CN103951640B - 一种化合物及其制备与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种化合物及其制备与用途。该化合物具有式I所示结构，本发明采用计算机模拟与分子对接技术，筛选出式I所示结构的化合物，证实该化合物具有抑制PI3K通路的作用，对肿瘤的生长及活性起到抑制作用，并能够诱导肿瘤细胞的凋亡。实验表明，本发明提供的化合物对PI3K信号通路中的关键酶表达及磷酸化能够起到明显的抑制作用，该抑制作用具有明显的时间依赖性和浓度依赖性，并且，实验证明本发明提供的化合物对其他代谢途径中的关键酶不会发生抑制作用，能够特异性的抑制PI3K信号通路。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种化合物及其制备与用途。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是一种来源于B细胞的恶性肿瘤，近年来新型化疗药物的广泛应用，使多发性骨髓瘤的治疗取得了长足进展。但是该癌症的发病率逐年提高而且呈现出低龄化趋势，癌症数据报告骨髓瘤是第二大血液疾病且目前仍被认定为不可治愈性疾病。由于传统药物的毒副作用以及耐药性的产生，因此急需开发出新型抗骨髓瘤药物。其中基于靶点的药物设计成为创新药物的热点。
磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinases，PI3K)信号通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程，包括细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管新生以及细胞周期的调控。作为受体酪氨酸激酶(RTKs)和G蛋白偶联激酶最主要的下游影响因子，PI3K主要通过磷酸化将上游生长因子和细胞因子传递给胞内信息，这些信息主要激活丝氨酸-酪氨酸蛋白激酶(AKT)和其他一些下游因子如mTOR(themammaliantargetofrapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、P70S6K、4E-BP1。其中，AKT，又称PKB，即蛋白激酶B，处于PI3K通路的中心环节，它在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用。mTOR属于蛋白激酶，在细胞增殖、分化、转移和存活中具有重要地位。P70S6K即为p70核糖体蛋白S6激酶，是促进蛋白质合成的蛋白激酶，与细胞周期中的许多关键过程密切相关。4E-BP1(4E-BindingProtein1)的活性可影响蛋白质翻译、核糖体合成等代谢过程。上述因子中mTOR可磷酸化p70S6K和4E-BP1，从而促进蛋白质合成。
PI3K信号通路在绝大多数人类肿瘤中表达失调，影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，并且与肿瘤的血管形成和侵袭转移以及对化学耐药放疗抗拒密切相关，目前以该通路为靶点的肿瘤治疗倍受关注。因此，开发新型的PI3K信号通路抑制剂来治疗多发性骨髓瘤具有广阔的前景。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种化合物及其制备与用途。本发明提供的化合物具有式I所示结构，能够抑制并干扰PI3K信号通路，从而对肿瘤生长及活性起到抑制作用，并对肿瘤凋亡起到诱导作用。
本发明提供了一种具有式I所示结构的化合物：
其中：
X为O、S、N；
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、烷氧基或取代氨基。
作为优选，本发明提供的化合物结构如式I-a所示：
其中：
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、甲氧基、乙氧基、甲氨基或二甲氨基。
优选的，式I-a所示结构化合物中，Ar为双取代苯基；Ar的取代基为氯、氟、溴。
作为优选，本发明提供的化合物结构如式I-b所示：
其中：
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、甲氧基、乙氧基、甲氨基或二甲氨基。
优选的，式I-b所示结构化合物中，Ar为双取代苯基；Ar的取代基为氯、氟、溴。
作为优选，本发明提供的化合物结构如式I-c所示：
其中：
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、甲氧基、乙氧基、甲氨基或二甲氨基。
优选的，式I-c所示结构化合物中，Ar为双取代苯基；Ar的取代基为氯、氟、溴。
优选的，本发明提供的化合物为：
本发明提供的化合物通过对PI3K途径信号通路的干扰，从而能够实现对肿瘤生长及活性的抑制，并可导致肿瘤的凋亡。通过分子对接技术，本发明提供的化合物中主要的活性官能基团为Ar和其通过形成氢键与目标蛋白结合，从而抑制该蛋白的磷酸化，最终抑制该蛋白的生理活性。
本发明提供的化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将式II所示结构化合物与丙二酸反应制得式III所示结构化合物；
步骤2：将式III所示结构化合物转化为式IV所示结构化合物；
步骤3：将式IV所示结构化合物与2-氰基硫代乙酰胺反应制得式I所示结构化合物；
X为O、S、N；
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、烷氧基或取代氨基。
作为优选，步骤1中反应溶剂为无水吡啶，催化剂为吗啡啉。
作为优选，步骤1中反应的温度为80℃，时间为24h。
作为优选，步骤2具体为：将式III所示结构化合物经甲酯化、还原、氧化制得式IV所示结构化合物。
优选的，甲酯化具体为：将式III所示结构化合物转化为式V所示结构化合物；
X为O、S、N；
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、烷氧基或取代氨基。
优选的，甲酯化的温度为80℃，时间为72h。
优选的，甲酯化的溶剂为DMSO。
优选的，还原具体为，将式V所示结构化合物转化为式VI所示结构化合物
X为O、S、N；
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、烷氧基或取代氨基。
优选的，还原的温度为-78℃，时间为2h～3h。
优选的，还原的还原剂为DIBAL-H，溶剂为THF。
优选的，氧化具体为，将式VI所示结构化合物转化为式IV所示结构化合物
X为O、S、N；
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、烷氧基或取代氨基。
优选的，氧化的氧化剂为MnO2，溶剂为DCM。
优选的，氧化的温度为18～30℃，时间为20～40min。
作为优选，步骤3中反应的溶剂为DCM与甲醇的混合液。
作为优选，在步骤3的反应中还加入吗啡啉作为pH调节剂。
优选的，DCM与甲醇的混合液中，DCM与甲醇的体积比为1:1。
作为优选，步骤3中反应的温度为18～30℃，时间为1h～3h。
本发明提供的化合物用于制备抑制AKT及其下游酶的表达或活化的药物；下游酶为mTOR、P70S6K或4E-BP1。
本发明通过实验证实，本发明提供的化合物能够抑制PI3K活性，从而使AKT及其下游酶的表达量降低；并且，本发明提供的化合物也能够降低磷酸化的AKT及其下游酶的表达量，而AKT及其下游酶的磷酸化会使其活化，因此，本发明提供的化合物能够抑制AKT及其下游酶的活化。并且，研究表明，本发明提供的化合对AKT及其下游酶的表达及活化的抑制作用呈现明显的浓度和时间依赖性。
本发明提供的化合物在制备肿瘤细胞凋亡酶激活剂中的应用；肿瘤细胞凋亡酶为PARP或caspase-3。
本发明通过实验证实，本发明提供的化合物能够有效激活细胞凋亡酶，且呈现明显的浓度和时间依赖性。
本发明提供的化合物在制备PI3K信号通路抑制剂中的应用。
本发明通过实验证实，本发明提供的化合能够特异性的作用于PI3K信号通路，而对其他代谢途径中的关键酶不会起到抑制作用。
本发明提供的化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。
作为优选，肿瘤为白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌、宫颈癌或视网膜母细胞瘤。
优选的，肿瘤为白血病或骨髓瘤。
实验证实，本发明提供的化合物能够有效诱导肿瘤细胞的凋亡或增殖，能够有效抑制肿瘤模型小鼠体内的肿瘤体积增长。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞增殖或诱导肿瘤细胞凋亡的药物，包括本发明提供的化合物及药学上可接受的辅料。
作为优选，药学上可接受的辅料为维生素C、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、氨基酸、葡甲胺、糊精、硬脂酸镁或蔗糖。
作为优选，本发明提供给药物的剂型为注射剂或口服制剂。
优选的，口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
优选的，注射剂为冻干粉针剂或注射液。
本发明采用计算机模拟与分子对接技术，筛选出式I所示结构的化合物，证实该化合物具有抑制PI3K通路的作用，对肿瘤的生长及活性起到抑制作用，并能够诱导肿瘤细胞的凋亡。实验表明，本发明提供的化合物对PI3K信号通路中的关键酶表达及磷酸化能够起到明显的抑制作用，该抑制作用具有明显的时间依赖性和浓度依赖性，并且，实验证明本发明提供的化合物对其他代谢途径中的关键酶不会发生抑制作用，能够特异性的抑制PI3K信号通路。。
附图说明
图1示为化合物C98定性检测谱图；其中：图1-a示化合物C98的氢谱图；图1-b示化合物C98的质谱图；
图2示化合物C98对多发性骨髓瘤细胞生长抑制的效果图；其中：图2-a示不同C98浓度对肿瘤细胞H929的抑制效果；图2-b示不同C98浓度对肿瘤细胞JJN3的抑制效果；图2-c示不同C98浓度对肿瘤细胞KMS11的抑制效果；图2-d示不同C98浓度对肿瘤细胞KMS18的抑制效果；图2-e示不同C98浓度对肿瘤细胞LP1的抑制效果；图2-f示不同C98浓度对肿瘤细胞MM1S的抑制效果；图2-g示不同C98浓度对肿瘤细胞OCI-My5的抑制效果；图2-h示不同C98浓度对肿瘤细胞OPM2的抑制效果；图2-i示不同C98浓度对肿瘤细胞RPMI-8826的抑制效果；图2-j示不同C98浓度对肿瘤细胞U266的抑制效果；
图3示化合物C98对白血病细胞生长抑制的效果图；其中：图3-a示不同C98浓度对白血病细胞K562的抑制效果；图3-b示不同C98浓度对白血病细胞Jurkat的抑制效果；图3-c示不同C98浓度对白血病细胞AML-2的抑制效果；图3-d示不同C98浓度对白血病细胞NB-4的抑制效果；图3-e示不同C98浓度对白血病细胞THP-1的抑制效果；
图4示化合物C98通过流式细胞仪检测其诱导多发性骨髓瘤凋亡的效果图；其中：图4-a示C98浓度为0μM时对LP1细胞凋亡的影响；图4-b示C98浓度为2.5μM时对LP1细胞凋亡的影响；图4-c示C98浓度为5μM时对LP1细胞凋亡的影响；图4-d示C98浓度为0μM时对OPM2细胞凋亡的影响；图4-e示C98浓度为2.5μM时对OPM2细胞凋亡的影响；图4-f示C98浓度为5μM时对OPM2细胞凋亡的影响；图4-g示C98浓度为0μM时对JJN3细胞凋亡的影响；图4-h示C98浓度为2.5μM时对JJN3细胞凋亡的影响；图4-i示C98浓度为5μM时对JJN3细胞凋亡的影响；图4-j示C98浓度为0μM时对OCI-My5细胞凋亡的影响；图4-k示C98浓度为2.5μM时对OCI-My5细胞凋亡的影响；图4-l示C98浓度为5μM时对OCI-My5细胞凋亡的影响；
图5示化合物C98对多发性骨髓瘤细胞凋亡酶PARP和Caspase-3的表达及磷酸化的影响；
图6示化合物C98浓度对多发性骨髓瘤细胞凋亡酶PARP和Caspase-3的表达及磷酸化的影响；
图7示化合物C98处理时间对多发性骨髓瘤细胞凋亡酶PARP和Caspase-3的表达及磷酸化的影响；
图8示化合物C98浓度对AKT表达及磷酸化的抑制作用；
图9示为化合物C98处理时间对AKT表达及磷酸化的影响；
图10示化合物C98对IGF-1诱导条件下AKT表达和磷酸化的抑制作用；
图11示化合物C98浓度对IGF-1诱导条件下AKT表达和磷酸化的影响；
图12示化合物C98处理时间对IGF-1诱导条件下AKT表达和磷酸化的影响；
图13示化合物C98对PI3K信号通路下游相关蛋白表达及磷酸化的影响；
图14示化合物C98对其他通路相关蛋白表达及磷酸化的影响；
图15示化合物C98对异种移植肿瘤体积的影响；其中：图15-a示化合物C98对异种移植OPM2肿瘤体积的影响，曲线1示对照组肿瘤体积变化曲线，曲线2示给药量为80mg/kg/day的肿瘤体积变化曲线；图15-b化合物C98对异种移植JJN3肿瘤体积的影响，曲线1示对照组肿瘤体积变化曲线，曲线2示给药量为40mg/kg/day的肿瘤体积变化曲线，曲线3示给药量为80mg/kg/day的肿瘤体积变化曲线；
图16示C98化合物对异种移植OPM2和JJN3肿瘤组织内AKT的表达及磷酸化影响。
具体实施方式
本发明提供了一种化合物及其制备与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
多发性骨髓瘤细胞：H929、JJN3、KMS11、KMS18、LP1、MM.1S、OCI-MY5、OPM2、RPMI-8226、U266购自AmericanTypeCultureCollection公司：
白血病细胞：K562、Jurkat、AML-2、NB-4、THP-1购自：AmericanTypeCultureCollection公司
本发明通过计算机辅助技术筛选出式I所示结构的化合物具有抑制PI3K信号通路的作用，计算机模拟结果表明，本发明提供的具有式I所示结构的化合物能够与PI3K信号通路上的关键酶发生作用的活性基团为Ar和模拟认为，本发明提供的化合物能够产生氢键，从而与目标蛋白PI3K、AKT、mTOR等相结合，抑制目标蛋白的磷酸化，进而抑制目标蛋白的活性。本发明提供的化合物通过分子对接技术计算机模拟表明这些化合物均具有相似的生物活性和药理作用。下面以化合物C98为例，进一步阐述本发明。化合物C98的结构为：
实施例1化合物C98的制备
1、将式VII所示结构化合物(2g,8.3mmol/L,1.0eq)、丙二酸(1.3g,12.4mmol/L,1.5eq)溶于20ml无水吡啶中，搅拌下滴入吗啡啉(72.28mg,0.8mmol/L,0.1eq)，80℃回流搅拌24h，反应完成后向反应体系中加入2molHCl，有大量固体析出，过滤，滤饼用水洗涤，少量EA洗涤，滤饼红外灯干燥，所得的产物2为混合物，淡黄色固体为式VIII所示结构化合物2.4g，可以直接用于后续反应。
式VIII所示结构化合物表征：MS:[M-H]-:Foundm/z280.8Calcdm/z281.0
2、将式VIII所示结构化合物(2.4g,8.48mmol/L,1.0eq)混悬于MeOH和DMSO混合溶液，缓慢加SOCl2以及补加DMSO使体系变澄清，80℃回流反应3d，原料仍有少量剩余，将反应液旋蒸浓缩，除去甲醇及二氯亚砜，加EA稀释，H2O洗涤，饱和NaHCO3洗涤，brine洗涤，有机相干燥浓缩，柱层析(P:E＝20:1)式IX所示结构化合物，产物为淡黄色固体，两步总收率89％。
式IX所示结构化合物表征：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(d,J＝2.5Hz,1H),7.46(d,J＝15.7Hz,1H),7.38(d,J＝8.6Hz,1H),7.25(s,1H),7.21(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),6.73(d,J＝3.6Hz,1H),6.46(d,J＝15.7Hz,1H),3.82(s,3H).
3、将式IX所示结构化合物(1.8g,6.06mmol/L,1.0eq)溶于100ml无水THF中(THF量太少降温3会析出)，降温至-78℃，缓慢滴加1.5molDIBAL-H甲苯溶液(12.12ml,18.17mmol/L,3.0eq)，保持低温，搅拌反应2-3h，反应完全后，将反应体系缓慢升温至室温，搅拌下滴加2molHCl淬灭反应，加入EA稀释，水洗，brine洗，有机相干燥，浓缩柱层析(P:E＝8:1)，得式X所示结构化合物，产物为黄白色固体，产率92％。
式X所示结构化合物表征：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝1.7Hz,1H),7.35(d,J＝8.5Hz,1H),7.18(d,J＝3.3Hz,1H),7.14(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),6.49(s,1H),6.47(s,1H),6.38(d,J＝3.3Hz,1H),4.36(s,2H).
MS:[M-H]-:Foundm/z266.6Calcdm/z267.0
4、将式X所示结构化合物(1.5g,5.57mmol/L,1.0eq)溶于DCM中，室温搅拌下加入过量新制备的活性MnO2，室温搅拌反应约30min，反应完成后，将反应液用硅藻土过滤，DCM洗涤，浓缩得式XI所示结构化合物，产物为黄色固体，产率97％。
式XI所示结构化合物表征：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(d,J＝2.1Hz,1H),7.42(d,J＝8.6Hz,1H),7.34(d,J＝3.6Hz,1H),7.30(d,J＝2.8Hz,1H),7.28(d,J＝2.3Hz,1H),6.92(d,J＝3.6Hz,1H),6.75(dd,J＝15.7,7.8Hz,1H).
5、式XI所示结构化合物(1.5g,5.62mol/L,1.0eq)、2-氰基硫代乙酰胺(562.37mg,5.62mmol/L,1.0eq)溶于DCM和MeOH(D:M＝1:1)混合溶液50ml中，搅拌下加入吗啡啉50mg，室温搅拌反应1h后有紫红色固体析出，反应3h后反应完全，过滤，滤饼用少量甲醇洗涤，得产物为紫红色絮状固体即为化合物C98，产率77％。
化合物C98表征：1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.91(s,1H),9.55(s,1H),8.06(d,J＝11.5Hz,1H),7.94(s,1H),7.63(d,J＝8.5Hz,1H),7.47(d,J＝8.3Hz,1H),7.44–7.38(m,1H),7.34(s,1H),7.19(d,J＝2.7Hz,1H),7.13–7.00(m,1H).
化合物表征：MS:[M-H]-:Foundm/z346.8Calcdm/z347.0
其中，化合物C98的氢谱如图1-a所示，质谱如图1-b所示
实施例2化合物C98抑制多发性骨髓瘤细胞以及白血病细胞的生长
培养多种多发性骨髓瘤细胞：H929、JJN3、KMS11、KMS18、LP1、MM.1S、OCI-MY5、OPM2、RPMI-8226、U266；白血病细胞：K562、Jurkat、AML-2、NB-4、THP-1。
用不同浓度的C98处理，C98的浓度依次为0.39μmol/L、0.78μmol/L、1.56μmol/L、3.125μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L。处理72小时后，用MTS/PMS染色法分析细胞存活率。
图2为不同浓度C98化合物对多发性骨髓瘤细胞影响，结果表明C98对多发性骨髓瘤生长和增殖具有抑制作用，且呈现浓度依赖性。
图3不同浓度C98化合物对白血病细胞的影响，结果表明C98对白血病细胞增殖和生长具有抑制作用，且呈现浓度依赖性。
由此得出结论，C98可以有效抑制多发性骨髓瘤以及白血病细胞的生长和增殖，且呈现浓度依赖性。
实施例3化合物C98诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡
培养LP1、OPM2、OCI-MY5、JJN3细胞。
用不同浓度的C98处理，C98的浓度依次为0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、处理24小时后收集细胞，用AnnexinV-FITC(标记凋亡细胞)和PI(碘化丙啶)双染，用流式细胞仪检测AnnexinV+细胞所占的比例。结果如图4和表1所示：
表1不同浓度C98化合物对骨髓瘤细胞凋亡的影响
结果显示：C98能够有效诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡，且随着C98药物浓度的升高，细胞发生凋亡的比例也逐渐上升。说明细胞凋亡率与C98呈现浓度依赖性。
实施例4化合物C98激活肿瘤细胞凋亡酶
Caspase-3即含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)，与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。Pro-Caspase-3的总表达量下降表示Caspase-3被剪切激活。
Cle-Caspase-3的表达升高表示Caspase-3被剪切激活，从而导致细胞的凋亡。
PARP(polyADP-ribosepolymerase)是DNA修复酶。PARP是caspase的切割底物，在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用。
PARP(116KD)的表达下降表示总PARP被切割，从而总量下降。
PARP(89KD)的表达升高表示PARP被caspase-3的切割激活从而引起细胞凋亡。
本发明培养LP1、OPM2、JJN3、KMS11、RPMI-8226、OCI-MY5细胞，分别用浓度为20μM的C98化合物处理24小时后，收集细胞，用含钒氨酸钠裂解液裂解之后，采用WesternBlotting分析化合物C98对肿瘤细胞中Pro-Caspase-3、Cle-Caspase-3、PARP(116KD)和PARP(89KD)的表达情况。实验以未经C98处理的细胞为对照，以GAPDH作为内参。
结果显示如图5所示，结果显示，C98处理可显著降低Pro-Caspase-3和PARP(116KD)的表达，而Cle-Caspase-3和PARP(89KD)的表达量则因C98的处理而升高。从而证明C98能够激活肿瘤细胞凋亡酶，可有效诱导多发性骨髓瘤的凋亡，
另外，取OPM2、JJN3细胞，分别用浓度为0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的C98化合物处理9小时，每3小时收集细胞。收集的细胞用含钒氨酸钠裂解液裂解之后，采用WesternBlotting分析各肿瘤细胞中Pro-Caspase-3、Cle-Caspase-3、PARP(116KD)和PARP(89KD)的表达情况。以探索C98化合物浓度(结果如图6所示)和时间(结果如图7所示)对肿瘤细胞凋亡酶的影响。
图6结果表明，肿瘤细胞中Pro-Caspase-3和PARP(116KD)的表达量随C98浓度的增高而降低，而Cle-Caspase-3和PARP(89KD)的表达量则随C98浓度的增高而升高。表明C98对OPM2、JJN3细胞的凋亡蛋白酶的激活作用与C98浓度呈依赖性。
图7结果表明，以浓度为10μM的C98对肿瘤细胞进行处理，肿瘤细胞中Pro-Caspase-3和PARP(116KD)的表达量随时间的延长而降低，而Cle-Caspase-3和PARP(89KD)的表达量则随时间的延长而升高。表明C98对OPM2、JJN3细胞的凋亡蛋白酶的诱导作用表现出时间依赖性。
实施例5化合物C98抑制肿瘤细胞中AKT的磷酸化
AKT处于PI3K通路的中心环节，它在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用。p-AKT即为磷酸化的AKT，AKT磷酸化水平降低意味着具有活性的AKT减少，肿瘤细胞的生长受到抑制，t-AKT表示总AKT。
本发明以OPM2、JJN3细胞为研究对象：
1、未经IGF-1诱导条件下的AKT表达和磷酸化情况：
培养OPM2、JJN3细胞，分别以浓度为0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的C98化合物处理9小时，每3小时收集细胞。收集的细胞用含钒氨酸钠裂解液裂解之后，采用WesternBlotting分析各肿瘤细胞中p-AKT和总AKT的表达。以探索C98化合物浓度(结果如图8所示)和时间(结果如图9所示)对AKT的影响。实验以GAPDH作为内参。
图8结果表明，肿瘤细胞中p-AKT和总AKT的表达量随C98浓度的增高而降低。表明C98能够有效抑制OPM2、JJN3细胞中AKT的磷酸化，且该抑制作用与C98浓度呈正相关。
图9结果表明，以浓度为10μM的C98对肿瘤细胞进行处理，肿瘤细胞中p-AKT的表达量随时间的延长而降低，表明C98可有效抑制OPM2、JJN3细胞中AKT的磷酸化，且该抑制作用呈现时间依赖性。
2、IGF-1诱导条件下的AKT表达和磷酸化情况：
IGF-1R(IGF-1receptor)表达于多种类型的细胞表面，可以促进机体的蛋白质和核酸的合成以及碳水化合物的代谢。当其过度表达时，细胞向恶性表型转化。其介导的信号转导通路在促有丝分裂活性、正常细胞向恶性细胞转化、抗细胞凋亡及肿瘤的侵润、转移、复发等方面发挥作用。IGF-1R可以被其配体IGF-1所激活，从而启动细胞内PI3K通路。本发明采用Westernblot法研究外源IGF-1诱导条件下AKT的表达和磷酸化情况。
实验方法为：将多发性骨髓瘤细胞LP1和JJN3隔夜低血清(0.5％)培养，经浓度为100μmol/L的药物(C98或S14161)处理2小时后用100ng/mL的IGF-1诱导15min,收集细胞，用含有正钒化钠SDS蛋白裂解液提取总蛋白，用Westernblot检测磷酸化p-AKT和总AKT的表达，GAPDH作为内参。
实验设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、实验组。其中：
空白对照组为未经诱导或药物处理的正常肿瘤细胞；
阴性对照组仅以IGF-1诱导；
阳性对照组为经对照药物S14161处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验组为经C98处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验结果如图10所示，结果表明，空白对照组的细胞中p-IGF-1R和p-AKT的表达量都很低，阴性对照组的细胞中p-IGF-1R和p-AKT皆表现出高表达，而阳性对照组和实验组中的p-AKT受到了显著的抑制，但是IGF-1R的磷酸化水平没有被C98或S14161所影响，说明C98能够有效抑制AKT而不是IGF-1R的磷酸化。
3、IGF-1诱导条件下C98浓度对AKT表达和磷酸化情况：
实验方法为：将OPM2细胞隔夜低血清(0.5％)培养，经浓度为100μmol/L的S14161或不同浓度的C98处理2h后用100ng/mL的IGF-1诱导15min,收集细胞，用含有正钒化钠SDS蛋白裂解液提取总蛋白，用Westernblot检测磷酸化p-AKT和总AKT的表达，GAPDH作为内参。
实验设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、实验组1～3。其中：
空白对照组为未经诱导或药物处理的正常肿瘤细胞；
阴性对照组仅以IGF-1诱导；
阳性对照组为经对照药物S14161处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验组1为经浓度为25μmol/L的C98处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验组2为经浓度为50μmol/L的C98处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验组3为经浓度为100μmol/L的C98处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验结果如图11所示，结果表明，空白对照组的细胞中p-AKT的表达量很低，阴性对照组的细胞中p-AKT表现出高表达，而阳性对照组和实验组中的p-AKT皆受到了明显的抑制，且C98对APK磷酸化的抑制作用呈现浓度依赖性。
4、IGF-1诱导条件下处理时间对AKT表达和磷酸化情况：
实验方法为：将OPM2细胞隔夜低血清(0.5％)培养，经浓度为100μmol/L的S14161或浓度为100μmol/LC98处理不同时间后用100ng/mL的IGF-1诱导15min,收集细胞，用含有正钒化钠SDS蛋白裂解液提取总蛋白，用Westernblot检测磷酸化p-AKT和总AKT的表达，GAPDH作为内参。
实验设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、实验组1～3。其中：
空白对照组为未经诱导或药物处理的正常肿瘤细胞；
阴性对照组仅以IGF-1诱导；
阳性对照组为经对照药物S14161处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验组1为经浓度为100μmol/L的C98处理0.5h后，以IGF-1诱导15min；
实验组2为经浓度为100μmol/L的C98处理1h后，以IGF-1诱导15min；
实验组3为经浓度为100μmol/L的C98处理2h后，以IGF-1诱导15min；
实验结果如图12所示，结果表明，空白对照组的细胞中p-AKT的表达量很低，阴性对照组的细胞中p-AKT表现出高表达，而阳性对照组和实验组中p-AKT皆受到了抑制，且C98对AKT磷酸化的抑制作用呈现时间依赖性。
实施例6化合物C98对PI3K信号通路下游相关蛋白表达的影响
将多发性骨髓瘤细胞株OPM2、JJN3经不同浓度C98处理24h。C98的浓度依次为0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L。用含有正钒化钠SDS蛋白裂解液裂解，取30μg蛋白进行凝胶电泳，检测细胞中AKT、mTOR、P70S6K、4E-BP1的表达和磷酸化情况，实验以β-actin和GAPDH作为内参。结果如图13所示。图13表明C98可以使AKT的下游相关蛋白如p-mTOR、p-P70S6K、p-4E-BP1相应减少。且表明C98对AKT途径下游相关蛋白的表达及磷酸化的抑制作用成浓度依赖关系。
实施例7化合物C98对PI3K信号通路作用的特异性
将多发性骨髓瘤细胞株OPM2、JJN3经不同浓度C98处理24h。C98的浓度依次为0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L。用含有正钒化钠SDS蛋白裂解液裂解，取30μg蛋白进行凝胶电泳检测细胞中STAT3、ERK、SRC、p38的表达及磷酸化情况，实验以GAPDH作为内参。结果如图14所示。图14表明C98对细胞中STAT3、ERK、SRC、p38的表达及磷酸化没有影响，表明C98对其他通路的重要蛋白没有发生抑制作用。实施例8化合物C98在小鼠多发性骨髓瘤模型中抑制多发性骨髓瘤的生长以及抑制其体
内AKT磷酸化
雌性裸鼠分别皮下注射骨髓瘤细胞株OPM2(3×107细胞/注射点)和JJN3(3×107细胞/注射点)，待肿瘤组织达到可以触摸时，将裸鼠随机分为给药组和对照组，每组各5只裸鼠。具体分组信息如表2所示：
表2实验分组信息
其中，所述溶剂为PBS、TWEEN80、DMSO的混合液，其中PBS:TWEEN80：DMSO的体积比为8:1:1。
实验连续进行16天，隔天测定肿瘤大小，每天称量小鼠体重。
小鼠肿瘤体积变化情况如图15所示，结果表明C98能有效地抑制肿瘤生长。将实验动物的肿瘤取出，经剪碎，加入裂解液进行超声破碎，然后离心取上清，取30μg蛋白进行凝胶电泳，检测p-AKT的表达，以GAPDH作为内参，结果如图16所示。图16表明C98能够有效抑制动物肿瘤组织中的AKT磷酸化。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种如式I所示结构化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将式II所示结构化合物与丙二酸反应制得式III所示结构化合物；
步骤2：将式III所示结构化合物转化为式IV所示结构化合物；
步骤3：将式IV所示结构化合物与2-氰基硫代乙酰胺反应制得式I所示结构化合物；
X为O、S、N；
Ar为单取代苯基、双取代苯基、三取代苯基、四取代苯基或五取代苯基；
Ar的取代基为氯、氟、溴、烷氧基或取代氨基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体为：将式III所示结构化合物经甲酯化、还原、氧化制得式IV所示结构化合物。
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