CN103958662A

CN103958662A - 用于疾病生物标记鉴定和样品质量评价的优选样品处理和加工方案的选择

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Publication number: CN103958662A
Application number: CN201280052220.8A
Authority: CN
Inventors: M·里尔-米恩; A·A·E·斯图尔特; G·桑德斯; R·M·奥斯特罗夫; S·A·威廉斯; E·N·布罗迪
Original assignee: Somalogic Inc
Current assignee: Somalogic Inc
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2014-07-30
Also published as: KR20150044834A; IL231719A0; AU2012328864A1; US20130103321A1; EP2771451A1; CA2850525A1; MX2014004794A; WO2013063139A1; JP2014531046A

Abstract

本发明涉及用于获得具有改善质量的生物样品的方法。它包括鉴定生物样品中由于样品收集、处理和加工中的变化而改变的标记或蛋白质。它们还可用于校正关于疾病生物标记的测量结果中的变化。进一步地，它们可以允许根据需要拒绝样品或样品组，如果测定它们的收集方法未依照预定方案。对于技术人员有用的其他优点在本文中描述。

Description

用于疾病生物标记鉴定和样品质量评价的优选样品处理和加工方案的选择

技术领域

在医学诊断和药物开发领域中，在来自个体的血液及其他生物样品组成之间作出比较，以便测定且理解可能与特定状况或疾病有关的那些改变。例如，生物标记可以指出响应某些药物的能力、疾病例如癌症的存在或监控过程例如对治疗的应答或器官功能中的改变。一旦确定为可靠和稳固的(robust)，此类生物标记测量就可以在临床上使用。

关于作为生物标记发现和进一步研究临床效用所需的理想生物标记测量的关键性质包括可靠性和稳固性。

背景技术

血液含有用于与损伤或外来因子和感染性物质反应的强大的细胞和体液系统。小攻击可以诱导先天性免疫系统(补体系统和细胞例如巨噬细胞)以释放强大的信号和酶，导致血小板活化且触发血液凝固。由于这些信号与体内过程有关，它们是有利的，因为它们可以直接参与防御和修复系统且充当关于疾病的标记。然而，此类过程信号也响应血样制备的效应。仅通过针从血管中抽取血液或使血液暴露于空气可以导致这些机制的非故意活化。例如，改变时间、离心机速度或样品加工步骤的温度可以改变血清或血浆的表观组成，从而使得生理学信息被在收集和加工过程中对样品赋予的分析前可变性掩蔽。由于伴随的稳固性的缺乏，这些过程和蛋白质对蛋白质的样品处理中的微妙变化的强敏感性可以危害其作为生物标记的用途。

在多元生物学中的当前研究努力显示在分析前样品变化(通常称为“批效应)中的强烈兴趣。目前，样品质量可以测定的程度主要限于视觉上明显的改变，例如红色指出红细胞裂解，并且混浊指出高脂质或其他污染物。这限制临床医生可以投入几乎最强健和最稳固的蛋白质测量的信任。证明血清和血浆制剂中的变化的一些复杂和非线性效应的研究在Ostroff，R.等人(2010)J.Proteomics73:649-666中描述。此处提议基于受样品制备方案中的变化影响的特定蛋白质集合的测量的非线性(对数)转化，测定对样品制备方案的顺应性的特定技术。衍生自这些方法的度量可以用于监控顺应性，拒绝样品且作出目的分析物中的校正。这些技术可用于评估在生物标记研究、临床诊断应用、生物库样品质量监控和药物开发中使用的人或动物血样的质量。可以开发类似方法以评价关于许多其他样品类型的样品完整性，所述许多其他样品类型包括尿、脑脊髓液、痰或组织。

发明内容

如本文描述的，关于生物标记开发和达到临床效应所需的理想生物标记测量的关键性质包括可靠性和稳固性。生物标记的可靠性意指生物标记信号在捕获健康或疾病的潜在生物学中是真实的(即，不是“假阳性”标记)。生物标记的稳固性指出相对于非患病个体，生物标记在患病个体中是差异表达的。为了增加发现真实疾病生物标记的概率，且减少由于样品偏差而鉴定假阳性的机会，用于测量样品质量和一致性的方法是必需的。

为了设计评价样品质量的方法，使用涉及样品处理参数的有意操作的多维蛋白质组学实验，进行与血液血清和血浆测量中的分析前变化的过程和机制有关的研究。在这些实验中，发现除了已知直接涉及防御和修复系统过程的蛋白质外，许多蛋白质信号也受样品制备假象影响。进一步地，其他生物标记信号例如基因表达、循环mRNA和代谢产物学可以受样品制备假象影响。

存在于血液中以防御感染、生长且修复血管、用于器官间通讯以及用于代谢供应和需求的每时每刻控制的细胞和酶系统是复杂的。完全理解样品处理方案变化对生物标记测定法的作用全部如何得到调解是不可能的。然而，本发明描述了样品处理方案变化与对收集后样品赋予的可测量改变的关联。

可能想象一些技术对样品处理效应是相对免疫的，但情况并非如此。即使抗体在血液血浆和血清基质的存在下工作良好，并且质谱法可以测量肽和甚至变性的蛋白质，但如果样品中的细胞裂解，或如果血小板脱颗粒，或如果补体系统被活化，则分析物浓度中的急剧改变将在样品已获得后发生，并且任何“高保真度”测量技术将检测到它们。因此，与本文描述的用于测定样品处理变化影响的技术相似的技术可以用于多重测定法形式和除蛋白质外的生物标记。此类测定法形式可以以不同的方式是敏感的，但可以受在样品制备变化方面的相同潜在原因影响。

血液处理和加工中的不同步骤的变化可以显示为以重现性方法影响生物样品。每次生物标记蛋白质测量对与多种样品处理和加工步骤相关的参数的敏感性已使用蛋白质组学阵列进行定量，并且样品处理过程中变化的标记已得到鉴定。样品处理和加工变化已在用于疾病生物标记测量和开发方法的相同多分析物测量测定法内进行定量，以测定哪些处理/加工标记已受影响，并且大约受多少影响。本方法也已使得能够对用于生物标记发现的可接受的样品处理和加工质量度量施加限制。

附图说明

图1A是旋转矩阵的前两个成分的图，其反映在旋转时间和冷冻时间实验上关于PCA的蛋白质变化。细胞虐待(Cell Abuse)样品标记变化(SMV)中的分析物由实心点指出。

图1B是投影矩阵的图，其反映在旋转时间和冷冻时间实验上关于PCA的样品变化。旋转时间由关于点的不同符号指出。第二成分显示从0.5小时到20小时的点的排序，其与血清细胞虐待SMV中的分析物方向相同。

图2A由旋转时间分层的旋转时间和冷冻时间实验的第二PCA成分的盒须图。该图揭示第二成分与旋转时间强相关。随着旋转时间增加，与半小时时间点的距离增加。

图2B是显示血清细胞虐待SMV测量相同的旋转时间效应的盒须图。必须指出PCA系数的记号是任意的；在这种情况下，系数应解释为与半小时时间点的相对距离。

图3是关于由场所分开的临床研究的PCA主成分的盒须图。这个成分揭示场所之间的差异，提示即使当收集方案意欲为相同的，它们在样品收集质量中也不同。因为PCA任意给予系数记号，所以与图2A中的系数不同，系数是渐增的；分析物变化在两个数据集中处于相同方向。

图4A、4B和4C显示在多收集场所癌症研究中的样品变化。图4A是由收集场所分层的细胞虐待SMV中的病例/对照差异的盒须图。图4B是由收集场所分层的补体SMV中的病例/对照差异的盒须图。图4C显示针对细胞虐待SMV标绘的补体SMV。关于这些SMV值的可接受范围的示例阈值由虚线指示。

图5A显示旋转矩阵的前两个成分，其反映在标准EDTA血浆管中的SHN收集方案实验上关于PCA的蛋白质变化。细胞虐待SMV中的分析物由实心点显示。

图5B显示投影矩阵，其反映在标准EDTA血浆管中的SHN收集方案实验上关于PCA的样品变化。衍生自相同个体的样品由相同符号表示。样品排列到三个柱内，其具有来自每个样品的单份样品，只有一个例外；这些组代表三种收集方案。实心点代表在质量条件下收集的重复内部控制。

图6A是由样品收集方案分层的标准EDTA血浆管上的第一PCA成分SHN实验的盒须图。

图6B是对相同方案计算的血浆细胞虐待SMV的盒须图，其非常类似于图6A中的第一主成分。

图7是关于具有不同收集至离心时间的样品，血浆血小板SMV相对于血浆细胞虐待SMV的图。

图8A显示旋转矩阵的第二和第三成分，其反映在标准EDTA血浆管中的SHN收集方案实验上关于PCA的蛋白质分布。这些蛋白质与样品收集无关，而是与研究中的十个个体之间的群体变化有关。

图8B显示投影矩阵，其反映在标准EDTA血浆管中的SHN收集方案实验上关于PCA的样品变化。来自相同个体的样品是有带圆圈的，并且对男性和女性给予不同符号。

图9标绘血浆细胞虐待SMV对测试集样品的应用。虚线代表随着从收集到通过离心的血浆分离的时间延长，在血浆细胞虐待SMV中的改变。测试集在关于这种SMV可接受的范围内，并且揭示在2小时的旋转时间中的一致峰，在24小时周围的较小量，和在这两个时间点之间的大比例样品。

图10A显示旋转矩阵的前两个成分，其反映在剪切实验上关于PCA的蛋白质变化。该图揭示两个主要变化方向：血清相对于血浆和剪切(细胞虐待)。

图10B显示投影矩阵的前两个成分，其反映在剪切实验上关于PCA的样品变化。该图揭示两个主要变化方向：血清相对于血浆和剪切(细胞虐待)。每个样品由它被剪切的次数标记。

图11A显示血清细胞虐待SMV评分相对于剪切(细胞虐待)量，所述剪切通过使血清样品多次经过针来完成。这个图显示随着细胞虐待量增加，在测量的细胞虐待中的增加。

图11B显示血浆细胞虐待SMV评分相对于剪切(细胞虐待)量，所述剪切通过使血浆样品多次经过针来完成。这个图显示随着细胞虐待量增加，在测量的细胞虐待中的增加。

图12A显示旋转矩阵的前两个成分，其反映在TRAP活化实验上关于PCA的蛋白质变化。该图揭示两个主要变化方向：旋转时间和血小板活化。

图12B显示投影矩阵的前两个成分，其反映在TRAP活化实验上关于PCA的样品变化。该图揭示两个主要变化方向：旋转时间和血小板活化。

图13显示对于TRAP处理的样品和对照，血浆血小板SMV相对于以小时表示的旋转时间的散布图。TRAP处理的样品具有恒定高水平的测量的血小板活化。未经处理的对照具有初始低水平的测量的血小板活化，其随着旋转时间增加。

图14显示在冷冻后的强旋转对血浆细胞虐待SMV评分和血小板活化的作用。

具体实施方式

现在详细参考本发明的代表性实施方案。虽然本发明与例举的实施方案结合描述，但应当理解本发明并不预期限制于这些实施方案。相反，本发明预期涵盖所有替代方案、修饰和等价物，其可以包括在如由权利要求定义的本发明的范围内。

本领域技术人员将认识到与本文描述的那些相似或等价的许多方法和材料，其可以用于本发明的实践中并且在本发明实践的范围内。本发明决不限于所述方法和材料。

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管现在描述了优选方法、装置和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实践或测试中。

本申请中引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请指出本申请所属一个或多个领域的技术水平。本文引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请在此引入作为参考，其程度与每个个别出版物、公开专利文件或专利申请特别并个别指出引入作为参考相同。

如本申请包括所附权利要求中使用的，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，并且可与“至少一个/种”和“一个或多个/一种或多种”互换使用。因此，提及“适体”包括适体混合物，提及“探针”包括探针混合物等等。

如本文使用的，术语“约”代表无关紧要的数值修饰或变化，从而使得数值与其有关的项目的基本功能未改变。

如本文使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化，预期涵盖非排他性包括，从而使得包含、包括或含有元件或元件列表的过程、方法、方法的产品(product-by-process)或物质组合物不包括仅这些元件，而是可以包括未明确列出或者此类过程、方法、方法的产品或物质组合物固有的其他元件。

如本文使用的，“生物标记”用于指这样的靶分子，其指示个体中的正常或异常过程或者个体中的疾病或其他状况，或是个体中的正常或异常过程或者个体中的疾病或其他状况的征兆。更具体而言，“生物标记”是与特定生理学状态或过程的存在相关的解剖学、生理学、生物化学或分子参数，无论是正常的还是异常的，并且如果是异常的，则无论是慢性还是急性的。生物标记是可通过多种方法包括实验室测定法和医学成像检测和测量的。当生物标记是蛋白质时，还能够使用相应基因的表达作为生物样品中的相应蛋白质生物标记、或编码生物标记的基因的甲基化状态或控制生物标记表达的蛋白质的量或存在或不存在的替代量度。

关于特异性疾病状态的生物标记选择涉及首先鉴定这样的标记，与关于特异性医学应用的对照群体相比较，所述标记在疾病群体中具有可测量和统计上显著的差异。生物标记可以包括分泌或脱落的分子，其与疾病发展或进展平行，并且从受疾病或状况影响的组织或者响应疾病或状况从周围组织和循环细胞容易地扩散到血流内。它们还可以包括由细胞响应肿瘤制备的蛋白质。鉴定的生物标记或生物标记集一般是临床上验证的，或显示为用于它就其选择的原始预期用途的可靠指示物。生物标记可以包含多种分子，包括小分子、肽、蛋白质和核酸。影响生物标记鉴定的关键问题中的一些包括可用数据的过拟合和数据中的偏差包括样品处理方案变化。

如本文使用的，“生物标记值”、“值”、“生物标记水平”和“水平”可互换使用，以指这样的测量，其使用用于检测生物样品中的生物标记的任何分析方法作出，并且指示生物样品中的生物标记、关于生物样品中的生物标记或对应于生物样品中的生物标记的存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴度、水平、表达水平、测量水平的比等等。“值”或“水平”的确切性质取决于用于检测生物标记的特定分析方法的具体设计和组分。

“疾病生物标记对照范围”或“生物标记对照范围”可互换使用，并且意指在非患病或正常个体中的生物标记的正常或非疾病范围。它们通常衍生自对照群体。

“样品”、“病例”或“测试集”可互换使用，并且意指这样的个别或病例患者，其怀疑患病或可能患病并且可以最终测定为患病或非患病的。

如本文使用的，“样品处理和加工标记”、“处理/加工标记”、“对样品处理和加工方案中的变化敏感的标记”、“对分析前可变性敏感的标记”等等可互换使用，以指这样的标记，其已通过本文描述的方法发现对样品处理和加工方案中的变化是敏感的。“样品处理和加工标记”可以包括或不包括生物标记。

样品处理和加工标记可以由正常个体的对照群体中的候选标记鉴定。得自所述对照群体的样品就候选标记进行分析，以选择对样品处理和加工方案中的变化敏感的候选标记。变化包括但不限于在样品测定前，在样品加工时间、加工温度、贮存时间、贮存温度、贮存器皿组成和其他贮存条件中的变化；在用于从正常个体中提取样品的方法中的变化，包括但不限于样品对氧的暴露、用于静脉穿刺的针的孔大小、收集装置、收集管添加剂；样品加工中的变化，其包括但不限于离心速度、温度和时间，过滤和滤器孔径；收集容器或器皿、冷冻方法；等等。鉴定为对变化基本上敏感的这些候选标记有资格作为样品处理和加工标记。候选标记包含多种分子包括小分子、肽、蛋白质和核酸。

在一些情况下，可以希望在测定法中区分所选处理/加工标记，以去除还可以是疾病标记或关于所讨论的特定疾病的标记的那些。另一方面，如果待使用的处理/加工标记数目很大，例如大于约20、30、50或更多中的任何，则在此类情况下可能无需消除处理/加工标记。

如本文使用的，在本文中可互换使用的“测定”、“检测”等等指使用任何合适方法的分子检测或定量(测量)，所述方法包括荧光、化学发光、放射性标记、表面等离子体共振、表面声波、质谱法、红外光谱法、拉曼光谱法、原子力显微镜检查、扫描隧道显微镜检查、电化学检测方法、核磁共振、量子点等等。“检测”及其变化指生物样品中分子的存在的鉴定或观察，和/或分子值的测量。

如本文使用的，“生物样品”、“样品”和“测试样品”在本文中可互换使用，以指得自或另外衍生自个体的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆、血清和在滤纸上收集的干燥血斑)、痰、泪、粘液、鼻洗涤物、鼻抽吸物、呼吸物(breath)、尿、精液、唾液、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、胸膜液、腹膜液、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、腹水、细胞、细胞提取物和脑脊髓液。这还包括实验上分离的前述全部的级分。例如，血样可以分级成血清或含有特定类型血细胞例如红血细胞或白血细胞(白细胞)的级分。需要时，样品可以是来自个体的样品组合，例如组织和流体样品的组合。术语“生物样品”还包括例如含有匀浆化固体材料的材料，例如来自粪便样品、组织样品或组织活组织检查。术语“生物样品”还包括衍生自组织培养或细胞培养的材料。可以采用用于获得生物样品的任何合适方法；示例性方法包括例如放血、拭子(例如颊拭子)、灌洗、吸液和细针抽吸活组织检查程序。还可以例如通过显微解剖(例如激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱洗涤、涂片(例如PAP涂片)或导管灌洗收集样品。得自或衍生自个体的“生物样品”包括任何此类样品，其已在得自个体后以任何合适方式进行加工。

进一步地，应认识到生物样品可以通过从许多个体获得生物样品且合并其或合并每个个体的生物样品的等分试样而获得。

“细胞虐待”包括但不限于细胞污染、细胞裂解、细胞破碎、细胞片段、内部细胞组分等等。

如本文使用的，“拒绝样品”可以指拒绝样品所属的子集、组或收集物。

如本文使用的，“SOMAmer”或“缓慢解离速率修饰的适体”指具有改善的解离速率特征的适体。可以使用名称为“Method for Generating Aptamerswith Improved Off-Rates”的美国公开号2009/0004667，现在的美国专利号7,947,447中所述的改善SELEX方法生成SOMAmer。

在本申请中，关于样品处理和加工的标记蛋白质的测量已得到测量且发现具有关于样品收集和制备中的变化的确定和重现性行为。这些行为中的许多可以在血液组分的生物学方面加以理解。例如，PF4、凝血酶敏感蛋白和Nap2在血小板活化时释放，并且它们的行为可以通过改变血样处理和加工参数的实验进行跟踪。此处的中心思想是使用可以在每种样品中进行测量的许多加工和处理标记蛋白质中的许多，以提供对样品收集和样品制备步骤中的变化的分级应答。在这个意义上，这些处理/加工标记蛋白质信号可以例如用于监控血样加工中的过去事件，例如在离心、离心时间和加速前的延迟，分离血样组分的效率和冷冻前的时间。这不同于直接监控目的生物标记蛋白质的降解，并且可以是更敏感的和在广泛范围上提供信息的。通过使用本文描述的方法，通过将处理/加工标记对于每个过程变化的已知敏感性应用于生物标记的估计值，可能可以表征关于特定目的生物标记蛋白质抽取后的改变的样品质量。通过从表观蛋白质浓度中扣除样品处理成分，样品加工和处理标记的监控还可以用于校正在疾病生物标记中每个变化的估计效应。在通过多种测量系统包括抗体测定法、质谱法等等评价疾病的生物标记之前，这些样品处理和加工生物标记测量可以用于表征样品。

以这种方式，血液的生物学机制中的一些用于充当时钟、定时器和记录装置。为了这种技术起作用，我们必须能够区分多种机制的体内生物活化，和在血液已离开机体后发生的活化，或“体外”改变。用于区分体内疾病生物标记和处理/加工标记降解与体外遭受的那些的主要工具是同时测量非常多蛋白质的能力，从而使得样品不仅可以对于单一样品处理/加工变化进行表征，还可以对于几种样品处理/加工变化进行表征。指示特定样品处理方案变化的关联蛋白质测量提供样品处理/加工标记的实验对象组。例如，缓慢离心速度未能去除来自血清或血浆样品的血小板，并且因此影响以可预测方式从血小板中释放的蛋白质的测量，但响应疾病状态在体内的血小板活化还将影响释放的血小板颗粒蛋白质，如体内或收集后的凝固途径的部分活化一样。进一步地，浆细胞将通过低离心力保留在血浆或血清中，如内部(非颗粒)血小板蛋白质一样。因此，血小板颗粒蛋白质信号的解释还可能要求与其他证据的整合，所述其他证据例如样品细胞计数、供体的疾病状态、样品处理/加工标记值等等。这个整合通过将用于样品的多变量蛋白质测量投影到由4-10个基础向量组成的向量空间内进行，所述基础向量各自通过关于一些30-100种蛋白质的系数测定，所述蛋白质已发现在定量样品处理和加工变化程度中是最有用的。样品在由这些基础向量决定的空间中改变的程度形成关于样品在其在收集点(例如血管)和实验室之间的旅程(journey)时的错误处理的代替。这些向量的许多蛋白质组分是关联的，并且可以组合实验对象组，以代表由可变样品收集和加工赋予的改变。类似地，与本文鉴定的样品处理/加工标记关联的新处理/加工标记可以随着蛋白质组学技术扩展而发现。

主成分分析(PCA)用作鉴定与样品处理和加工变化关联的标记的方法。PCA是通过进行因素间的协方差分析减少数据维数的方法。像这样，它适合于多个维度例如蛋白质或基因表达中的大型实验中的数据集。PCA使用正交变换，以将可能关联的变量的观察集合转换为称为主成分的不相关变量的值集合。它用作探索性数据分析和用于制备预测模型的工具。PCA的中心思想是减少由大量相关变量组成的数据集的维数，同时尽可能多地保留数据集中存在的变化。这通过变换为新变量-主成分(PC)集合来实现，所述新变量是不相关的，并且这样排序，从而使得前面少数保留原始变量的全部中存在的大多数变化(Joliffe IT.(2002)Principal Component Analysis，第2版.Springer)。

通过评估少数样品以发现在一个或多个场所处或在样品的一些级分中的样品处理和加工技术将使得难以测量目的生物标记蛋白质中的差异，通过我们的系统在每个样品上递送的度量使得能够拒绝来自临床场所的样品集。即，度量允许测定所讨论的样品是否将由于样品处理效应而隐瞒健康或疾病的真实生物学，或样品处理效应是否将产生“假阳性”生物标记结果，其并非实际上反映健康或疾病的潜在生物学。样品收集/加工度量也已提供关于可靠和稳固生物标记发现的窗口。通过选择具有一致样品制备度量的样品组，非故意的偏差可以降到最低并且疾病特异性生物标记发现得到增强。通过与良好校正的标准样品相比较，该度量还可以用于校正轻度样品处理效应。在临床使用中，样品处理度量可以用于就其收集程序对场所提出建议，以便在广泛进一步评估前拒绝一些样品，并且以便调整提供的测量或报告，以反映由于样品处理的任何不确定性。

简言之，目前能够：

1.测定样品间的样品处理变化的形式且定量程度。这允许样品集进行分流且分离出适合于生物标记发现的样品。

2.鉴定或确定优选样品处理/加工方案，以基本上减少样品中的变化或使样品中的变化降到最低。

3.类似地，收集场所或样品分批的样品处理/加工值可以与参考样品处理/加工生物标记值相比较，以测定个别场所是否顺应优选收集方案。

4.样品集可以进行检查且与参考样品处理/加工生物标记值相比较，以测定可以存在于病例和对照样品之间的预期的处理和加工变化程度。以这种方式，可以选择样品子集用于在相似样品收集条件的基础上比较，从而使得鉴定的生物标记是潜在生物学的可靠反映。

5.如果测定样品未以顺应优选样品处理/加工方案的方式进行收集，则个别样品可以对于诊断测试加以拒绝。

6.可以调整一个或多个病例样品的蛋白质测量，以反映样品处理/加工可变性。

7.可以选择对样品处理/加工方案可变性较不敏感的稳固蛋白质子集用于临床或商业用途。

因此，本发明包括用于定量来自理想血样收集条件的偏差效应的方法。这种方法包括在蛋白质组学测定法测量前，鉴定受涉及血样抽取和处理的步骤中的变化影响的生物学过程。这些生物学过程通过特定分析物(例如蛋白质)测量列表监控，所述分析物由此类过程独特鉴定且可以加以监控。使用对于待测量的每种蛋白质特异性的蛋白质系数，使用蛋白质丰度的对数测量投影定量应用这些蛋白质列表。来自这些投影的称为样品加工标记SMV(样品标记变化)的评分可以用于评价在每个样品和每组样品的基础上的程序变化血样收集。

在一个方面，本发明保护通过其产生SMV系数的方法。具体地，已鉴定了用于定量来自理想血样收集条件的偏差效应的方法。这种方法包括在蛋白质组学测定法测量前，鉴定受涉及血样抽取和处理的步骤中的变化影响的生物学过程。这些生物学过程通过特定例如蛋白质测量列表监控，所述分析物由此类过程独特鉴定且可以由我们加以监控。使用对于待测量的每种蛋白质特异性的蛋白质系数，使用蛋白质丰度的对数蛋白质测量投影定量应用这些蛋白质列表。来自这些投影的称为SMV的评分可以用于评价在每个样品和每组样品的基础上的程序变化血样收集。这些生物学过程可以用于监控血样收集条件中的变化，并且特定蛋白质向量可以用于监控且定量此类生物学过程。这提供了样品收集变化的定量，所述样品收集变化在样品自身中记录，并且在收集时无需独立监控变量例如时间、温度、离心速度。

为了鉴定SMV蛋白质组分，使用靶向实验，其涉及特定生物学过程的生物化学操作，例如补体活化、血小板活化和细胞裂解。这些实验与以与临床实践一致的方式改变血样收集条件的实验组合，以独特地鉴定可以用于在每个样品的基础上定量评估临床样品收集中的变化的生物学过程。

本文描述的技术可以用于关于直接涉及这些生物学过程的蛋白质测量的质量评估样品。这提供了样品质量的定量测量，其可以应用以告知关于这些样品中的蛋白质测量的决定，所述蛋白质可以受样品处理变化影响，而不是简单地直接与此处测量的生物学过程联系。例如，一般蛋白裂解活性可以受补体活化和细胞裂解影响。然而，受累蛋白质不形成简单的闭合组或过程，并且无法用于监控补体和细胞裂解，因为其他蛋白质可以具有在样品之间变化的多种原因，其与样品处理变化不相关，例如疾病过程或肾功能。

本发明是具有系数的蛋白质集合监控生物学过程和间接地监控样品收集条件中的变化的用途，其具有超过单一蛋白质的优点，因为它不太可能遭受个体变异的缺点，并且形成可以解释为给出生物学过程活化的稳固估计量的测量总体。对数尺度测量的使用允许监控生物学过程活化中的相对倍数变化，并且可以使用对应于线性空间中的比的差异，简单地与参考样品相比较。这种对数的使用还无疑这样标定蛋白质测量，从而使得当使用参考样品时，在集合或向量中的蛋白质之间的不同浓度范围自动标准化。

SMV计算对个体血样的直接应用提供了这样的评分，其可以在生物学过程方面或间接地在特定样品收集条件与参考样品的理想条件的偏差方面加以解释。这些评分随后可以用于限定哪些样品符合标准或落入可接受限度内。这个信息可以用于拒绝个别样品。拒绝个别样品在生物标记发现过程中是重要的，以便避免将蛋白质丰度中的变化指定至其处于关于生物标记发现的研究下的疾病或过程，当此类变化可能已在不同样品收集方案或条件下，由待处理样品的个别集合的一些集合引起时。

关于个别样品的SMV评分可以用于分组样品集，其对应于样品收集参数的特定范围。这允许限定匹配样品集，其中来自一个集合的样品具有与来自先前或不同收集研究的样品可比较的样品收集程序和参数。这个形成匹配集合的能力在比较可以在不同条件下收集的样品组之间中是无价的。如果可以测定其他蛋白质中的关联变化，则由个别样品计算的SMV评分还可以用于校正样品处理中的变化，并且基于受过程影响的每种蛋白质中的变化构建数学模型，导致具有不同SMV评分的样品间变化。

在其SMV评分基础上的个别样品拒绝允许进行更敏感的生物标记发现，因为我们已知由临床上不同的个体收集的样品间的差异指这些个体间的差异，而不是样品如何收集中的差异。如果该变化是由于通过其收集血样的程序，而不是由于个体的临床状态，则涉及蛋白质丰度的诊断测试可以是误导的。这通过拒绝不满足SMV评分阈值的样品得到避免，所述SMV评分阈值对应于合理的样品收集程序变化。

许多现有样品收集物被样品收集程序中的变化系统损害。SMV评分可以用于定量样品收集物内或样品收集场所之间的此类变化，并且可以用于在可能误导研究者的变化基础上拒绝整个研究，所述变化例如病例和对照之间的样品收集物中的系统变化。需要仅待测量收集物的子集以评价此类变化；在样品收集物视为无法接受的情况下，大量节省是可能的。还能够监控在研究的样品采集阶段过程中的样品收集物，因此提供正确建议且检测对研究方案的不顺应性。为了监控现有或进行中的研究中的变化，仅需要测量整个收集物的一些子样品。

用于监控和评价样品收集变化的这些技术可以应用于研究方案的最佳化，并且可以应用于大量样品收集努力例如生物库的经济最大化，其中采用专门样品收集设备和器皿的成本可以与由于使用较不昂贵的方案操作的变化的准确评价和损害相比较。

在一些情况下，不能获得原始样品收集物，可能是由于生物样品的最常见收集物的回顾性质。另外，一些比较可能必然在不同场所收集的样品之间和在不同时间收集的样品组之间发生。这些样品收集物将显示收集程序中的差异，所述差异将引起蛋白质组学谱中的变化，其将由预期的差异临床比较混淆。通过在样品组之间产生匹配集合，能够比较等价收集物的样品子集。

因此，本发明包括鉴定可用于定量样品质量的样品处理/加工标记的方法，其中该方法包括(a)测定当处理/加工方案改变时，差异表达的第一分析物集合；(b)测定这样改变的那些分析物子集，从而使得分析物测量与应用的变化程度平滑或线性相关，其中子集可以含有与第一分析物集合相比较相同或更少的分析物；(c)针对样品处理方案中的变化和来自子集的分析物测量之间的依赖性构建定量模型；和(d)基于步骤(c)的定量模型，提供关于每个样品的度量或评分。

本发明还包括鉴定可用于定量样品质量的样品处理/加工标记的另一种方法。这种方法涉及(a)测定当特定生物学过程在实验上活化或改变时，差异表达的第一分析物集合，其中所述生物学过程可以包括但不限于血小板活化、细胞裂解、补体活化或凝固；(b)测定改变的那些分析物子集，其中子集的分析物测量与应用于样品的生物学过程的实验活化程度平滑或线性相关，并且其中子集可以含有与第一分析物集合相比较相同或更少的分析物；(c)针对应用于样品的生物学过程的实验活化程度和来自子集的分析物测量之间的依赖性构建定量模型；和(d)基于步骤(c)中的定量模型，提供关于每个样品的度量或评分。

在相关实施方案中，本发明包括鉴定可用于定量样品质量的样品处理/加工标记的方法，其包括：(a)测定(i)当处理/加工方案改变时，或(ii)当特定生物学过程在实验上活化或改变时，差异表达的第一分析物集合；

(b)测定改变的那些分析物子集，其中分析物测量与下述平滑或线性相关：(i)应用的处理/加工方案变化的程度，或(ii)应用于样品的生物学过程的实验活化程度；

其中子集可以含有与第一分析物集合相比较相同或更少的分析物；(c)针对下述构建定量模型：(i)样品处理方案中的变化和来自子集的分析物测量之间的依赖性；或(ii)应用于样品的生物学过程的实验活化程度和来自子集的分析物测量之间的依赖性；和(d)基于步骤(c)的定量模型，提供关于每个样品的度量或评分。

本发明进一步提供了测定样品的样品质量的方法。这种方法包括(a)提供如通过前述方法获得的样品的样品处理/加工标记；(b)应用如通过前述方法测定的定量模型，以提供关于这种样品的度量或评分，其中此类评分指出通过方法产生的样品与优选方案的偏差程度；和(c)使用该评分用于下述应用中的任何：

(i)拒绝或接受样品用于诊断目的；

(ii)拒绝或接受样品用于生物标记发现应用；

(iii)通过与参考样品比较，测定与样品处理方案的变化程度；

(iv)校正样品处理方案中的变化；

(v)拒绝样品，由此可以提供用于生物标记发现的可接受样品组；和/或

(vi)拒绝样品以避免诊断测试设置中的误导结果。

还提供的是用于选择适合于生物标记发现的样品子集的方法，其包括(a)计算在预期用于生物标记发现的集合中关于每个样品的定量度量；(b)拒绝步骤(a)的未能满足关于定量度量的可接受范围的样品；和(c)拒绝步骤(a)的显示在度量和靶向用于生物标记发现的生物区别之间的关联的样品。

提供了用于选择适合于生物标记发现的样品子集的另一种方法。这种方法包括(a)计算关于来自多个样品收集物的每个样品的定量度量；(b)从收集物中选择满足可接受度量的常见范围的样品；和(c)拒绝显示在度量和靶向用于生物标记发现的生物区别之间的关联的样品组或收集物用于比较。

在相关实施方案中，本发明提供了用于选择适合于生物标记发现的样品子集的方法，其包括：(a)计算关于每个样品的定量度量：(i)对于在预期用于生物标记发现的集合中的样品，或(ii)来自多个样品收集物；(b)从步骤(a)选择：(i)满足关于定量度量的可接受范围的集合样品，或(ii)来自满足可接受度量的常见范围的收集物子集的样品；和(c)拒绝步骤(a)的显示在度量和靶向用于生物标记发现的生物区别之间的关联的样品。

进一步提供的是用于拒绝整个收集物的方法，其包括(a)选择样品子集，其中子集包含收集物的所有样品或其随机子集；(b)计算关于子集中的每个样品的定量度量；(c)测定满足关于定量度量的可接受范围的样品比例或分布；和(d)测定是否拒绝收集物。收集物的拒绝可以基于(i)可接受样品的分布或比例；和/或(ii)目的临床变化和定量度量之间的关联程度。

本发明还提供了改善样品质量的方法，其包括(a)使血浆上清液与个体样品的细胞和细胞组分分离；(b)冷冻血浆上清液；(c)解冻血浆上清液；和(d)进行解冻上清液的第二旋转，由此产生具有改善质量的样品。旋转通过关于全血的离心旋转和/或强旋转(强旋转(hard spin)定义为具有大于2500g10分钟的速度时间乘积的旋转)提供。

此类解冻后旋转可用于测量多种(超过20种)分析物/样品的商业服务的背景下。因为在此类服务中，样品收集程序跨越顾客样品可能相当大地改变，并且因为样品先前已冷冻且解冻，其裂解一些细胞，所以以普通临床上应用的加速和时间的离心旋转在去除较小碎片和污染组分中是无效的。

在进一步的实施方案中，本发明包括就其处理/加工标记值可变性筛选样品或样品集的方法，其包括(a)在所述样品或样品集中测定处理/加工标记值，其对应于选自表1的至少N种标记之一，其中N＝2-78；(b)提供参考样品，并且测定对应于测量的样品或样品集处理/加工标记的处理/加工标记值；和(c)比较样品或样品集处理/加工标记值与参考样品的相应处理/加工标记值，由此可以测定样品或样品集的处理/加工标记值可变性。

在相关实施方案中，至少N种标记选自表2，并且N＝2–30。可替代地，至少N种标记选自表3，并且N＝2–52。另外的相关实施方案包括这样的实施方案，其中至少N种标记选自表4，并且N＝2–17；并且其中至少N种标记选自表5，并且N＝2–4。

还提供的是用于测定样品或样品集关于进一步分析的适合性的方法，其另外包括：(a)提供样品或样品集处理/加工标记值可变性，其已通过上文描述的方法获得；和(b)由所述可变性测定样品或样品集是否未超过预定截断值。以这种方式，样品或样品集的适合性由具有不超过截断值的处理/加工标记值的样品或样品集测定。

在相关实施方案中，前述测定样品适合性的方法可以在步骤(b)前包括下述过程步骤：(a.1)获得处理/加工标记值各自的自然对数值；和(a.2)根据预定样品映射向量(SMV)系数加权自然对数值中的每一个，以获得关于样品或样品集的处理/加工标记值各自的乘积。在这个实施方案中，样品是否超过步骤(b)中的预定截断值的测定通过比较样品的加权乘积与截断值来完成。

在另一个实施方案中，本发明包括用于测定优选样品处理和加工方案的方法，其中该方案生成适合于进一步分析的样品。这种方法包括提供如通过本文描述的方法获得的样品处理/加工可变性，随后为：(a)由所述样品处理/加工标记值可变性测定对于方案程序中的变化敏感的标记；和(b)改变方案程序，以使敏感标记的处理/加工标记值可变性降到最低，由此可以测定优选方案。

本发明还包括用于测定样品或样品集对预定收集方案的顺应性的方法，其包括提供如通过本文描述的方法获得的样品处理/加工可变性，随后为：(a)提供已经历预定收集方案的参考样品；(b)由参考样品测定对应于所述至少N种标记各自的截断值；(c)比较每个样品或样品集的处理/加工值与相应截断值；(d)鉴定具有超过截断值的处理/加工值可变性的样品或样品集和不超过截断值的样品或样品集，其中其可变性不超过截断值的所述样品或样品集顺应预定收集方案。

还提供的是用于鉴定至少一种可靠生物标记的方法，其包括：(a)提供通过本文描述的方法获得的适合于进一步分析的样品或样品集，其中样品或样品集各自已知得自患病个体或非患病个体；(b)测定样品或样品集以鉴定至少一种可靠生物标记，其中相对于来自并非患病的个体的样品或样品集中的相应生物标记，所述生物标记在来自患病个体的样品或样品集中基本上差异表达。相对于非患病个体，鉴定为在患病个体中差异表达的标记是可靠生物标记。

在另一个实施方案中，本发明包括使用如通过本文描述的方法获得的适合于进一步分析的样品，用于测定稳固生物标记的方法。这种方法包括：(a)提供来自患病个体和非患病个体的合适样品或样品集；(b)鉴定在来自患病个体的样品或样品集的基本上全部中无法检测的生物标记；(c)将在来自患病个体的样品或样品集的基本上全部中检测到的生物标记鉴定为稳固生物标记。

本发明进一步提供了用于测定包含正常范围或优选截断值的样品质量标准的方法，用于鉴定适合于进一步分析的样品或样品集。这种方法包括(a)提供至少一种对照样品；(b)根据本文描述的方法测定对照样品中的样品/处理标记值可变性；(c)测定对样品处理和加工方案中的变化敏感的处理/加工标记；(d)对于对方案变化敏感的样品处理/加工标记各自，限定用于每种处理/加工标记的正常范围和优选截断值。这提供样品质量标准或优选截断值，并且样品或样品集可以使用优选截断值进行筛选，以鉴定合适的样品或样品集。

在另一个实施方案中，本发明包括在样品或样品集中的样品处理/加工标记偏差的测定。这种方法包括：(a)在根据本文提供的方法提供的合适样品或样品集中，鉴定对样品收集和处理方案中的变化敏感的样品处理/加工标记；(b)提供参考或对照样品；(c)在合适的样品或样品集以及参考样品中，测量所述敏感样品处理/加工标记值；(d)比较测量的样品或样品集处理/加工标记值与参考样品处理/加工标记值；(e)鉴定与参考样品处理/加工标记值不同的样品或样品集的处理/加工标记值；和(f)在与所述参考标记值具有值变化的处理/加工标记中区分模拟疾病生物标记值变化的样品处理/加工标记。区分的模拟疾病生物标记的处理/加工标记是偏差的处理/加工标记。这些偏差的处理/加工标记可以从进一步分析中消除。

还提供的是用于校正样品的测量生物标记值的方法，其包括：(a)测量如通过本文描述的方法提供的样品的处理/加工标记值可变性；(b)相对于参考的处理/加工标记值，鉴定样品的处理/加工标记值中的改变；和(c)相对于参考样品的处理/加工标记值，依照样品的处理/加工标记值中鉴定的改变，校正样品的生物标记测量。

实施例

下述实施例仅提供用于举例说明性目的，并且不意图限制如由所附权利要求限定的本申请的范围。本文描述的所有实施例均使用本领域技术人员众所周知且常规的标准技术进行。下述实施例中描述的常规分子生物学技术可以如标准实验室手册中所述进行，所述标准实验室手册例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(2001)。

实施例1.样品的多路适体分析

本实施例描述用于分析样品和对照的多路适体测定法，用于鉴定表1中阐述的样品收集/加工可变性标记。多路分析利用大约850或1,034种适体，取决于用于生成数据的蛋白质组学阵列的形式。这个蛋白质组学平台的细节可以在Gold L，Ayers D，Bertino J，Bock C，Bock A,等人(2010)Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for BiomarkerDiscovery.PLoS ONE5(12):e15004.doi:10.1371/journal.pone.0015004中找到。

在这个方法中，对于每次溶液添加均更换移液器尖端。

另外，除非另有说明，否则大多数溶液转移和洗涤添加使用BeckmanBiomek Fxp的96孔头部。除非另有说明，否则手动移液的方法步骤使用十二通道P200Pipetteman(Rainin Instruments，LLC，Oakland，CA)。内部制备称为SB17的定制缓冲液，其包含40mM HEPES、100mM NaCl、5mMKCl、5mM MgCl₂、1mM EDTA，pH7.5。内部制备称为SB18的定制缓冲液，其包含40mM HEPES、100mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl₂，pH7.5。除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。

1.适体原液的制备

在1x SB17，0.05％Tween-20中以2x浓度制备关于5％、0.316％和0.01％血清的定制适体原液。

将这些溶液贮存于-20℃下直至使用时。测定法当天，使每种适体混合物在37℃下解冻10分钟，置于沸水浴中10分钟，并且允许冷却至25℃20分钟，伴随在每个加热步骤之间的剧烈混合。在加热-冷却后，将55μl每种2x适体混合物手动移液到96孔Hybaid平板内，并且将平板用箔密封。最终结果是具有5％、0.316％和0.01％适体混合物的三块96孔、箔密封的Hybaid平板。个别适体浓度为2x终浓度或1nM。

2.测定样品制备

将贮存于-80℃下的100％血清或血浆的冷冻等分试样置于25℃水浴中10分钟。将解冻样品置于冰上，轻轻涡漩(设为4)8秒，并且随后再置于冰上。

在4℃下，通过使用50μL8通道跨越移液器(spanning pipettor)将8μL样品转移到96孔Hykiid平板内，制备10％样品溶液(2x终浓度)，每个孔含有72μL适当的样品稀释剂(对于血清，1x SB17，或对于血浆0.8x SB18，加上0.06％Tween-20、11.1μΜZ-block_2、0.44mM MgCl2、2.2mM AEBSF、1.1mM EGTA、55.6μΜEDTA用于血清)。将这块平板贮存于冰上，直至在Biomek FxP机器人(robot)上开始下一个样品稀释步骤。

为了开始样品和适体平衡，将10％样品平板短暂离心并置于BeckmanFxP上，在其中用96孔移液器通过上下移液将它混合。随后通过将6μL的10％样品转移到具有2mM AEBSF的89μL1xSB17、0.05％Tween-20内，制备0.632％样品平板(2x终浓度)。接下来，6μL所得到的0.632％样品在184μL1xSB17、0.05％Tween-20内的稀释制备0.02％样品平板(2x终浓度)。在Beckman Biomek Fxp上完成稀释。在每次转移后，通过上下移液将溶液混合。随后，通过将55μL样品加入55μL适当的2x适体混合物中，将3块样品稀释平板转移至其各自的适体溶液。样品和适体溶液通过上下移液在机器人上混合。

3.样品平衡结合

将样品/适体平板用硅帽垫密封，并且在进行至捕获1步骤前，置于37℃温箱中3.5小时。

4.捕获2珠平板的制备

将MyOne(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)链霉抗生物素蛋白质C1珠的11mL等分试样用等体积的20mM NaOH洗涤2次(对于每次洗涤，温育5分钟)，用等体积的1x SB17、0.05％Tween-20洗涤3次，并重悬浮于11mL1x SB17、0.05％Tween-20中。使用12-通道移液器，将50μL该溶液手动移液到96孔Hyhid平板的每个孔内。随后将平板用箔覆盖，并贮存于4℃下用于测定法中。

5.捕获1珠平板的制备

将三块0.45μm Millipore HV平板(Durapore membrane，目录#MAHVN4550)100μL1x SB17、0.05％Tween-20平衡至少10分钟。平衡缓冲液随后通过平板过滤，并且向每个孔内加入133.3μL7.5％链霉抗生物素蛋白质-琼脂糖珠浆(在1x SB17、0.05％Tween-20中)。为了在将链霉抗生物素蛋白质-琼脂糖珠转移到滤板内时使其保持悬浮，将珠溶液用200μL，12通道移液器手动混合，在移液事件之间至少6次。在将珠跨越3块滤板分配后，施加真空以去除珠上清液。最后，将珠在滤板中用200μL1x SB17、0.05％Tween-20洗涤，并且随后重悬浮于200μL1x SB17、0.05％Tween-20中。将滤板的底部吸干，并将平板贮存用于测定法中。

6.装载Cytomat

使Cytomat装载有所有尖端、平板、槽中的所有试剂(除了在加入平板前立即新鲜制备的NHS-生物素试剂之外)、3块制备的捕获1滤板和1块制备的MyOne平板。

7.捕获1

在3.5小时平衡时间后，将样品/适体平板从温箱中取出，离心约1分钟，去除帽垫覆盖，并置于Beckman Biomek Fxp的平台(deck)上。启动Beckman Biomek Fxp程序。除非另有说明，否则捕获1中的所有后续步骤均由Beckman Biomek Fxp机器人完成。在该程序内，对捕获1滤板施加真空以去除珠上清液。将各100微升的5％、0.316％和0.01％平衡结合反应加入其各自的捕获1滤板，并且使用平台型(on-deck)定轨振荡器以800rpm将每块板混合10分钟。

经由真空过滤去除未结合的溶液。通过分配溶液并立即抽真空以使溶液通过平板过滤，将捕获1珠用在1x SB17、0.05％Tween-20中的190μL100μM生物素洗涤，随后用5x190μL1x SB17、0.05％Tween-20洗涤。

8.加标签

将在无水DMSO中的100mM NHS-PEO4-生物素等分试样(贮存于-20℃下)在37℃下解冻6分钟，并且随后紧在手动加入平台型槽之前，用加标签缓冲液(pH＝7.25的SB17、0.05％Tween-20)1:100稀释，由此机器人将100μL NHS-PEO4-生物素分配到每块捕获1滤板的每个孔内。允许这个溶液在定轨振荡器上伴随捕获1珠振荡以800rpm温育5分钟。

9.动力学攻击和光切割

通过真空过滤去除加标签反应，并且通过向捕获1平板中加入在1xSB17、0.05％Tween-20中的150μL20mM甘氨酸来猝灭反应。经由真空过滤去除甘氨酸溶液，并且将另外1500μL20mM甘氨酸(在1x SB17、0.05％Tween-20中)加入每块平板，并在通过真空过滤去除前，在定轨振荡器上以800rpm温育1分钟。

随后通过下述洗涤捕获1平板的孔：加入190μL1x SB17、0.05％Tween-20，随后立即为真空过滤，并且随后加入190μL1x SB17、0.05％Tween-20，伴随在真空过滤前以800rpm的1分钟振荡。这两个洗涤步骤再重复两次，除了最后一次洗涤不通过真空过滤去除之外。在最后一次洗涤后，将平板置于1mL深孔平板的顶部并从平台上取出，用于以1000rpm下离心1分钟，以在洗脱前从琼脂糖珠中尽可能多地去除多余体积。

将平板放回到Beckman Biomek Fxp上，并向滤板的每个孔内加入在1xSB17、0.05％Tween-20中的85μL10mM DxSO4。

将滤板从平台上取出，置于在BlackRay(Ted Pella，Inc.，Redding，CA)光源下的Variomag Thermoshaker(Thermo Fisher Scientific，Inc.，ffaltham，ΜΑ)上，并且在以800rpm振荡的同时照射5分钟。在5分钟温育后，使平板旋转180度且伴随振荡多照射5分钟。

通过首先将5％捕获1滤板置于1mL深孔平板的顶部并以1000rpm离心1分钟，将光切割的溶液从每块捕获1平板顺次洗脱到共同深孔平板内。随后，将0.316％和0.01％捕获1平板顺次离心到相同的深孔平板内。

10.捕获2珠捕获

将含有合并的捕获1洗脱物的1mL深孔块置于Beckman Biomek Fxp的平台上用于捕获2。

机器人将光切割洗脱物全部从1mL深孔平板转移到含有先前制备的捕获2MyOne磁珠的Hyhid平板上(在经由磁性分离去除MyOne缓冲液后)。

在以1350rpm振荡的同时，使溶液在Variomag Thermoshaker(ThermoFisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)上在25℃下温育5分钟。

机器人将平板转移到平台型磁性分离器站。在去除并弃去上清液前，将平板在磁体上温育90秒。

11.37℃30％甘油洗涤

将捕获2平板移到平台型热振荡器，将75μL1x SB17、0.05％Tween-20转移到每个孔。将平板在1350rpm和37℃下混合1分钟，以重悬浮并加温珠。在37℃下，向捕获2平板的每个孔中转移75μL60％甘油，并将平板继续在1350rpm和3℃下混合另一分钟。机器人将平板转移到37℃磁性分离器，在其中将其在磁体上温育2分钟，并且随后机器人去除并弃去上清液。将这些洗涤再重复2次。

从捕获2珠中去除第三次30％甘油洗涤液后，将150μL1x SB17、0.05％Tween-20加入每个孔内，并在37℃磁体上通过磁性分离去除前，在37℃下以1350rpm振荡温育1分钟。

在磁性分离前，在以1350rpm振荡的同时，使用150μL1x SB17、0.05％Tween-20伴随1分钟温育将捕获2珠最后洗涤一次。

12.捕获2珠洗脱和中和

通过向每个孔加入具有1M NaCl、0.05％Tween-20的105μL100mMCAPSO，从捕获2珠中洗脱适体。使珠伴随以1300rpm的振荡与这种溶液一起温育5分钟。

随后，在将63μL洗脱物转移到在每个孔含有7μL500mM HCl、500mM HEPES、0.05％Tween-20的新96孔平板前，将捕获2平板置于磁性分离器上90秒。在转移后，通过将90μL上下移液五次来机器化混合溶液。

13.杂交

Beckman Biomek Fxp将20μL中和的捕获2洗脱物转移到新鲜的Hybaid平板，并且向每个孔加入含有10x杂交对照掺料的6μL10x AgilentBlock。接下来，将30μL2x Agilent杂交缓冲液手动移液到含有中和样品和封闭缓冲液的平板的每个孔内，并且通过缓慢地手动将25μL上下移液15次将溶液混合，以避免大量气泡形成。将平板以1000rpm旋转1分钟。

定制Agilent微阵列载玻片(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)设计为含有与适体随机区加上一些引物区互补的探针。对于大多数适体，凭经验测定互补序列的最佳长度，并且范围为40-50个核苷酸。对于以后的适体，缺省选择46聚体互补区。探针由聚T接头与载玻片表面连接用于60个核苷酸的总探针长度。

将密封载玻片置于Agilent杂交室内，将各40μL含有杂交和封闭溶液的样品手动移液到每个垫圈内。以预期使气泡形成降到最低的方式使用8通道可调跨越移液器。随后将条形码朝上的定制Agilent载玻片缓慢下降到密封载玻片上(关于详细描述，参见Agilent手册)。

将杂交室上部置于载玻片/背衬夹心上，并将夹紧托架滑动到整个组件上。通过牢固地转动螺旋来夹紧这些组件。

目视检查每个载玻片/背衬载玻片夹心，以确保溶液气泡可以在样品内自由移动。如果气泡无法自由移动，则轻拍杂交室以释放位于垫圈附近的气泡。

将组装的杂交室在Agilent杂交炉中在60℃下以20rpm旋转温育19小时。

14.杂交后洗涤

将约400mL Agilent洗涤缓冲液1置于两个分开的玻璃染色皿的每一个内。将一个染色皿置于磁力搅拌板上，并将载玻片架和搅拌棒置于缓冲液内。

通过将搅拌棒置于空玻璃染色皿内，制备用于Agilent洗涤2的染色皿。

预留第四个玻璃染色皿，用于最终乙腈洗涤。

拆开六个杂交室的每一个。逐个地将载玻片/背衬夹心从其杂交室中取出，并浸入含有洗涤1的染色皿中。使用一对镊子将载玻片/背衬夹心撬开，同时仍浸没微阵列载玻片。将载玻片快速转移到磁力搅拌板上的洗涤1染色皿中的载玻片架内。

将载玻片架轻轻上升且降低5次。磁力搅拌器以低设定开启，并且将载玻片温育5分钟。

当洗涤1剩余一分钟时，将在温箱中预热至37℃的洗涤缓冲液2加入第二个制备的染色皿。将载玻片架快速转移到洗涤缓冲液2中，并且通过将其刮取到染色皿的顶部上，去除架底部上的任何过量缓冲液。将载玻片架轻轻上升且降低5次。磁力搅拌器以低设定开启，并将载玻片温育5分钟。

将载玻片架从洗涤2中缓慢拉出，花费大约15秒以从溶液中取出载玻片。

对于在洗涤2中剩余的一分钟，将乙腈(ACN)加入第四个染色皿。将载玻片架转移到ACN染色皿。将载玻片架轻轻上升且降低5次。磁力搅拌器以低设定开启，并将载玻片温育5分钟。

将载玻片架从ACN染色皿中缓慢拉出，并置于吸水巾上。载玻片的底部边缘快速干燥，并将载玻片置于干净的载玻片盒内。

15.微阵列成像

将微阵列载玻片置于Agilent扫描仪载玻片支架内，并根据制造商说明书装载到Agilent微阵列扫描仪内。

将载玻片在Cy3通道中以5μm分辨率在100％PMT设定下成像，并且XRD选项以0.05启用。所得到的tiff图像使用Agilent特点抽取软件版本10.5进行处理。

实施例2：样品处理/加工标记鉴定和样品处理度量的衍生

在来自从不同临床场所收集的临床研究参与者的血样之间观察到众多差异。这个与样品处理/加工标记相关的适体信号的位点依赖性假定为使用的样品收集方案的直接结果。在使用优选方案的场所之间的样品处理和加工标记中观察到强烈差异。为了更好地理解不同样品收集和加工程序的效应，进行其中改变收集参数的一系列内部实验。这些实验揭示对样品收集方案的扰动导致以协调方式对许多蛋白质的改变。由于这些实验，与特定样品收集和加工方法相关的样品处理和加工标记蛋白质标志得到更全面理解，并且目前能够测量单一样品已如何良好地收集且加工。表1列出与血清或血浆细胞裂解/污染(被称为“细胞虐待”)、血小板污染和补体活化相关的样品处理/加工标记。因此，表1的标记可以充当样品处理和加工标记。前述信息提供样品质量值，其可以用于调整在病例样品中测量的生物标记值。

对临床样品收集敏感的生物标记的鉴定可以通过有意扰乱样品收集中的特定步骤进行鉴定。一些例子包括样品在其下离心的速度，在样品离心前经过的时间，在样品冷冻后经过的时间，和用于抽取样品的针类型。这些临床步骤中的许多是其中两个不同收集场所在其样品制备中可能不同的方式，其可以导致收集物之间的偏差。通常这些差异导致减少样品质量(例如污染或降解)。通过减少这些差异，可能受这些偏差影响的分析物可以得到鉴定，且最终用于定量与适当收集方案的偏差的负面效应。

一旦鉴定受累分析物的大集合，列表就应减少至被认为与单一生物来源相关的稀疏分析物集合，所述单一生物来源无论是生物途径还是生物组分，例如细胞。这可以通过查看分析物的协同变异来完成，以鉴定不与其他分析物共享许多协方差的稀疏集。一旦这个分析物集合得到精炼，掺入关于这些分析物功能的先验知识就可以揭示其生物原因。例如，如果所有分析物均来自相同细胞类型，则提示它们因为这些细胞已裂解而存在于样品中。

使用鉴定的稀疏分析物集合，这些分析物可以掺入定量模型内，所述定量模型将测量由与适当样品收集的偏差引起的对样品的特定虐待的延伸。这个模型在性质中可以是线性或非线性的。可替代地，定量模型还可以进行训练，其将返回样品分类而不是定量测量。这个模型可以用于将样品分流成不同水平的样品质量。

最后，可以进行靶向生物化学实验，以尝试再现效应且有希望地揭示潜在生物学过程，其指定所观察到的分析物标志。例如，如果模型中的分析物就已知涉及血小板活化的蛋白质进行富集，则可以进行有意活化血小板的生物化学实验，以测试模型是否准确测量活化程度。这提供用于验证模型以及提议的变化的生物来源的支持。

示例性定量模型

关于定量模型测量样品处理差异的一个可能性是线性模型，其中每种分析物接受系数。这些系数可以以监督或无监督形式进行训练。在监督训练中，提供了应答变量，并且训练系数以使线性模型和应答之间的误差降到最低。在无监督训练中，未提供应答，并且经由数据中的协方差结构选择系数。使用来自主成分分析(PCA)的装载，下述示例性模型以无监督形式进行训练。它将用于定量下述实施例中的样品处理效应，但仅代表用于测量这些效应的一种单个可能方法。

使用PCA对于每种标记蛋白质衍生的系数在表1中列出。系数列表被称为“样品映射向量”(SMV)。通常应用的SMV在表2–5中列出。随着分析前样品可变性的知识增长，限定新向量是可行的。表2列出用于SMV的处理/加工标记蛋白质和加权，所述SMV测量关于血液血清样品在血细胞中的裂解程度。表3列出处理/加工标记蛋白质和SMV加权，其测量血液血浆样品中的血细胞裂解程度。表4列出处理/加工标记蛋白质和SMV加权，其测量血液血浆样品中的血小板活化。表5列出关于与先天性免疫应答血液补体系统活化相关的处理/加工标记蛋白质的SMV。表2-5中的SMV通过沿样品映射向量计算样品量级用于评估样品，其通过进行限定SMV的蛋白质测量和样品中的相应处理/加工蛋白质测量的点积来完成。这些标记可以组合成样品质量的定量评价，并且应用于未知样品以评价样品完整性。

这些向量由下述程序应用于个别样品：

1.获得给定样品中的样品处理/加工标记蛋白质测量的自然对数。

2.对于每种样品处理/加工标记蛋白质，将来自步骤1的相应对数测量乘以相应SMV加权。

3.合计步骤2所得到的乘积以形成样品质量结果。

在上文程序中对数变换的使用允许测定相对于参考的比例改变。每个病例样品测定法与标准参考样品相比较，从而允许跨越样品集和测定法形式的相对改变而不复杂化。这类似于基因表达研究中的“对数比”测量的常见用途。

下文是SMV如何应用于给定样品以计算SMV评分的形式描述。令S为由系数s_i，i1,…,n组成的m种蛋白质的SMV。令X为具有以log_e RFU单位的p次蛋白质测量的给定样品，其中x_j代表第j次蛋白质测量。因为限定S的蛋白质和X中的测量蛋白质可能不是相同集合，所以X^*和S^*分别定义为X和S的子集，其对应于在X和S之间的n种蛋白质的共同集合。最后，SMV评分C定义为X*和S*的点积。

C = Σ_{k = 1}^{n} s_{k}^{*} x_{k}^{*}

实施例3：旋转时间实验

首批内部样品处理实验之一于2010年公开，并且在改变样品收集的旋转时间和冷冻时间后测量血液中的蛋白质浓度(Ostroff，R.等人(2010)J.Proteomics73:649-666)。旋转样品在3个不同管类型中收集，并且以1300g旋转共15分钟。对于研究中的四个个体/管类型各自，旋转时间值为半小时、一小时、两小时、四小时和二十小时；并且冷冻时间值是半小时、两小时、六小时和二十小时。这些旋转时间和冷冻时间实验的所有组合对于每个管类型的每个个体供应二十种样品。因为该公开，已开发可用于评价样品已受虐待的程度的技术，在很大程度上使用主成分分析(PCA)的变化。PCA是维数减少技术，其鉴定含有以协调方式改变的分析物的样品。通过查看PCA旋转矩阵(分析物空间)和PCA投影矩阵(样品空间)，可以容易地鉴定数据中的变化方向。

图1证实新近发现的样品映射向量方法对先前公开的旋转时间和冷冻时间实验的回顾应用。图1A显示旋转矩阵的前两个成分(柱)的图，并且图1B显示投影矩阵的相应前两个成分。图1B显示样品在两个轴上分开。第一成分(x轴)将样品分成四个垂直组，其对应于研究中的四个个体。查看旋转图(分析物空间)中的第一组分，成为这种个体间变异基础的分析物与主要点簇分开。这两种分析物为滤泡刺激激素和黄体化激素，这两者均已知在男性和女性之间以及个体间改变。这两种分析物为分类器的部分，所述分类器允许区分即使在不知情的样品集中的男性和女性。

受旋转时间影响的分析物对成分2(垂直轴)具有大的负系数。图1B中的样品对于每个旋转时间值已给予不同符号。来自图1A中的血清细胞虐待SMV的分析物已使用实心圆圈突出显示。

样品在成分2上的相对位置指出在该样品中的细胞污染蛋白质标志的量级。图2A显示由旋转时间分组的这些系数的箱图。这个分析物标志随着时间的进展明确显示于该图中。这个相同进展可以在血清细胞虐待SMV中观察到。进展处于相反方向的事实仅是PCA对系数指定任意记号的结果。重要观察是训练的细胞虐待SMV测量经由PCA鉴定的相同蛋白质标志。

实施例4：回顾性研究收集中的样品处理

使用上文描述的方法，我们可以鉴定坚持严格收集方案和未坚持严格收集方案的样品和收集场所。图3显示与多中心回顾性临床研究中的样品收集相关的PCA系数的箱图。每个场所在与样品收集差异相关的主成分上的PCA系数的量级和可变性范围中不同。这充当PCA可以如何用作评价在给定场所处的样品加工质量的工具的例子。

图4显示对于每个样品使用补体SMV和血清细胞虐待SMV映射的血清样品集。在这个大样品集中，来自癌症患者和非疾病对照的血样来自多个研究场所。图4A是显示由收集场所分层的细胞虐待SMV之间的病例对照差异的箱图。该图揭示两个场所之间以及场所内的病例和对照之间的差异。图4B是显示补体活化SMV的具有相同分层的箱图。该图显示在病例和对照之间以及场所间的不同偏差集合。

图4C是补体SMV相对于细胞虐待SMV评分的散布图。当病例和对照个体就生物标记发现进行测定时，实心相对于空心符号差异对应于获得的癌症病例结果相对于对照结果。虚线代表对于质量样品收集强加的阈值的例子。垂直线指示可接受样品的补体活化SMV限制。在该线的右侧是补体活化的水平，其干扰检测生物标记的能力。水平线指示血清细胞虐待SMV限制，可能未在2小时内加工或未适当旋转的举例说明性样品高于该线。可见补体SMV和血清细胞虐待SMV可接受限制是略微独立的，并且因此必须应用血清细胞裂解和补体活化标准。另外，可见实心正方形分离地位于图的上部，而空心正方形处于左底部中的集中点球中。这指出收集场所样品在癌症病例和对照之间未以一致方式收集，并且因此来自这个场所的样品可以从考虑中去除。

实施例5：SMV评估个别样品和样品收集物的应用

SomaLogic Healthy Normal研究(SHN)调查不同样品收集方案对血液蛋白质测量的作用。使用三种不同收集方案和三个不同管类型从十个个体中收集九份样品。所有管均具有2500g共20分钟的初始旋转。在4C贮存24小时或48小时的加工前，不在2小时优选方案(在2小时内等分且冷冻)上的所有管再次以1850g旋转10分钟，并且随后以2500g旋转20分钟。三种方案为：

·2小时(优选方案)：在收集2小时内旋转、分离且冷冻

·在等分和冷冻前的24小时冷藏期

·在等分和冷冻前的48小时冷藏期

对于每种方案，使用三个管类型收集血液：EDTA血浆管、血浆P100管和血清SST管。血浆P100管不同于标准EDTA血浆管之处在于：它含有蛋白酶抑制剂以及机械分离器，所述机械分离器使用物理障碍过滤较大组分例如细胞和血小板。血清SST管也含有障碍，然而，该障碍由基于聚酯的凝胶组成。EDTA管的PCA分析使样品非常良好地聚簇成对应于三种不同收集方案的三个分离组(图5)。对于测定法的每次运行，已包括称为校准物的对照样品，其使用优选方案一式三份运行。在图5B中显示为实心圆圈的这些样品是受最少影响的簇。接下来的两个连续柱式簇(column-wisecluster)分别为24小时和48小时方案。

图6显示对于相同样品集，来自主成分1(图5B)和血浆细胞虐待SMV评分的PCA系数比较。这两个箱图显示随着样品未旋转渐增时间量，细胞虐待SMV正确测量在细胞虐待中的增加。

在图7中，对于SHN研究中的样品，血浆血小板SMV测量针对血浆细胞虐待SMV测量进行标绘。改变单一实验变量(使样品离心前的时间)。在这种情况下，血浆血小板SMV和血浆虐待SMV两者均随静脉穿刺和通过离心的血浆分离之间的时间增加。两种SMV测量均以相似方式受SHN研究中的离心时间影响。

如在旋转时间和冷冻时间实验中观察到的，除样品收集成分之外，还存在分离研究中的个体的群体成分。这在图5中的第二成分上可见，其将相同颜色的三个点分成行。用成分2和3标绘消除或减少样品处理效应。在图8中，样品处理效应的去除使群体中的真实生物学变化能够变得明显得多–生物标记信号变得更可靠。这以两种方式加以证实。首先，来自相同个体的三个点目前以这样的方式聚类在一起，其在图7中不明显(由图8B中来自相同个体的圆圈点指出的)；当同时取样时，在相同个体内的生物学可能比个体间的生物学更相似。其次，性别差异目前在这些样品中被揭示：明确在图底部处分离的点对应于研究中的绝经后女性，其如预期的具有如上讨论的极端升高的LH和FSH值。其他两名女性也具有相对于男性群体更高的水平。还存在具有与女性一样高的PCA系数的单名男性，然而，这是由于碰巧与LH和FSH关联的并非性别相关的其他分析物。因此，两种预期的生物效应(在对象和性别内的一致性)的生物标记通过这个过程得到揭示或改善。

图9证实血浆细胞虐待SMV的应用，以比较未知质量的样品集-测试集与来自SHN研究的具有已知制备时间的参考样品。它显示关于测试集样品的血浆细胞虐待SMV测量的分布。测量看起来在血浆细胞虐待SMV与在24小时内收集的SHN参考样品方面是等价的，并且因此对于生物标记发现目的可以是可接受的。这允许在测定大量样品前从收集物中筛选样品选择，因此节省时间和努力超过运行收集物中的所有样品。测试集样品分布具有多重模态分布，指出可能已存在单个场所内的收集物差异。可以去除形成最右侧峰的仅具有最弱质量的样品，而不是接受或拒绝整个集合或收集物。

实施例6：收集管比较

为了测定多少分析物受不同收集方案显著影响，进行一系列曼-怀二氏(MW)秩和检验。MW检验是非参数检验，其评估一个样品集是大于还是小于另一个样品集。对于每种分析物，评价对于每个个体测量的浓度，以测定它们是否根据收集方案而不同。2小时方案针对24小时收集和48小时收集方案进行测试。

表6显示在该研究中测量的总共868种分析物中，在SHN方案中的值中显著增加或降低的分析物数目。该表中的显著性阈值是FDR校正的小于0.05的p值(q值)。在这个阈值时，P100血浆管对于24小时方案是受最少影响的，仅具有4种受影响的分析物。SST管其次，具有十七种受影响的分析物，并且标准EDTA血浆管具有三十七种受影响的分析物。这支持PCA分析中的观察：P100管的机械障碍比SST血清管的凝胶障碍更有效。关于这三种管的大多数分析物增加，这与细胞污染一致。

当使用48小时收集方案时，受显著影响的分析物数目急剧增加。有趣的是，P100管中受影响的分析物数目超过SST血清管中受影响的分析物数目。这最可能是因为血清样品已经凝固；过程如血小板和补体活化已经运行接近于完成，因此使差异表达的可能性降到最低。另一个有趣观察是相对于2小时方案降低的分析物比例同样已增加。这可能是由于经过48小时冷藏在样品中的蛋白水解。在48小时方案中显著增加的分析物中的急剧增加可能是由于蛋白质通过滤器缓慢回扩散。

实施例7：经由剪切的细胞虐待SMV的实验验证

使用附加至紫色顶部Vacutainer(血浆)或棕黄色顶部Vacutainer(血清)的21号针，通过静脉穿刺获得十四份样品。样品立即经由以大约100ml/分钟通过211/2号针的0、2、3、4、6、8或10次经过进行剪切。将血浆样品立即分配到1.5ml Eppendorf管内，并且以1300g离心10分钟。将血清样品分配到1.5ml Eppendorf管内，允许凝固30分钟，并且以1300g离心15分钟。取出血浆或血清，并在解冻且用SOMAScan Version1-J后续测定前，在-70C下冷冻。

使样品经过211/2号针的剪切效应意欲快速模拟长时间段未经加工的样品中发生的细胞虐待。图10A和10B显示这个实验的前两个主成分的图。图10A显示旋转图，其反映蛋白质中的变化。血清和血浆细胞虐待SMV两者中的分析物均作为实心点指出，而剩余空心点代表剩余分析物。在该图中存在两个主要变化方向，其标记血浆/血清方向和细胞虐待方向。血清相对于血浆方向受涉及血清凝固的蛋白质例如凝血酶控制。另一个方向就细胞虐待SMV中的分析物进行富集。

图10B显示相应投影矩阵，其反映样品中的变化。这显示在血清和血浆样品之间的明确分离，其对应于图10A中的血清相对于血浆方向。另一个方向相对于样品经过针的次数排序血清和血浆样品，尽管一些点略微乱序。这指出这个方向中的蛋白质浓度随着经过针的数目增加而增加。

这个实验揭示随着分析物反复经过针，分析物集合在浓度中增加。此外，这个分析物集合高度富集来自细胞虐待SMV的蛋白质。细胞虐待SMV分析物在前两个主成分中出现的事实证实这种蛋白质标志是该研究中的主要变化来源，并且可以以无监督方式进行鉴定。

图11A和11B分别显示关于血清和血浆的细胞虐待SMV评分。这些图显示随着针诱导的剪切程度增加，在细胞虐待中的明确增加。这个实验证实对于血清和血浆两者的细胞虐待SMV测量细胞虐待和裂解程度的事实。这在无监督(图10)和监督(图11)方法两者中均观察到。

实施例8：经由TRAP活化的血浆血小板SMV的实验验证

使用附加至紫色顶部Vacutainer的21号针，通过静脉穿刺获得十六份样品。将样品分配(0.5ml等分试样)到含有10uL DMSO的0.5ml Eppendorf管内。将一半样品用在DMSO中的10uL1mM凝血酶受体活化肽(TRAP)(20uM终浓度)处理。样品在室温下温育0、0.5、1、2、4、8、12或20小时，并且在回收和在-70C下冷冻前，以1300g旋转10分钟。将样品解冻且经由SOMAScan Version1-J测定。

图12A和12B显示这个实验的前两个主成分的图。图12A显示旋转图，其反映蛋白质中的变化。血浆细胞虐待SMV中的分析物显示为实心圆圈，并且血浆血小板SMV中的分析物显示为实心三角形。剩余分析物作为空心点指出。在该图中存在两个主要变化方向，其标记血小板方向和时间方向。图12A显示与TRAP活化相关的方向中的分析物高度富集来自血浆血小板SMV的分析物(实心三角形)。此外，如先前观察到的，与时间相关的方向中的分析物高度富集来自血浆细胞虐待SMV的分析物。这支持这两种SMV测量两种不同效应的主张。

图12B显示相应投影矩阵，其反映样品中的变化。这显示在TRAP活化样品和相应对照之间的明确分离。另一个方向与样品旋转前的时间相关。

图13显示对于TRAP处理的样品和对照，血浆血小板SMV相对于以小时表示的旋转时间的散布图。对照样品显示随着时间在血小板SMV评分中的增加，其在约五个小时后达到平台。这提示即使血浆样品含有抗凝剂，样品最终也开始凝固。TRAP活化样品显示一致高的血小板SMV评分，与样品旋转前的时间无关。这提示TRAP的添加立即活化血小板，并且在5小时温育后，活化至对照样品的可比较水平。这个实验显示血浆血小板SMV测量经由TRAP活化的血小板活化。

实施例9：减少样品污染的解冻后强旋转

实验设计为测试在冻融后进行强旋转(4000g共十分钟)以去除来自样品的细胞和血小板污染的功效。比较在冻融前或后应用强旋转的使用标准方案收集的血浆。包括在冻融前进行的强旋转作为用于解冻后强旋转样品的参考，以评价由冻融循环引起的细胞裂解和血小板活化的程度。

使用附加至紫色顶部Vacutainer管的21号针，通过静脉穿刺从单个健康供体中获得血液，并且分成四组：标准、富血小板、剪切和细胞污染的。标准样品(贫血小板)以1300g离心十分钟。富血小板样品以600g旋转五分钟。剪切样品以1300g旋转十分钟，并且随后实施以大致100ml/分钟通过23号针的单次经过，随后返回Vacutainer管。细胞污染的样品以1300g离心十分钟，并且随后将来自细胞/血浆界面的少量材料(血沉棕黄层)故意掺料回上清液内。通过抽吸回收血浆级分。

将每个样品组分成接受不同处理的三个部分。将未经处理的(无强旋转)部分(0.5ml)冷冻，在冻融前无进一步处理。将冷却前强旋转部分置于1.5mlEppendorf管内，并且以4000g离心十分钟，随后冷冻。将解冻后强旋转部分冷冻，解冻且随后在1.5ml Eppendorf管中以4000g离心十分钟。通过抽吸回收所有上清液。所有样品随后均冷冻在-70C下。样品在SOMAScanVersion3上进行分析。

图14A和14B显示这个实验的结果。在两个图中，在冷冻前接受强旋转的标准样品用作参考，并且所有其他SMV评分从其中扣除这个参考值。

图14A显示强旋转对血浆细胞虐待SMV评分的作用。如预期的，标准样品显示所有未经处理的部分的最低细胞污染。其他三个样品组(富血小板、剪切和细胞污染的)均具有在未经处理的部分中高得多的测量水平的测量细胞虐待。在冷冻前的强旋转成功去除在富血小板样品和细胞污染样品组两者中的这个升高的细胞虐待标志。剪切组显示细胞虐待标志中少得多的减少，指出在强旋转前经过针已经使细胞裂解。接受解冻后强旋转的样品部分还显示细胞虐待标志中的减少，然而，其程度与冷冻前的样品旋转不同。这提示一些细胞在冻融过程期间裂解，但在冷冻后应用强旋转仍减少样品中的总细胞污染和潜在裂解。

图14B显示在测量的血小板活化中的相似效应。在标准样品组中，血小板活化对于未经处理的部分很低，并且两种强旋转均使这种标志减少可比较量。如由细胞虐待SMV评分可见的，血小板SMV评分通过在解冻后应用强旋转而大量降低，尽管其程度与在冷冻前应用强旋转时不同。这还提示尽管冻融循环的确活化一些血小板，但在样品已解冻后和在运行测定法前进行强旋转仍具有效用。

这个实验显示解冻后强旋转可以减少样品的细胞污染和血小板活化。尽管细胞和血小板的一些部分受冻融影响，但一些以强旋转能够去除的状态持续。这些发现对于回顾收集尤其有关，所述回顾收集可能已在不希望的收集方案下加工。与这些回顾样品如何良好地收集无关，这项研究显示在解冻后的强旋转导致具有较少细胞污染和血小板活化的样品。

表1

可用作样品处理和加工标记的标记

每个SMV的成员由“X”指定。

表2：关于血清细胞虐待的生物标记和SMV系数

蛋白质	SMV系数
		HSP90AA1	0.1311
HSP90AB1	0.1029
		PAFAH1B2	0.1216
GDI2	0.1704
		CAPN1.CAPNS1	0.1349
MAPK3	0.2045
		RAC1	0.2475
UBE2I	0.2276
		MAPK1	0.1924
IDE	0.1405
		ADRBK1	0.2357
CSK	0.3035
		PRKCI	0.0941
UFC1	0.1167
		GSK3A	0.1540
PRKACA	0.2391
		RPS6KA3	0.1901
CASP3	0.1996
		MAPKAPK3	0.1794
PPIA	0.2163
		MDH1	0.1847
NACA	0.1025
		PRDX1	0.1269
ACP1	0.0436
		RPS7	0.0959
STIP1	0.0573
		EIF5A	0.0660
KPNB1	0.2269
		UBE2N	0.2246
HSPA1A	0.1912

表3：关于血浆细胞虐待的生物标记和SMV系数

蛋白质	SMV系数
		HSP90AA1	0.0720
HSP90AB1	0.0596
		PAFAH1B2	0.0582
PRKCA	0.1447
		GDI2	0.0815
CAPN1.CAPNS1	0.0662
		HSPD1	0.1340
MAPK3	0.1466
		RAC1	0.1492
UBE2I	0.1333
		CYP3A4	0.0815
MAPK1	0.1268
		METAP2	0.1161
IDE	0.0701
		METAP1	0.1773
GSK3B	0.1046
		ADRBK1	0.1761
CSK	0.2003
		LYN	0.1725
PIK3CA.PIK3R1	0.0600
		AKT3	0.1457
UFC1	0.0797
		BTK	0.2330
CAMK2D	0.1126
		CA13	0.0630
GSK3A	0.1233
		LYN	0.1857
PRKACA	0.1265
		RPS6KA3	0.1226
CASP3	0.1356
		CD84	0.0687
FYN	0.1016
		MAPKAPK2	0.1050
MAPKAPK3	0.1436
		PAK6	0.1388
UFM1	0.1171
		PPIA	0.1470
DYNLRB1	0.0630
		MDH1	0.1001
NACA	0.0710
		PRDX1	0.0563
TPT1	0.1437
		KPNB1	0.1239
NAGK	0.0623

蛋白质	SMV系数
		PGAM1	0.1404
SNX4	0.0792
		UBE2N	0.1261
HSPA1A	0.0948
		SELP	0.0586

表4：关于血浆血小板活化的生物标记和SMV系数

蛋白质	SMV系数
		BDNF	0.1313
TIMP3	0.2189
		CCL5	0.1726
MMP9	0.1597
		PF4	0.2456
ANGPT1	0.1702
		MDK	0.1195
PPBP	0.2103
		SERPINE1	0.1671
SPARC	0.2307
		APP	0.2429
CTSA	0.1339
		SERPINE2	0.2668
DKK4	0.1536
		THBS1	0.1752
PDGFB	0.2664

表5：关于补体活化的生物标记和SMV系数

蛋白质	SMV系数
		C3	0.0825
C3	0.1369
		C3	0.0665
LTA4H	0.1937

表6：当使用24小时和48小时方案相对于2小时优选方案收集时，显著不同(q值<0.05)的分析物数目(在总共868种中)。

对于每种方案，显示了由于收集方案在浓度中增加或降低的受显著影响的分析物数目。

Claims

1.一种鉴定可用于定量样品质量的样品处理/加工标记的方法，其包括：

a)测定

(i)当处理/加工方案改变时，或

(ii)当特定生物学过程在实验上活化或改变时，

差异表达的第一分析物集合；

b)测定改变的那些分析物子集，其中所述分析物测量与下述平滑地或线性地相关：

(i)应用的处理/加工方案改变的程度，或

(ii)应用于所述样品的生物学过程的实验活化程度；

其中所述子集可以含有与所述第一分析物集合相比较相同或更少的分析物；

c)针对下述构建定量模型：

(i)样品处理方案中的变化和来自所述子集的分析物测量之间的依赖性；或

(ii)应用于所述样品的生物学过程的实验活化程度和来自所述子集的分析物测量之间的依赖性；和

d)基于步骤(c)的定量模型，提供关于每个样品的度量或评分。

2.一种测定样品的样品质量的方法，其包括：

a)针对所述样品提供权利要求1的样品处理/加工标记；

b)应用来自权利要求1的定量模型，以提供关于所述样品的度量或评分，其中所述度量或评分指示通过方法产生的样品与优选方案的偏差程度；和

c)使用所述度量或评分：

(i)拒绝或接受所述样品用于诊断目的；

(ii)拒绝或接受所述样品用于生物标记发现应用；

(iv)校正样品处理方案中的变化；

(v)拒绝样品，由此可以提供用于生物标记发现的可接受样品组；

和/或

(vi)拒绝样品以避免诊断测试设置中的误导结果。

3.一种用于选择适合于生物标记发现的样品子集的方法，其包括：

a)计算关于每个样品的定量度量：

(i)针对在旨在用于生物标记发现的集合中的样品，或

(ii)来自多个样品收集物；

b)从步骤(a)选择：

(i)满足关于定量度量的可接受范围的集合的样品，或

(ii)来自满足可接受度量的常见范围的收集物的子集的样品；和

c)拒绝显示在所述度量和靶向用于生物标记发现的所述生物区别之间的关联的步骤(a)的样品。

4.一种用于拒绝整个收集物的方法，其包括

a)选择样品子集，其中所述子集包含所述收集物的所有样品或其随机子集；

b)计算关于所述子集中的每个样品的定量度量；

c)测定满足关于定量度量的可接受范围的样品比例或分布；

d)基于下述测定是否拒绝所述收集物：

(i)可接受样品的分布或比例；和/或

(ii)目的临床变化和所述定量度量之间的关联程度。

5.一种改善样品质量的方法，其包括：

a)使血浆上清液与个体样品的细胞和细胞组分分离；

b)冷冻所述血浆上清液；

c)解冻所述血浆上清液；和

d)进行所述解冻上清液的第二旋转，由此产生具有改善质量的样品，其中所述旋转是用于全血的临床标准离心旋转和/或所述旋转具有大于2500g10分钟的加速乘积。

6.权利要求5的方法，其中首先在第二旋转前将所述解冻的血浆上清液转移到具有足够强度的管，使得可以经受住增加的重力(g)、旋转时间和径长。

7.权利要求6的方法，其中所述具有足够强度的管是管。

8.一种针对其处理/加工标记值可变性筛选样品或样品集的方法，其包括：

在所述样品或样品集中测定处理/加工标记值，其对应于选自表1的至少N种标记之一，其中N＝2-73；

提供参考样品，并且测定对应于所述测量的样品或样品集处理/加工标记的所述处理/加工标记值；和

比较所述样品或样品集处理/加工标记值与所述参考样品的相应处理/加工标记值，由此可以测定所述样品或样品集的处理/加工标记值可变性。

9.权利要求8的方法，其中所述至少N种标记选自表2，并且其中N＝2–30。

10.权利要求8的方法，其中所述至少N种标记选自表3，并且其中N＝2–52。

11.权利要求8的方法，其中所述至少N种标记选自表4，并且其中N＝2–17。

12.权利要求8的方法，其中所述至少N种标记选自表5，并且其中N＝2–4。

13.一种用于测定样品或样品集用于进一步分析的适合性的方法，其包括权利要求8的方法，并且进一步包括：

提供所述样品或样品集处理/加工标记值可变性；

由所述可变性测定所述样品或样品集是否未超过预定截断值；

由此所述样品或样品集的适合性由具有不超过截断值的处理/加工标记值的所述样品或样品集测定。

14.权利要求8的方法，其中在所述测定步骤前，所述样品或样品集的每个所述处理/加工标记值根据下述步骤进行加工：

获得所述处理/加工标记值各自的自然对数值；和

根据预定样品映射向量(SMV)系数对所述自然对数值中的每一个加权，以获得关于所述样品或样品集的每个所述处理/加工标记值的乘积；

其中每个所述处理/加工标记值的所述比较包括比较其加权乘积。

15.一种用于测定优选样品处理和加工方案的方法，其中所述方案生成适合于进一步分析的样品，其包括权利要求8的方法，并且进一步包括：

a)由所述样品处理/加工标记值可变性测定对于所述方案程序中的变化敏感的标记；和

b)改变方案程序，以使所述敏感标记的处理/加工标记值可变性降到最低，由此可以测定优选方案。

16.一种用于测定样品或样品集对预定收集方案的顺应性的方法，其包括权利要求5的方法，并且进一步包括：

提供已经历所述预定收集方案的参考样品；

由所述参考样品测定对应于所述至少N种标记各自的截断值；

比较每个样品或样品集的所述处理/加工值与所述相应截断值；

鉴定具有超过所述截断值的处理/取样值可变性的样品或样品集和不超过所述截断值的样品或样品集，其中其可变性不超过所述截断值的样品或样品集顺应所述预定收集方案。

17.权利要求10的方法，其中所述进一步分析包括鉴定至少一种可靠生物标记，所述方法包括：

提供适合于进一步分析的所述样品或样品集，其中每个所述样品或样品集已知得自患病个体或非患病个体；

测定所述样品或样品集以鉴定所述至少一种可靠生物标记，其中相对于来自非患病的个体的样品或样品集中的相应生物标记，所述生物标记在来自患病个体的样品或样品集中基本上差异表达；

由此与非患病个体中的相应标记相比较，适合于进一步分析的可靠生物标记是鉴定的在患病状态中具有基本上差异表达的值的标记。

18.权利要求10的方法，其中所述进一步分析包括至少一种稳固生物标记的鉴定，所述方法包括：

提供来自患病个体和非患病个体的合适样品或样品集；

鉴定在基本上全部的来自患病个体的所述样品或样品集中无法检测的生物标记；

将在基本上全部的来自患病个体的所述样品或样品集中检测到的所述生物标记鉴定为稳固生物标记。

19.一种用于测定包含正常范围或优选截断值的样品质量标准的方法，用于鉴定适合于进一步分析的样品或样品集，所述方法包括：

提供至少一种对照样品；

根据权利要求5的方法测定所述对照样品中的样品/处理标记值可变性；

测定对样品处理和加工方案中的变化敏感的所述处理/加工标记；

对于对方案变化敏感的每种所述样品处理/加工标记，限定用于每种所述处理/加工标记的正常范围和优选截断值；

其中所述样品质量标准包含所述优选截断值，并且样品或样品集可以使用所述优选截断值进行筛选，由此可以获得合适的样品或样品集。

20.权利要求10的方法，其中所述进一步分析选自可靠生物标记的测定和稳固生物标记的测定。

21.一种用于测定样品或样品集中的样品处理/加工标记偏差的方法，其包括：

在根据权利要求10的方法提供的合适样品或样品集中，鉴定对样品收集和处理方案中的变化敏感的样品处理/加工标记；

提供参考或对照样品；

在所述合适的样品或样品集以及所述参考样品中，测量所述敏感样品处理/加工标记值；

比较所述测量的样品或样品集处理/加工标记值与所述参考样品处理/加工标记值；

鉴定与所述参考样品处理/加工标记值不同的所述样品或样品集的处理/加工标记值；

在与所述参考标记值具有值变化的所述处理/加工标记中区分模拟疾病生物标记值变化的样品处理/加工标记值；

其中所区分的模拟疾病生物标记的处理/加工标记是偏差的处理/加工标记；和

其中所述偏差的处理/加工标记可以从进一步分析中消除。

22.一种用于校正样品的测量生物标记值的方法，

根据权利要求5的方法测量所述样品的处理/加工标记值可变性；

相对于所述参考的处理/加工标记值，鉴定所述样品的处理/加工标记值中的改变；和

相对于所述参考样品的处理/加工标记值，依照样品处理/加工标记值中鉴定的改变，校正所述样品的生物标记测量。