CN103948964A - 一种用脂联素包被的植骨材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其包括以下步骤:步骤1,制备改性煅烧骨材料;步骤2,取2～3重量份分子量在2x105～3x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述溶液与1重量份改性煅烧骨材料混合形成混合物；步骤3,步骤2中的混合物经Co60照射灭菌，然后向其中加入人重组脂联素,均匀混合后塑型，冷冻干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。本发明方法制备的用脂联素包被的植骨材料骨强度大，易于降解，生物活性大，同时具有骨诱导特性。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料制备技术领域，特别是一种载生物因子且缓释的具有高活性的用脂联素包被的植骨材料的制备方法，所制备的材料可应用于机体骨缺损的修复。
背景技术
现有技术中骨缺损修复重建的方法很多，但骨缺损后修复重建尤其是大块骨缺损后的修复重建一直是骨科面临的难题。寻求理想的骨修复替代材料一直是骨科及相关学科亟待解决的关键问题。
多年的研究成果表明，在磷灰石陶瓷家族成员中，纳米羟基磷灰石(HA)的晶体结构与骨组织中的矿物质微粒结构基本相同，磷酸钙(TCP)在骨组织中也占有一定比例，其降解速率远大于HA，在体内易于降解。降解速率除与化学组分有关外，还与其与体液间的接触面积相关。多孔磷灰石陶瓷的最佳设计原则在于既能兼顾骨支架材料的降解速率及并可以保持有利于新生骨组织的长入孔隙结构。尽管钙磷陶瓷的成型制作技术有了大的发展，如计算机控制的三维陶瓷打印技术，但该方法受测量表征技术及加工技术的限制，通过该方法制作天然骨组织仍是一个长期的努力目标。
煅烧骨是现有骨修复材料之一，既保留了无机钙磷矿物质，又基本保留了骨组织的多孔结构，在临床应用中得到了较好的评价。但强度较差，由于经高温烧成，完全失去了胶原蛋白，纳米晶体发生了改变，不易降解。
脂联素(Adiponectin，APN)是动物及人类脂肪细胞分泌的一种激素，由247个氨基酸组成，存在2种受体(AdipoR1和AdipoR2)，成骨细胞和破骨细胞均表达脂联素受体。体外实验证明，脂联素激活AdipoRl/JNK、 AdipoRl/p38信号通路诱导人成骨细胞的增殖及分化，促进其成骨功能。同时，脂联素处理小鼠单核细胞后，可抑制NF-kappa B通路的激活，进而抑制小鼠单核细胞向破骨细胞分化成熟。体内动物研究亦表明，过表达脂联素的腺病毒转染C57BL/6J小鼠后，成骨细胞功能被激活，破骨细胞骨吸收作用被抑制，最终表现为骨量增加。上述研究表明，脂联素在骨代谢过程中起重要的调控作用。但它们半衰期短，局部应用时很快被稀释和代谢。
近年来的研究已经阐明这些细胞因子主要作用的生化和分子基础，同时也提供了有关它们之间相互作用的机理。随着对细胞因子在骨代谢中作用机制的认识，预示着这些细胞因子在骨折愈合及骨缺损修复以及某些骨吸收性疾病的诊断和治疗中有着乐观的应用前景。
壳聚糖(chitosan，CS)是由甲壳素经脱乙酰化反应而得到，是目前已知的天然多糖中唯一的碱性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒及抗菌性等特点，受到医学界广泛的关注。羧甲基壳聚糖(CMCS)是新型的壳聚糖衍生物，由甲壳质在碱性条件下与氯乙酸反应而得到。与甲壳质相比，其物理、化学性质均得到优化，具有完全水溶性、成膜性及极强的与钙离子的螯合作用，大大拓展了其在医学领域的应用。
在骨缺损的修复治疗中，磷灰石陶瓷具有与骨组织无机成分相同的组分，生物相容性好，但性脆强度不高，临床应用受到大的限制。随着研究的不断深入，特别是理想的骨组织工程支架材料的提出，尽力模仿骨组织的天然结构成为了当今骨修复材料设计与制作的重要原则。支架材料的研究是骨组织工程研究的关键问题，骨组织工程支架材料不仅要有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构，有利于新生骨组织的长入，还要有合适的降解速率维持新生组织的生长。壳聚糖具有无毒性，良好的生物相容性，可被体内多种生物酶降解，降解产物无毒且能被生物体吸收，壳聚糖是已经被证明了的适宜的缓释控载体。羧甲基壳聚糖与壳聚糖相比具有更 强的水溶性、成膜性和与钙离子的鳌合作用，拓宽了其作为缓控释载体的应用范围，当其与生物陶瓷复合制作支架材料时，显示了优越的修饰能力。
此外，通过体外试验证明羧甲基壳聚糖能明显缩短组织创面出血时间，具有良好的凝血性，分析原因为CMCS是一种两性聚电解质，在溶液中，氨基能质子化生成阳离子，羧基能电离生成阴离子，两种离子共同作用加速凝血过程缩短了凝血时间。感染也是诱导术后粘连的因素之一，细菌有不同的致粘连能力，如大肠杆菌能引发纤维蛋白分子及白细胞渗出，产生较广泛的粘连。临床上常使用抗生素来控制术区感染，
仅靠单一材料，很难满足以上各项性能的要求，因此人们通常模仿天然骨的成分和结构特征进行仿生制备无机复合或有机杂化支架，壳聚糖的膜结构在模仿天然骨的应用中常常受到重视。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用脂联素包被的植骨材料的制备方法。以解决现有骨粉强度较差，难于降解，生物活性较差等不足的缺陷。
一种用脂联素包被的植骨材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,制备改性煅烧骨材料；
步骤2,取2～3重量份分子量在2x105～3x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述溶液与1重量份改性煅烧骨材料混合形成混合物；壳聚糖不溶于水或略溶于水；而且，要达到缓释效果，得选用高分子量的壳聚糖，而高分子量壳聚糖仅在酸性环境下才能溶解。
步骤3,步骤2中的混合物经Co60照射灭菌，然后向其中加入人重组脂联素,均匀混合后塑型，冷冻干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。
如上所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,优选的,步骤1，选用 新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料以彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。采用该优选步骤的的有益效果是：有效提高β磷酸三钙的含量，获得的改性煅烧骨材料中羟基磷灰石(HA):β磷酸三钙(βTCP)＝1:3。
如上所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,优选的,所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或几种。
如上所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,优选的,所述羧甲基壳聚糖分子量为2.5x105。
如上所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,优选的,步骤(2)取2.5重量份分子量在2.5x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述羧甲基壳聚糖溶液与1重量份改性煅烧骨材料混合形成混合物。
如上所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,优选的,步骤(3)所述混合物经Co60照射灭菌，然后向其中加入0.0005～0.0015重量份的人重组脂联素,均匀混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，冷冻干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。
如上所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,优选的,所述酸性溶液是体积分数为2％的乙酸溶液，可以有效提高高分子量的壳聚糖的溶解，达到缓释作用。
本发明的有益效果为：
1、本发明对煅烧骨材料进行改性获得改性煅烧骨材料；该材料无免疫抗原性，用含人重组脂联素的羧甲基壳聚糖溶胶对改性煅烧骨材料进行包被，其机械强度达0.15Mpa、体内28天至30即可降解。
2、本发明方法制备的用脂联素包被的植骨材料骨强度增加，易于降解，生物活性大，同时具有骨诱导特性。
附图说明
图1为本发明本实施例1制备的用脂联素包被的植骨材料扫描电镜图像；
图2为凋亡检测试剂盒进行检测的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
用脂联素包被的植骨材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,制备改性煅烧骨材料；选用新生小牛关节头作为骨原料，经去离子水充分荡洗并以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；然后利用磷酸氢二铵按照化学反应平衡方程配比对骨的基质(骨盐)进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.55；然后在1000℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料；获得的改性煅烧骨材料中羟基磷灰石(HA):β磷酸三钙(βTCP)＝1:3。
步骤2,取2500mg分子量在2.5x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于60ml体积分数为2％的乙酸溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述溶液与1000mg改性煅烧骨材料混合形成混合物；
步骤3,步骤2中的混合物经Co60照射灭菌(超过10小时)，然后向其中加入1mg人重组脂联素(recombinant human globular adiponectin，rh-gAPN),均匀混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，使用有机溶剂冻干机(FD8-6a，上海人和科学仪器有限公司)，于-30℃冷冻过夜干燥 后即得用脂联素包被的植骨材料。
如图1所示，本实施例制备的用脂联素包被的植骨材料扫描电镜图像；可以观察到凝胶成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。
本实施例中制备的植骨材料，骨强度大，抗压强度达为0.15Mpa；易于降解，降解速度为28天。
实施例2
用脂联素包被的植骨材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,制备改性煅烧骨材料；选用胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗并以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；然后利用磷酸二氢铵，按照化学反应平衡方程配比对骨的基质(骨盐)进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.5；然后在800℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。
步骤2,取2000mg分子量在2x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于70ml体积分数为2％的乙酸溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述溶液与1000mg改性煅烧骨材料混合形成混合物；
步骤3,步骤2中的混合物经Co60照射灭菌(超过10小时)，然后向其中加入0.5mg人重组脂联素(recombinant human globular adiponectin，rh-gAPN),均匀混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，使用有机溶剂冻干机(FD8-6a，上海人和科学仪器有限公司)，于-30℃冷冻过夜干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。
在本实施例制备的用脂联素包被的植骨材料扫描电镜图像中可以观察到凝胶成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。
本实施例中制备的植骨材料，骨强度为0.15Mpa；易于降解,降解时间为 30天。
实施例3
用脂联素包被的植骨材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,制备改性煅烧骨材料；选用新生小牛关节头作为骨原料，经去离子水充分荡洗并以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；然后利用磷酸，按照化学反应平衡方程配比对骨的基质(骨盐)进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66；然后在1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。
步骤2,取3000mg分子量在3x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于80ml体积分数为2％的乙酸溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述溶液与1000mg改性煅烧骨材料混合形成混合物；
步骤3,步骤2中的混合物经Co60照射灭菌(超过10小时)，然后向其中加入1.5mg人重组脂联素(recombinant human globular adiponectin，rh-gAPN),均匀混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，使用有机溶剂冻干机(FD8-6a，上海人和科学仪器有限公司)，于-30℃冷冻过夜干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。
在本实施例制备的用脂联素包被的植骨材料扫描电镜图像中可以观察到凝胶成三维多孔结构，壳聚糖大分子交联形成中空的支架，孔隙均匀，结构稳定。
本实施例中制备的植骨材料，抗压强度为0.15Mpa；降解时间为30天。
效果例：用脂联素包被的植骨材料对成骨细胞凋亡能力的影响
在96孔板中每孔加入5×105个MC3T3细胞，隔日加入实施例1制备的用脂联素包被的植骨材料的浸提液，于10％FBS的DMEM中复合培养24和48小时后终止培养，利用凋亡检测试剂盒进行检测(结果如图2所示)。本实验证明通过本法制备的用脂联素包被的植骨材料对成骨细胞的前体细胞无毒 性反应。
实施例2和3制备的用脂联素包被的植骨材料进行同样实验，对成骨细胞的前体细胞均无毒性反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤（1）,制备改性煅烧骨材料;
步骤（2）,取2～3重量份分子量在2x105～3x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述羧甲基壳聚糖溶液与1重量份改性煅烧骨材料混合形成混合物；
步骤（3）,步骤2中的混合物经Co60照射灭菌，然后向其中加入人重组脂联素,均匀混合后塑型，冷冻干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。
2.根据权利要求1所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其特征在于,步骤（1），选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨材料。
3.根据权利要求2所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法，其特征在于，所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或任意几种。
4.根据权利要求1所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其特征在于,所述羧甲基壳聚糖分子量为2.5x105。
5.根据权利要求1所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其特征在于,步骤（2）取2.5重量份分子量在2.5x105的羧甲基壳聚糖，将所述羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基壳聚糖溶液；将所述羧甲基壳聚糖溶液与1重量份改性煅烧骨材料混合形成混合物。
6.根据权利要求1至5任一项所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其特征在于,步骤（3）所述混合物经Co60照射灭菌，然后向其中加入0.0005～0.0015重量份的人重组脂联素,均匀混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，冷冻干燥后即得用脂联素包被的植骨材料。
7.根据权利要求1至5任一项所述的用脂联素包被的植骨材料的制备方法,其特征在于,所述酸性溶液是体积分数为2%的乙酸溶液。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0298501A2 (en) * | 1987-07-10 | 1989-01-11 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Composition for forming calcium phosphate type hardening material and process for producing such hardening material |
| CN1562385A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-01-12 | 东南大学 | 全天然体外成型硬组织修复材料制备方法 |
| CN101352583A (zh) * | 2007-07-29 | 2009-01-28 | 山东硅苑新材料科技股份有限公司 | 多孔聚磷酸钙生物陶瓷及其制备方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0298501A2 (en) * | 1987-07-10 | 1989-01-11 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Composition for forming calcium phosphate type hardening material and process for producing such hardening material |
| CN1562385A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-01-12 | 东南大学 | 全天然体外成型硬组织修复材料制备方法 |
| CN101352583A (zh) * | 2007-07-29 | 2009-01-28 | 山东硅苑新材料科技股份有限公司 | 多孔聚磷酸钙生物陶瓷及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIANYUN WANG ET AL.: "Structureandpropertiesofchitosanderivativesmodified calcium polyphosphate scaffolds", 《POLYMER DEGRADATIONAND STABILITY》, vol. 95, no. 7, 18 April 2010 (2010-04-18), pages 1205 - 1210 * |
| 贺慧霞等: "两种钙磷材料表面壳聚糖修饰对人牙髓干细胞黏附和增殖的影响", 《牙体牙髓牙周病学杂志》, vol. 14, no. 10, 31 October 2004 (2004-10-31), pages 544 - 548 * |
| 郝东升等: "脂联素与骨代谢的研究进展", 《中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志》, vol. 2, no. 4, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 260 - 267 * |
Also Published As
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|---|---|
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