特征ATCC No.BAA-622的拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)的生物纯培养物，通过引用将其全部并入本文中。拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)可例如用于将合成气发酵成乙醇。
合适的微生物包括：杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，菌株具有识别特征ATCC49587(US-A-5,173,429)和ATCC55988和55989(US-A-6,136,577)，其能够生产乙醇以及乙酸；产醇梭菌(Clostridium autoethanogemum sp.nov.)，由一氧化碳生产乙醇的厌氧菌，Jamal Abrini，Henry Naveau，Edomond-Jacques Nyns，Arch Microbiol.，1994，345-351；Archives of Microbiology1994，161：345-351；和科斯卡塔梭菌(ClostridiumCoskatii)，具有识别特征ATCC No.PTA-10522，以美国专利No.8,143,037提交。通过引用所有这些参考文献全部并入本文中。
本发明可为任何类型发酵区提供优点。合适的发酵区通常称为生物反应器。术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、泡罩塔、气体提升发酵罐、膜反应器如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)、静态混合器，或者适于气体-液体接触的其它容器或其它装置。
典型的生物反应器具有悬浮细胞型生物反应器或膜支撑型生物反应器的排列。在悬浮细胞型生物反应器中，发酵液包含悬浮的微生物，因为气体基质通过发酵液以通过气体吸收到液体中以及微生物摄取溶解的气体而进行气体与微生物之间的接触。悬浮细胞型生物反应器通常采取连续搅拌釜的形式，其中叶轮提供气体基质和发酵液的机械混合，或者泡罩塔生物反应器，其中将基质注入气体中促进气体与液体的混合。
膜支撑型生物反应器利用固体表面，微生物作为生物膜或细胞浓缩物生长于其上，基质气体与其接触，。如US20080305539A1所示的一种膜生物反应器使生物膜生长于膜的一侧上并与发酵液直接接触，同时基质气体从膜的相对侧渗透与生物膜接触。US20090215163A1公开了膜支撑型生物反应器的相反排列，其中膜的一侧保持微生物与气体基质直接接触，而发酵液从膜的相对侧渗透并与微生物接触。这两种类型的膜支撑型生物反应器均适用于本发明。
当本发明使用悬浮细胞生物反应器时，发酵液包含微生物和各种介质补充物的悬浮液。发酵液的各种辅助剂可包括缓冲剂、痕量金属、维生素、盐等。发酵液的调整可包括不同时间的不同条件，例如会影响微生物生产率的生长和非生长条件。先前引用的美国专利7,704,723，通过引用将其内容并入本文中，公开了用于使用厌氧微生物将CO和H2/CO2生物转化的条件和合适发酵溶媒的含量。操作生物反应器生产乙醇的其它方法、操作条件和介质描述于文献中，包括WO2007/117157、WO2008/115080、美国专利No.6,340,581、美国专利No.6,136,577、美国专利No.5,593,886、美国专利No.5,807,722和美国专利No.5,821,111中所述的那些，通过引用将每一篇并入本文中。
发酵在合适条件下进行，包括压力、温度、气体流速、液体流速、介质pH、介质氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器)、接种水平和确保液相中的CO不变成有限的最大气体基质浓度，和避免产物抑制的最大产物浓度。合适的条件描述于WO02/08438、WO07/117,157和WO08/115,080中。通常，发酵区中的发酵液和微生物包括25-60℃，更通常约30-40℃范围内的合适温度。其它发酵条件包括微生物的密度、发酵液组成和液体深度，其都优选足以实现追求的氢气和一氧化碳转化率。
包含营养物的新鲜液体介质通常连续进入生物反应器中。新鲜介质的加入和发酵液的取出提供细胞物质从生物反应器中的连续取出。由于发酵继续产生细胞物质，介质和发酵液的取出和加入速率会在生物反应器中建立平均细胞停留时间。大多数发酵区的平均细胞停留时间通常为2-7天。
如本发明所述的产丁酸菌阻滞剂为具有抑制或停止发酵区中通过微生物产生具有4个或更长链碳原子的酸或醇的作用，同时不实质性干扰合成气转化成较低碳数氧合物如C2和C3酸和醇的一类化合物。有用的产丁酸菌阻滞剂为可干扰一种或多种产丁酸菌的丁基杂质产生的任何化合物。已知的产丁酸菌包括基本仅产生丁基杂质的严格产丁酸菌和可产生乙醇和乙酸酯以及丁基杂质的异型产乙酸菌。
产丁酸菌的特征在于在其代谢路径中具有将巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA的关键步骤。图1显示了产丁酸菌代谢的普遍路径，且丁醇和丁酸酯的产生路径仅在起始基质方面不同。产生丁醇和丁酸酯的起始基质包括通过路径1的乙醇和乙酸、通过路径3和4的糖，和通过路径4的合成气。
产丁酸菌如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)产生丁酸酯作为主要产物或者作为短链脂肪酸产物污斑，所述短链脂肪酸产物作为其主要代谢的一部分，代谢中还产生几种酸和它们相应的溶剂(图1，路径2)。这些有机体使用糖或蛋白质作为代谢物生产的基质。其它产丁酸菌如各种真杆菌(Eubacterium)菌株和罗斯氏菌(Roseburia)是严格产丁酸的，并通过使用不同的酶产生大量酸而产生最终产物丁酸酯(图1，路径3)。预计这些类的产丁酸菌比使用路径1和路径4的那些问题更小，因为它们在预测存在于大规模合成反应器中的生长条件下可能在代谢方面是不利的。
路径1(图1)包括克氏羧菌(C.kluyveri)和可利用乙醇、乙酸酯和氢气制备C4和更高链酸的类似代谢类型的有机体。克氏羧菌(C.kluyveri)可停留在反应器中并与其它有机体形成共生关系，因此可能使它在代谢上是有利的，且如果发酵罐的环境条件不改变的话，这可导致永久性侵染。因此，对于利用产丁酸菌的非合成气而言，克氏羧菌(C.kluyveri)和类似类型造成长期永久性污染的高风险，因为它们可容易地由乙醇和乙酸酯或者两种乙酸酯产生C4或更高级酸。该反应在某些条件下在热动力方面也是有利的。
最后，使用路径4(图1)的有机体为可在糖和合成气上生长并产生多种短链和较长链酸和醇的那些。这些宽泛地归类为异型产乙酸菌，且成员包括食一氧化碳梭菌(C.carboxidivorans)和德氏梭菌(C.drakei)。这些异型产乙酸菌可使用糖以及合成气基质并且还可由C2亚单位产生C4酸和溶剂。异型产乙酸菌造成比其它产丁酸菌稍微更高的风险，因为它们在大规模发酵区中存在的低氧化还原、高溶解合成气条件下可能在代谢上是有利的。
如同严格产丁酸菌，异型产乙酸菌使用通常的路径产生C4化合物。进入产丁酸过程的点出现在两个乙酰-CoA通过与硫解酶反应缩合形成乙酰乙酰基-CoA时，在所有产丁酸菌中产丁酸过程除少数端点反应外为高度保守的路径。这之后在一个羰基上羟基化以形成S3-羟基丁酰-CoA(图1)。羟基丁酰-CoA通过巴豆酸酶(crotonase)脱水形成巴豆酰-CoA。先前形成3-HBCoA的反应可通过多种脱氢酶实现且对细胞不产生任何能量，而是产生一些氧化辅因子。当产生巴豆酰-CoA时，细胞变得对抑制剂敏感，因为来自产丁酸过程的能量，即使不是所有的话，也是大多数，来自巴豆酰-CoA向丁酰-CoA的转化。所有这些路径可通过破坏巴豆酰CoA向丁酰CoA转化的关键步骤而中断。
发现上述一类巴豆酸酯类化合物在由合成气生产轻质氧合物中充当丁基阻滞剂。尽管不愿受理论限制，认为这些化合物中断产丁酸菌代谢中的该关键步骤。同时，该巴豆酸酯类化合物不过度干扰同型产乙酸菌产生轻质氧合物如乙醇。重要的是，对产丁酸菌的有害作用体内发生，由此使该阻滞剂适于直接用在发酵中。
尽管不愿受理论束缚，本发明所用巴豆酸酯类化合物模拟未取代的巴豆酸酯阴离子，但由于影响3位碳原子(式II的芳基结构部分上的2位)的吸电子基团，在中断该步骤的机制中涉及降低的电子密度。
这些丁基阻滞剂通常在较低浓度水平下提供理想的结果。在连续发酵中，在低至50质量ppm的浓度下，巴豆酸酯衍生物对减少丁醇和丁酸具有有利作用，同时不过度破坏乙酸和乙醇的生产。事实上，观察到许多本发明巴豆酸酯类化合物直到达到在发酵液中1000质量ppm的浓度才开始过度影响同型产乙酸菌生长。因此，可调整加入发酵区中的这些巴豆酸酯类化合物的量以将它保持在有效阻滞产丁酸菌生长而不过度抑制所需同型产乙酸菌生长的范围内。因此，可调整丁基阻滞剂的使用以减少丁基杂质的产生，同时不过度损害乙醇、乙酸和其它轻质氧合物产物的产生。
丁基阻滞剂可以以多种方式加入发酵区中。它可以以所需剂量直接注入发酵区中。也可将丁基阻滞剂与新鲜介质输入或来自发酵区的再循环物流混合以促进发酵区中丁基阻滞剂的更好混合。
这些丁基阻滞剂容易溶混在简单烃和其它非水溶剂中。例如，常规芳族烃如二甲苯、甲苯等或脂族烃如己烷溶解这些丁基阻滞剂。因此，可将丁基阻滞剂溶于这类烃和其它非水溶剂中并通过熟知的技术通过加入合适表面活性剂和助溶剂制成微乳液。这些微乳液颗粒通常直径为0.1μm，并且可容易地分散于发酵介质中。在发酵介质中，乳液颗粒接触产丁酸菌并将丁基阻滞剂输送至有机体。这类微乳液输送体系的主要优点是它们以低得多的剂量有效，因为它们可保护活性化合物如丁基阻滞剂，还帮助将丁基阻滞剂输送至为主要目标的细胞表面。制备这类微乳液的方法和它们在一般杀生物剂配制剂中的使用描述于Yang等人的美国专利6096225中。在悬浮细胞或浮游型(planktonic)发酵中，丁基阻滞剂在作为单一剂以10-1000质量ppm的浓度引入时是有效的，其中50-500质量ppm的浓度水平对大多数应用是优选的。有效浓度受输送体系影响，微乳液体系具有50质量ppm以下以及低至10质量ppm或更低的有效浓度。优选，如果基于连续方式寻求产丁酸效果，则这些剂量基于生物反应器的平均细胞停留时间计算使得剂量具有至少2天的持续时间。如果产丁酸菌种群不希望地高，则可基于一次发酵操作使用更高的剂量水平，以使种群达到可接受的稳态水平。尽管更高的浓度可导致同型产乙酸菌种群的一些损失，但同型产乙酸菌可快速地再获得所需细胞密度。因此，即使可能发生一些同型产乙酸菌损失，本发明方法也提供比发酵罐清洗和灭菌更加经济可行的控制产丁酸菌的方式。
可响应于丁基杂质产生和C2产物输出的监控以变化的量加入丁基阻滞剂，并取决于丁基杂质的产生调整添加和浓度。就这点而言，可加入所需量的丁基阻滞剂以保持发酵区中的所需浓度或者响应于存在的产丁酸菌污染的监控而添加。因此，丁基阻滞剂可连续或间歇地使用以防止或逆转产丁酸菌生长的效果。如果需要的话，丁基阻滞剂可在发酵方法开始时加入。以这种方式，丁基阻滞剂充当预防措施以防止产丁酸菌污染保留在发酵罐中。添加可通过将丁基阻滞剂连续或间歇地注入发酵区中而在整个发酵方法中持续。在这种情况下，相对低的丁基阻滞剂剂量可能是有效的。特别地，可采用50质量ppm或者优选50-100质量ppm的浓度水平以5-10天的频率间歇式剂量。在不存在含有丁基阻滞剂的液体回收和再循环下，丁基阻滞剂以由平均细胞停留时间决定的速率从发酵罐中洗出。
不管输送体系，可使用任何方法测定产丁酸菌的存在和丁基阻滞剂的效率。监控来自发酵区的丁基杂质的存在下的产物输出可提供产丁酸菌污染的指示。优选发酵液经受定期取样以检测丁基杂质。
最通常地，响应于产丁酸菌的检测而添加丁基阻滞剂。在这种情况下，丁基阻滞剂以足够的量加入以在发酵罐中产生100-1000质量ppm浓度的单一剂量，优选500-1000质量ppm的剂量。可保持所需巴豆酸酯类化合物浓度直至产丁酸菌的存在降至所需水平，所需水平通常由来自发酵区的丁基杂质产量指示。当足够的产丁酸菌降至产生可接受的发酵区产物的水平时，可使巴豆酸酯化合物从发酵区中洗出。
可引入丁基阻滞剂以实现所需丁基杂质量的降低。理想地，发酵液中的丁基杂质降至0，然而，发酵液通常包含一些量的丁基污染。在大多数情况下，根据需要使用丁基阻滞剂以保持含乙醇发酵液中的丁酸酯和丁醇浓度为0.1％以下，优选0.01％以下。
实施例
实施例1-5
测试多种巴豆酸酯类化合物的杀菌或抑菌活性。测试的化合物示于表1中。
表1.测试的化合物
A.4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯 236.12
B.3-氨基-4,4,4-三氟巴豆酸乙酯 182.14
C.巴豆酸叔丁酯(对比) 142.20
D.4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸 208.06
E.4,4,4-三氟巴豆酸乙酯 168.12
F.2-甲基-4,4,4-三氟巴豆酸乙酯(对比) 197.16
G.4,4,4-三氟巴豆酸 140.06
H.3-氨基巴豆酸乙酯 129.16
实施例1
首先测试这些化合物以测定它们对已知同型产乙酸菌的影响。各化合物在一系列分批实验中测试以测定同型产乙酸菌对以变化浓度存在的化合物的生长响应。分批实验都通过用5ml具有表2和3中给定组成的发酵介质厌氧填充Balch管而进行。为加快结果，这些分批实验使用果糖作为细菌的生长营养源。因此，介质包含5g/L果糖。
表2.发酵介质组成
组分 量/升
矿物溶液，参见表2(a) 25ml
痕量金属溶液，参见表2(b) 10ml
维生素溶液，参见表2(c) 10ml
酵母提取物 0.5g
用NaOH调整pH 6.1
还原剂，参见表2(d) 2.5ml
表3(a).矿物溶液
组分 浓度(g/L)
NaCl 80
NH4Cl 100
KCl 10
KH2PO4 10
MgSO4·7H2O 20
CaCl2·2H2O 4
表3(b).痕量金属溶液
表3(c).维生素溶液
组分 浓度(mg/L)
维生素B6·HCl 10
维生素B1·HCl 5
Roboflavin 5
泛酸钙 5
硫辛酸 5
p-氨基苯甲酸 5
烟酸 5
维生素B12 5
巯基乙烷磺酸 5
生物素 2
叶酸 2
表3(d).还原剂
组分 浓度(g/L)
半胱氨酸(游离碱) 40
Na2S·9H2O 40
将各个管用0.5ml的相同菌株的产醇梭菌(C.autoethanogenum)细菌种子培菌液接种。将管保持在37℃的温度下。在管用细菌接种21小时以后，将来自表1的不同巴豆酸酯衍生物以表4所示量加入不同的管中。这是在细菌的对数生长期的早至中期。使细菌在不同巴豆酸酯衍生物浓度的介质中的各个发酵进行并监控以测定在从约20小时至190小时变化的所选时间间隔的细菌生长。所述间隔时的生长通过读取发酵液的光密度(OD)而测量。光密度使用Spectronic Spec20(Thermo Spectronic)在600nm的波长下测量。Balch管培养物的OD使用Spec20机器的吸收模式直接在管中测量。通过首先测量并仅使用介质作为空白而调整0吸收率的设置而将机器设置为0吸收率。在整个实验中的每个指定时间点重复该方法。特定巴豆酸酯衍生物浓度下管发酵以达到预定光密度的能力记录于表4中。表4中，以“+”表明存在的细菌生长至OD为约2或更高，以“+/-”表明存在的细菌生长至光密度在0.5-1.5范围内，以及以“-”表明细菌生长未能达到约0.5的光密度。
表4.响应于巴豆酸酯和巴豆酸酯类化合物浓度的变化，产醇梭菌(C.autoethanogenum)的光密度评估
ppm(m) 0 1 5 10 50 100 500 1000 5000 10000
A + + + + + + + + - -
B + + + + + + + + +/- -
C + + + + + + -
D + + + + +/- - -
E + + + + + - -
F + + + + + +/- -
G + + + + +/- - -
H + + + + + + +
如表4所示，同型产乙酸细菌耐受高达约5000ppm浓度的所测试巴豆酰基化合物。
实施例2
也测试化合物A和D以测试它们对另一已知同型产乙酸菌的影响。各化合物在一系列分批实验中测试以测定同型产乙酸菌对变化浓度下的化合物存在的生长响应。这些分批实验也都通过用5ml具有表2和3中给定组成的发酵介质厌氧填充Balch管而进行。为加快结果，这些分批实验使用果糖作为细菌的生长营养源。因此，介质包含5g/L果糖。
将各个管用0.5ml的相同菌株的科斯卡塔梭菌(C.coskatii)细菌种子培菌液接种。将管保持在37℃的温度下。在将管用细菌接种21小时以后，将来自表1的不同巴豆酸酯衍生物以表5所示量加入不同的管中。这是在细菌的对数生长期的早至中期。使细菌在不同巴豆酸酯衍生物浓度的介质中的发酵各自进行并监控以测定在从约20至50小时变化的所选时间间隔的细菌生长。所述间隔时的生长通过以实施例1所示方式测量OD而测定。特定巴豆酸酯衍生物浓度下管发酵以达到预定光密度的能力记录于表5中。表5中，以“+”表明存在的细菌生长至OD为约1.6或更高。所有科斯卡塔梭菌(C.Coskatii)试样在仅50小时以后都达到相对高的OD。
表5.响应于巴豆酸酯和巴豆酸酯类化合物的浓度变化，科斯卡塔梭菌(C.coskatii)的光密度评估
ppm(m) 0 100 500 1000
A + + + +
D + + + +
实施例3
进行类似的实验以进行关于哪些巴豆酸酯和巴豆酸酯类化合物会充当产丁酸菌阻滞剂的初级测定。为此，再次将所选择的化合物在一系列分批实验中测试以测定产丁酸菌对变化浓度下的化合物存在的生长响应。分批实验都通过用5ml具有表2和3中给定组成的发酵介质厌氧填充20mlBalch管而进行。介质包含0.5v/v最终浓度的果糖基质。对于测试的各巴豆酸酯浓度，准备重复试验管。
将各个管用0.5ml的严格产丁酸菌酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)的种子培菌液接种。将管保持在37℃的温度下。在将管用细菌接种21小时以后，将来自表1的不同化合物以表6所示量加入不同的管中。这是在细菌的对数生长期的早至中期。使细菌在不同巴豆酸酯衍生物浓度的介质中的发酵各自进行并监控以测定在从约20至54小时变化的所选时间间隔时的细菌生长。所述间隔时的生长通过读取发酵液的光密度(OD)而测定。光密度如实施例1所述测量。特定巴豆酸酯衍生物浓度下管发酵以达到预定光密度的能力记录于表6中。表6中，以“+”表明存在的细菌生长至OD为约1.8或更高，以“+/-”表明存在的细菌生长至光密度在0.7-1.5范围内，以及以“-”表明细菌生长未能达到约0.7的光密度。
表6.响应于巴豆酸酯和巴豆酸酯类化合物的浓度变化，酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)的光密度评估
ppm(m) 0 100 500 1000
A + + +/- -
B + + + +
C(对比) + + + +
D + + + +
E + + + +
F(对比) + + + +
G + + + +
实施例4
进行类似的实验以测定巴豆酸酯衍生物对异型产乙酸细菌的影响。将所选择的巴豆酸酯衍生物在一系列分批实验中测试以测定产丁酸菌对变化浓度下的化合物存在的生长响应。分批实验都通过用5ml具有表2和3中给定组成的发酵介质厌氧填充20ml Balch管而进行。介质包含0.5v/v最终浓度的果糖基质。对于测试的各巴豆酸酯浓度，准备重复试验管。
将各个管用0.5ml异型产乙酸细菌食一氧化碳羧菌(Clostridiumcarboxydivorans)接种。将管保持在37℃的温度下。在细菌接种20小时以后，将来自表1的不同巴豆酸酯衍生物以表7所示量加入不同的管中。这是在对数生长期的早至中期。使细菌在不同巴豆酸酯衍生物浓度的介质中的发酵各自进行并监控以测定在从约20至54小时变化的所选时间间隔时的细菌生长。不同所述间隔时的生长通过读取发酵液的光密度(OD)而测定。光密度如实施例1所述测量。特定巴豆酸酯衍生物浓度下管发酵以达到预定光密度的能力记录于表7中。表7中，以“+”表明存在的细菌生长至OD为约1.8。对于这些实验，“+/-”表明一个重复试验管显示出+指示，且另一个显示小于0.5的光密度。
表7.响应于巴豆酸酯和巴豆酸酯类化合物的浓度变化，食一氧化碳羧菌(C.carboxidivorans)的光密度评估
ppm(m) 0 100 500 1000
A + + + +
D + + + +/-
产物特征在化合物A的存在下生长的食一氧化碳羧菌(C.carboxidivorans)培养物上测定。GC-MSD在54小时培养物上进行，并基于所得输出面积计算产物分布(参见图2)。在未加入化合物A的培养物中，C2、C4和C6酸和醇的分布在两个试样中是类似的。当化合物A浓度提高时，C2，特别是醇的量提高。在500和1000ppm下，基本观察到的所有产物为C2醇。因此，化合物A的存在显示对C4和更长链醇和酸产生的抑制效果。因此，这类巴豆酸酯衍生物可有效地限制发酵区中来自在合成气培养物中可与同型产乙酸细菌有效地竞争的异型产乙酸菌的丁基杂质积累量。
实施例5
将化合物A再次在一组实验中测试，所有方面都与实施例4所述相同，不同之处在于，在细菌接种5.5小时以后时将化合物以表7所示量加入Balch管中。这是早期对数生长期。在这种情况下，不包含化合物A的Balch管在29小时或更短的时间后达到2的OD。在约54小时以后，接收100ppm化合物A的管发酵使一个管达到至少2的OD，而重复管未能达到1的OD。对于接收500和1000ppm化合物A的所有发酵管，OD未能上升至约0.5以上。
实施例1-5表明，化合物A和D在高达1000ppm的浓度下都为同型产乙酸菌所耐受。化合物A和D都显示降低产丁酸菌生长的抑制效果。因此，这些二卤代巴豆酰基酯和酸显示出在制备乙醇和乙酸的同型产乙酸菌发酵中具有降低丁基杂质的有用的体内抑制效果。
实施例6-10
进行其它实验以测定巴豆酰衍生物在包含产丁酸菌污染的连续发酵中的作用。化合物A和D在包含来自大规模发酵运行中所用10,000加仑生物反应器的种子培养物的2L发酵罐中测试。大规模发酵运行具有约8,000加仑的发酵液体积。大规模发酵运行由产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的接种生长，其通过产物中0.5％丁基化合物的存在而表明产丁酸菌的明显存在。
为启动2L发酵，将来自大规模发酵罐的种子培养物引入2L发酵罐中并在酵母提取物下生长至大约1的OD，此时观察到产丁酸菌的实质性产生。2L发酵罐为以200rpm的混合速度作为连续搅拌罐操作的SartoriusBiostat B系列发酵罐。在初始生长24小时以后，将组成为38％CO、38％H2、15％CO2和余量CH4的气体物流引入发酵罐中。发酵在37℃的温度、5.30±0.05的pH下进行，并包含约2升具有表8中给出的组成的发酵介质。将新鲜发酵介质以足以建立5.8天的平均细胞停留时间的速率连续地加入2升发酵罐中。使发酵进行并将不同浓度的化合物A和D在不同的时间以间歇注入加入发酵中。使每次注入在下一次注入以前从发酵罐中洗出。发酵罐中乙酸酯和丁酸酯的存在以及发酵介质的OD显示于图3中。
表8.2L发酵介质组成
组分 量/升
矿物溶液，参见表7(a) 25ml
痕量金属溶液，参见表7(b) 10ml
维生素溶液，参见表7(c) 10ml
酵母提取物 0g
用NaOH调整pH 6.1
还原剂，参见表2(d) 2.5ml
表7(a).矿物溶液
组分 浓度(g/L)
NaCl 0
NH4Cl 100
KCl 10
KH2PO4 20
MgSO4·7H2O 5
CaCl2·2H2O 2
表7(b).痕量金属溶液
组分 浓度(g/L)
氨三乙酸 0
用12.1N HCL，pH2.0
MnSO4·H2O 0.377
Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0
CoCl2·6H2O 0.358
ZnSO4·7H2O 1.96
NiCl2·6H2O 0.078
Na2MoO4·2H2O 0
Na2SeO4 0.1
Na2WO4 0.118
Fe(SO4)·7H2O 3.657
用12.1N HCL，pH2.0
表7(c).维生素溶液
组分 浓度(mg/L)
吡哆醇·HCl 0
维生素B1·HCl 10
核黄素 0
泛酸钙 10
硫辛酸 0
p-氨基苯甲酸 0
烟酸 0.5
维生素B12 0
巯基乙烷磺酸 0
生物素 5
叶酸 0
表7(d).还原剂
组分 浓度(g/L)
半胱氨酸(游离碱) 40
Na2S·9H2O 0
Clerol消泡剂 0.02
实施例6
在发酵罐操作约500小时以后，当OD为1.82且丁酸酯浓度为4.5g/L时，将化合物A直接加入发酵罐中至500ppm的浓度。在引入化合物以后，OD在前24小时内快速降低几乎50％，且丁酸酯浓度在相同时间内降低20％。也在前24小时内，丁醇含量快速提高6倍至0.68g/L，表明丁酸快速转化成丁醇。丁酸的转化速率和介质的稀释速率的组合惊人地降低丁酸酯产生速率直至它在最初加入化合物A的80小时内降至0(参见图4)。另外，在80小时以后OD继续降低，低至0.54。在加入500ppm化合物A约140小时以后，OD几乎恢复至其初始值，同时乙醇提高超过100％，且乙酸产量惊人升高(参见图5)。C2和C4醇和酸的浓度显示于表9中。
表9
加入 OD 乙醇 乙酸 正丁醇 丁酸
小时 @600nm g/L g/L g/L g/L
0.0 1.82 0.026 3.237 0.109 4.503
24.0 1.09 0.266 2.728 0.681 3.600
49.0 0.76 0.255 2.333 0.601 3.074
80.0 0.54 0.212 1.959 0.497 2.542
121.0 0.75 0.345 2.446 0.513 1.842
145.0 1.17 0.441 4.082 0.311 1.645
实施例7
在发酵罐操作约700小时和洗出加入的首个500ppm化合物A以后，将另外50ppm化合物A直接加入发酵罐中。在50ppm添加以后OD和丁酸酯浓度降低(参见图3)，并至少前3天持续。同时，乙醇和乙酸浓度持续提高。
实施例8
在大约另外8天和洗出加入的50ppm化合物A以后，丁酸酯浓度提高至2g/L。此时将另外100ppm化合物A直接加入进入运行约890小时的发酵罐中。当加入化合物A时，乙醇浓度开始立即提高。在约24小时以后，丁酸酯浓度开始再次下降，经之后的4天几乎下降50％(参见图3)。
实施例5-8的结果表明，在2L产丁酸反应器中，化合物A在添加以后不久对产丁酸菌种群就具有抑制和杀菌作用。在所有三个试验中，化合物A的加入在前24小时就显示出OD和丁酸酯产生的降低，同时C2产生增加。产丁酸菌阻滞剂的加入在低至50ppm的浓度下就显示出有利效果。
实施例9
在加入100ppm化合物A以后，在相同操作条件下继续发酵罐操作。在用于完全洗出化合物A的20天之后，将100ppm化合物D直接加入进入发酵罐运行中约1370小时的发酵罐中。在加入化合物D后，乙醇浓度和乙酸浓度急剧上升，同时丁酸酯产生降低。在加入100ppm化合物D以后，丁醇浓度临时升高，其再次被认为是表明丁酸快速转化成丁醇，如实施例5中所见。
实施例10
对于在第一次将化合物D注入发酵罐中以后的12天，使发酵罐洗出化合物D。然后在发酵罐操作约1660小时以后将500ppm化合物D直接注入发酵罐中(参见图3)。加入500ppm化合物D时所得C2和C4醇和酸的浓度显示于表10中。
表10.
数据和图6表明，OD在加入化合物D以后立即开始降低，显示出细胞生长的降低。此外，正丁酸酯和正丁醇的浓度开始平稳且缓慢地降低，而乙醇和乙酸酯的浓度开始上升。此外，在初始降低以后，OD开始升高，C2化合物同时增加。这清楚地确定了，产丁酸菌被特定抑制，而同型产乙酸有机体未被抑制，并能够生长，继续在化合物D的存在下产生理想的C2产物。
实施例11
Lehman等人在An Acyl-Coenzyme A Dehydrogenase Assay Utilizing theFerricenium Ion，Analytical Biochemistry186，第280-284页(1990)中公开了用于测定儿童酶缺乏的酰基-CoA脱氢酶体外分析筛选技术。改进该技术以作为用于确定潜在产丁酸菌抑制剂的潜在筛选方法。
制备含水分析液使得每1ml试样包含50mM的TrisHCl缓冲剂(pH7.6)；0.05mM的丁酰-CoA；5微摩尔FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)和0.4mM二茂铁盐(ferrocenium)。将酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)的全部细胞溶解并加入分析液中。将各化合物以0.5mM、1.25mM、2.5mM、5.0mM和10mM的浓度加入1ml试样中(还制备对照试样，其不包含无细胞提取物)。缩写mM代表毫摩尔。
为确保试样间的代谢一致性，制备酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)的母批料并在早期对数生长阶段收获(约0.5-0.7的近似O.D.)。将母批料发酵液离心分离并用50mMTrisHCl缓冲剂(pH7.6)冲洗，离心分离并用50mMTrisHCl缓冲剂(pH7.6)重构至初始母批料浓度的10倍。将约0.5ml的等份放入低温小瓶(约1.8ml容量)中并在-80℃下冷冻直至需要时。当需要时，将小瓶放入厌氧Coy室中并使其解冻至室温。当解冻时，将细胞加入15mL离心管中并用0.5mL的2mg/mL溶菌酶(购自Aldrich)在50mM Tris-HCl中的溶液稀释(最终溶菌酶浓度为约1mg/mL)。将离心管倒置5次，从Coy室中取出，并使其在37℃下接种30分钟。在接种以后，使离心管返回Coy室中并将50μL的Triton-X100在50mM Tris-HCl缓冲剂中的5％(v/v)溶液加入溶解的细胞中。将离心管在Coy室中涡旋约30秒，从室中取出并在4000rpm和4℃下离心15分钟。使管返回室中并使用无细胞提取物(上清液)制备上述试样。
通过使用具有7皿传送带和具有隔膜盖的Starna石英皿的Thermo ScientificEvolution300UV/Vis分光光度计，在300nm的吸收光谱多次分析试样以测定二茂铁盐的减少量。试样在实验室温度下并保持在厌氧条件下。通常，吸收率经约10-20分钟测量，这对于吸收率停止变化是足够的时间。吸收率变化期间吸收率变化速率的线性斜率使用Microsoft2010线性回归测定以由数据点产生直线。斜率越缓，抑制越好，因为酶在还原分析试样中的二茂铁盐方面越慢。然后通过相对于各化合物浓度绘出线性斜率而测定各化合物的剂量-响应曲线。然后使用Microsoft2010线性回归测定各化合物的线性斜率以由这些数据点产生直线。剂量-响应斜率越陡，抑制越好，因为提高的化合物浓度导致更多的酶活性差异。因为实验不精确性和斜率测定，剂量-响应斜率通常具有宽标准偏差。
来自表1的化合物A具有约8的剂量-响应斜率，这证明该技术具有体外筛选能力。表11提供多种化合物的剂量-响应斜率测定。
表11.各种化合物的剂量-响应斜率
化合物 剂量-响应斜率
3-氨基-4,4,4-三氟巴豆酸乙酯 25
3-三氟甲基-4-甲氧基苯甲酰胺 12
3-三氟甲基苯甲酸乙酯 9
4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯 8
4,4,4-三氟巴豆酰胺 8
2-(三氟甲基)苯甲酸乙酯 8
3-(三氟甲基)苯甲酸酯 6
4,4,4-三氟巴豆酸乙酯 6
巴豆酸叔丁酯(对比) 6
3-三氟甲基-4-氟苯甲酰胺 5
4,4,4-三氟-2-甲基巴豆酸乙酯(对比) 2
实施例12-15
实施例12-15为体内实施例且各实施例中使用标准介质，如表12和13(a)、(b)和(c)所述。
表12.发酵介质组成
表13(a).矿物溶液
组分 浓度(g/L)
NaCl 0
NH4Cl 100
KCl 10
KH2PO4 20
MgSO4·7H2O 5
CaCl2·2H2O 2
表13(b).痕量金属溶液
表13(c).维生素溶液
组分 浓度(mg/L)
吡哆醇·HCl 0
维生素B1·HCl 300
Roboflavin 0
泛酸钙 300
硫辛酸 0
p-氨基苯甲酸 0
烟酸 15
维生素B12 0
巯基乙烷磺酸 0
生物素 150
叶酸 0
实施例12
在一系列分批发酵中评估4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸乙酯以测定产丁酸菌对变化浓度下的该化合物存在的生长响应。分批发酵通过将100mL浆液瓶用20mL的具有表12和13中给定组成的介质厌氧填充而进行。将约0.2mL的50％w/w果糖水溶液(最终果糖浓度约5g/L)供入瓶中。
将各个瓶用2mL的严格产丁酸菌酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)的种子培菌液接种，其具有约0.90的OD(其在稀释10倍时提供约0.09的发酵起始OD)。将瓶保持在37℃的温度下。在将瓶用细菌接种25小时以后，发酵介质具有0.70-0.85的光密度。此时，将化合物作为在100μL介质中的溶液以表14所示量加入不同的瓶中。细菌在接种时处于对数生长期中期。使发酵方法在37℃下进行。在所选择的时间间隔下，通过读取发酵液的光密度(OD)而测量细菌生长。光密度通过厌氧性取出一等份发酵液并将它加入一次性比色皿中而测量。0.01-0.4的OD直接测得，而大于0.4的OD在进行用水1/10稀释以后测得。
表14.对变化抑制剂浓度的O.D.响应
小时 对照 100ppm 250ppm 500ppm 1000ppm
22.5 0.76 0.84 0.86 0.80 0.70
28.5 1.82 1.48 1.87 0.93 0.77
43.5 1.67 1.53 1.92 1.00 0.78
如从表14中的数据可以看出，对照在22.5与28.5小时之间具有最大的O.D.提高，因此表明该巴豆酸酯类化合物对产丁酸菌具有抑制作用。
实施例13.
在一系列分批发酵中评估3-(三氟甲基)苯甲酸乙酯以测定产丁酸菌对变化浓度下的该化合物存在的生长响应。分批发酵通过将100mL浆液瓶用15mL的具有表12和13中给定组成的介质厌氧填充而进行。将约0.15mL的50％w/w果糖水溶液(最终果糖浓度约5g/L)供入瓶中。对于各浓度，进行重复测试。
将各个瓶用1.5mL的严格产丁酸菌酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)的种子培菌液接种，其具有约0.40的OD(其在稀释10倍时提供约0.04的发酵起始OD)。将瓶保持在37℃的温度下。在将瓶用细菌接种2小时以后，将化合物作为在50μL N-甲基吡咯烷酮中的溶液以表15所示量加入不同的瓶中。使发酵方法在37℃下进行。在所选择的时间间隔下，通过读取发酵液的光密度(OD)而测量细菌生长。光密度通过厌氧性取出一等份发酵液并将它加入一次性比色皿中而测量。0.01-0.4的OD直接测得，而大于0.4的OD在进行用水1/10稀释以后测得。
表15.对变化抑制剂浓度的O.D.响应
对于几个以上试样，在所述时间点通过气相色谱法测定丁酸的浓度。丁酸酯产量基于气相色谱产生的峰面积计算而计算。在11小时时，各对照的丁酸浓度为约0.95g/l，包含500ppm抑制剂的试样的丁酸浓度为约0.6g/l。
实施例14.
在该实施例中通过分批发酵评估4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯和3-三氟甲基-4-甲氧基苯甲酸乙酯。分批发酵通过将100mL浆液瓶用15mL的具有表12和13中给定组成的介质厌氧填充而进行。将约0.15mL的50％w/w果糖水溶液(最终果糖浓度约5g/L)供入瓶中。对于各浓度，进行重复测试。
将各个瓶用1.5mL的严格产丁酸菌酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)的种子培菌液接种，其具有约0.42的OD(其在稀释10倍时提供约0.042的发酵起始OD)。将瓶保持在37℃的温度下。在将瓶用细菌接种2小时以后，将化合物作为在50μL N-甲基吡咯烷酮中的溶液以表16和17所示量加入不同的瓶中。使发酵方法在37℃下进行。在所选择的时间间隔下，通过读取发酵液的光密度(OD)而测量细菌生长。光密度通过厌氧性取出一等份发酵液并将它加入一次性比色皿中而测量。0.01-0.4的OD直接测得，而大于0.4的OD在进行用水1/10稀释以后测得。在各表中重复对照A和对照B测试的结果。
表16.对4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯的O.D.响应
小时 对照A 对照B 5mM A 5mM B
0 0.42 0.42 0.42 0.42
2 0.11 0.11 0.10 0.10
4.5 0.28 0.27 0.14 0.11
6 0.41 0.13 0.13 0.13
24 1.66 1.63 0.12 0.12
表17.对3-三氟甲基-4-甲氧基苯甲酸乙酯的O.D.响应
小时 对照A 对照B 5mM A 5mM B 10mM A 10mM B
0 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42
2 0.11 0.11 0.11 0.12 0.11 0.11
4.5 0.28 0.27 0.20 0.18 0.24 0.23
6 0.41 0.13 0.16 0.10 0.12 0.13
24 1.66 1.63 1.23 0.91 1.22 1.19
丁酸的浓度通过气相色谱法使用实施例13所述程序测定。表18和19汇总了结果，其中产量以g/l报告。对照仅报告于表18中。
表18.使用4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯的丁酸酯产量
小时 对照A 对照B 5mM A 5mM B
2 0 0.02 0.03 0
4.5 0.10 0.09 0.04 0.04
6 0.21 0.26 0.06 0.05
24 1.11 1.12 0.10 0.08
表19.使用3-三氟甲基-4-甲氧基苯甲酸乙酯的丁酸酯产量
小时 5mM A 5mM B 10mM A 10mM B
2 0.04 0 0.03 0.03
4.5 0.15 0.67 0.69 0.67
6 0.19 0.10 0.11 0.10
24 1.15 0.14 0.19 0.17
实施例15.
在该实施例中，通过使用合成气基质分批发酵而评估各种巴豆酸酯类化合物对产醇梭菌(C.autoethanogenum)的毒性。分批发酵通过将100mL浆液瓶用10mL的具有表12和13中给定组成的介质厌氧填充而进行。对于各浓度，进行重复测试。化合物为：
C-1 4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯
C-4 4,4,4-三氟巴豆酰胺
C-9 4,4,4-三氟-3-(氨基)巴豆酸乙酯
C-18 3-三氟甲基-4-甲氧基苯甲酸酯。
将各个瓶用1.0mL的来自使用合成气基质的活性发酵罐且包含产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的种子培菌液接种，所述培菌液具有约4.92的OD(其在稀释10倍时提供约0.49的发酵起始OD)。将瓶用合成气充气至约100千帕并保持在37℃的温度下。每8-12小时将瓶用合成气再充气。合成气具有实施例6-10所述的近似组成。在将瓶用细菌接种24小时以后，将化合物作为在50μL N-甲基吡咯烷酮中的溶液以表20和21所示量加入不同的瓶中。使发酵方法在37℃下进行。在所选择的时间间隔下，通过使用ThermoSpectronic Genesys20分光光度计读取发酵液的OD而测量细菌生长。光密度通过厌氧性取出一等份发酵液并将它加入一次性比色皿中而测量。0.01-0.4的OD使用发酵液直接测得，而大于0.4的OD在进行用水1/10稀释以后测得。
表20.对各抑制剂的O.D.响应
小时 对照 C-1A C-1B C-4A C-4B C-9A C-9B C-18A C-19B
0 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49
2.5 0.49 0.42 0.46 0.40 0.42 0.40 0.42 0.47 0.41
6.5 0.41 0.42 0.46 0.4 0.43 0.42 0.46 0.44 0.44
24.5 1.29 1.17 1.08 1.03 1.09 1.14 0.97 1.15 1.18
30.5 1.36 1.15 1.22 1.31 1.33 1.28 1.47 1.32 1.28
47.5 1.86 0.66 0.67 1.7 1.64 1.67 2.12 1.73 1.75
丁酸的浓度通过气相色谱法使用实施例13所述程序测定。表21汇总了结果，其中产量以g/l报告。
表21.各抑制剂对产醇梭菌(C.autoethanogenum)的O.D.响应
小时 对照 C-1 C-4 C-9 C-18
0 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49
2.5 0.49 0.44 0.41 0.41 0.44
6.5 0.41 0.44 0.42 0.44 0.44
24.5 1.29 1.12 1.06 1.06 1.16
30.5 1.36 1.18 1.32 1.38 1.30
47.5 1.86 0.66 1.67 1.90 1.74
56 1.91 0.58 1.72 1.98 1.88

Claims (11)

1.基质代谢转化成C2或C3氧合物的方法，其包括在包含所述基质的发酵液中与选自能够将基质生物转化成C2或C3氧合物的同型产乙酸或异型产乙酸微生物的厌氧微生物在发酵条件下接触，所述发酵液对污染细菌的存在敏感，所述污染细菌能够通过丁酰CoA酶由所述基质或所述C2或C3氧合物产生丁酸酯或丁醇中的至少一种，所述方法的特征在于在所述发酵液中提供足量的巴豆酸酯类化合物以限制较高级氧合物的产生，所述化合物由以下结构式表示：
I.R2(R3)C＝C(H)C(O)R1
或
II.R2-A-C(O)R1
其中：
R1为-OH、-OR5或-N(R4)2，其中R5为烃基，且各R4可相同或不同并且为氢或烃基；
R2为氢、-NH2、-OH或-CX3，其中各X可相同或不同且为氢或卤素；
R3为具有1-18个碳且可未被取代或被-OH、具有1至6个碳的烷氧基或卤素取代的烃基；
A为具有5或6个环原子的芳族结构部分，所述环原子可以都是碳原子，或者可以为具有一个选自氧和氮的杂原子的杂环，所述芳族结构部分具有在2位上的–R2，其中–R2如上文所定义，且所述芳族结构部分可未被取代或者在更高碳位中的一个或多个上被如下取代基取代：(i)具有1-18个碳且可被-OH、具有1至6个碳的烷氧基或卤素取代的烃基，(ii)-OR6，其中R6为低级烷基，(iii)–N(R7)2，其中各R7为相同或不同的且为氢或烃基，或(iv)卤素；
条件是在结构式I中，R2和R3中的至少一个为卤代烷基或者被卤代烷基取代，且在式II中，芳基结构部分的至少2或3碳位被选自卤素和卤代烷基的吸电子基团取代。
2.限制气体基质的厌氧发酵中C4氧合物的产生的方法，所述气体基质包含CO以及CO2与氢气的混合物中的至少一种，所述方法包括：
a.使气体物流进入厌氧发酵区中，所述厌氧发酵区包含至少一种厌氧微生物物种，其选自能够产生包含C2或C3氧合物的液体产物的同型产乙酸或异型产乙酸微生物物种；
b.通过发酵区中的同型产乙酸或异型产乙酸微生物与气体物流接触而将至少一部分气体物流转化成液体产物；
c.将包含液体产物的发酵液从发酵区中取出；和
d.从发酵液中回收液体产物；
该方法的特征在于，在发酵液中提供有效限制C4氧合物产生的量的至少一种巴豆酸酯类化合物，所述巴豆酸酯类化合物由以下结构式表示：
I.R2(R3)C＝C(H)C(O)R1
或
II.R2-A-C(O)R1
其中：
R1为-OH、-OR5或-N(R4)2，其中R5为烃基，且各R4可相同或不同并且为氢或烃基；
R2为氢、-NH2、-OH或-CX3，其中各X可相同或不同且为氢或卤素；
R3为具有1-18个碳且可未被取代或被-OH、具有1至6个碳的烷氧基或卤素取代的烃基；
A为具有5或6个环原子的芳族结构部分，所述环原子可以都是碳原子，或者可以为具有一个选自氧和氮的杂原子的杂环，所述芳族结构部分具有在2位上的–R2，其中–R2如上文所定义，且所述芳族结构部分可未被取代或者在更高碳位中的一个或多个上被如下取代基取代：(i)具有1-18个碳且可被-OH、具有1至6个碳的烷氧基或卤素取代的烃基，(ii)-OR6，其中R6为低级烷基，(iii)–N(R7)2，其中各R7为相同或不同的且为氢或烃基，或(iv)卤素；
条件是在结构式I中，R2和R3中的至少一个为卤代烷基或者被卤代烷基取代，且在式II中，芳基结构部分的至少2或3碳位被选自卤素和卤代烷基的吸电子基团取代。
3.根据权利要求2的方法，其中发酵区包含至少一种用于产生包含乙醇或乙酸酯的液体产物的同型产乙酸或异型产乙酸微生物，且所述发酵区被产生丁酸酯或丁醇中的至少一种的产丁酸微生物污染。
4.根据权利要求3的方法，其中发酵区包含同型产乙酸微生物，所述微生物包含以下至少一种：产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)和科斯卡塔梭菌(Clostridiumcoskatii)，且发酵区产生包含乙酸酯和乙醇中的至少一种的液体产物。
5.根据权利要求1或2的方法，其中厌氧微生物包含异型产乙酸微生物，其产生具有至少2-3个碳原子的液体产物，且液体产物包含乙酸、乙醇、丙醇和丙酸中的至少一种。
6.根据权利要求2的方法，其中发酵区包含用于产生包含乙醇的液体产物的同型产乙酸微生物和产生丁酸酯或丁醇中的至少一种的产丁酸微生物。
7.根据权利要求1或2的方法，其中巴豆酸酯类化合物由下式表示：
III.R2(R3)C＝C(H)C(O)R1
或
IV.R2-A-C(O)R1
其中在式III中，R2为–OH、-NH2或–CX3，其中X为卤素，且R3为–CX3，其中X为卤素，且
在式IV中，芳基为苯基，且苯基结构部分的2和3位碳中的至少一个为–CX3，其中X为卤素。
8.根据权利要求7的方法，其中所述至少一种巴豆酸酯类化合物包括如下至少一种：4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸烷基酯；4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸；4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酰胺；2-三氟甲基苯甲酸；2-三氟甲基苯甲酰胺；2-三氟甲基苯甲酸烷基酯；3-三氟甲基苯甲酸；3-三氟甲基苯甲酰胺；3-三氟甲基苯甲酸烷基酯；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酸；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酰胺；2-氨基-3-三氟甲基苯甲酸烷基酯；3-三氟-4-甲氧基苯甲酸；3-三氟-4-甲氧基苯甲酰胺；3-三氟-4-甲氧基苯甲酸烷基酯；3-三氟甲基-4-氟苯甲酸；3-三氟甲基-4-氟苯甲酰胺；3-三氟甲基-4-氟苯甲酸烷基酯；3-三氟甲基-5-三氟甲基苯甲酸；3-三氟甲基-5-三氟甲基苯甲酰胺；3-三氟甲基-5-三氟甲基苯甲酸烷基酯；3-氨基取代巴豆酸酯，其中烷基具有1-4个碳。
9.根据权利要求8的方法，其中所述至少一种巴豆酸酯类化合物包括如下至少一种：4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸乙酯；4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酸；4,4,4-三氟-3-(三氟甲基)巴豆酰胺；和4,4,4-三氟甲基-3-(三氯甲基)巴豆酸乙酯。
10.根据权利要求8的方法，其中3-氨基取代巴豆酸酯选自4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸；4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酰胺；和4,4,4-三氟-3-氨基巴豆酸烷基酯。
11.根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种巴豆酸酯类化合物以足以在发酵液中产生至少10质量ppm的浓度的量加入。
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