CN103937712A

CN103937712A - 一种地衣芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN103937712A
Application number: CN201410137313.1A
Authority: CN
Inventors: 黄少斌; 赵惊鸿; 张永清; 党志; 谭奇峰; 李冬平; 王晶惠
Original assignee: GUANGDONG YUE GANG WATER SUPPLY Co Ltd; South China University of Technology SCUT
Current assignee: GUANGDONG YUE GANG WATER SUPPLY Co Ltd; South China University of Technology SCUT
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-04
Also published as: CN103937712B

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌及其应用，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8122，保藏日期为2013年9月3日。该菌株最优培养条件为50～55℃、C/N12～16以及转速160r/min。该菌株可以在24小时内对初始浓度为140mg/L的硝酸根去除率达95%以上，总氮去除率达40%以上。该菌株的发现对高温条件下生物法脱氮脱硝具有重要意义。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于环境工程、生物领域，涉及一株具有好氧反硝化性能的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8菌株的筛选及其在高温环境下脱除废水中脱除水中的硝酸盐氮、亚硝酸盐氮及氨氮的应用。

背景技术

由于环境中化肥施用、垃圾粪便灌溉排放、工业含氮废水排放以及燃料燃烧排放的含氮废气经降水淋溶分解后形成硝酸盐，流入河、湖并渗入地下，造成地表水和地下水的硝酸盐污染，不仅破坏水体生态环境，制约经济发展，也严重危害到人体健康。生物脱氮法由于工艺简单、处理能力强、方式灵活等优点已成为近年来应用最广的废水脱氮技术，开发经济高效的生物脱氮方法和技术已成为水污染控制领域热点之一。

传统理论上的反硝化只发生在厌氧条件下，然而，自从1988年Robertson等人分离筛选出可以在有氧条件下进行反硝化作用的细菌Thiosphaerapantotropha、Pseudmonas sp.和Alcaligenes faecalsi并提出了好氧反硝化的概念，国内外学者在好氧反硝化领域进行了广泛深入的研究，证明好氧反硝化较之传统反硝化技术存在明显优势。好氧反硝化应用的主体是好氧反硝化菌群，近年来，不断有好氧反硝化菌被分离出来，存在于副球菌属、假单胞菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属等50多个属。然而这些报道的好氧反硝化菌大多生长于常温环境下（25～35℃），关于高温条件下（40℃以上）的好氧反硝化菌报道较少。由于很多工业废水的温度都达到45℃以上，进行处理时需先降温，从而给常规的生物处理技术带来较大困难。因此，筛选分离在高温条件下具有高效的好氧反硝化细菌以及对其好氧反硝化的机理的研究仍然是一项十分迫切的任务。

发明内容

本发明之目的是提供一种可以在高温条件下具有高效好氧反硝化性能的菌株及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，其保藏编号是CGMCC No.8122，保藏日期为2013年9月3日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

高温条件下具有高效好氧反硝化性能的菌株是地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）JH8，该菌株具有以下特征：（1）菌落特征：菌落表面粗糙不透明，边缘不整齐；杆菌，菌体单个，成对或链状排列；革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生偏端生；（2）接触酶、厌氧生长、V-P测定、硝酸盐还原、淀粉水解、酪素水解等实验均为阳性，氧化酶、明胶液化、卵磷脂酶、吲哚、酪氨酸、苯丙氨酸脱氨酶等实验均为阴性；（3）该细菌16S rDNA基因序列特征：其16S rDNA具有序列表所示的核苷酸序列，片段长度为1426bp，在GenBank中的登录号为No.:KF148636，与GenBank数据库比对表明，该菌株与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的同源性为99%，其中与菌株Bacilluslicheniformis strain CA81b最相似，同源性达99%。应用MEGA软件采用Neighbor-Joining法绘制16S rDNA系统发育树，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征，该菌株最有可能是地衣芽孢杆菌属，并命名为Bacilluslicheniformis JH8。

该地衣芽孢杆菌用于含氮废水的脱氮处理。具体地，将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于反硝化培养基中，添加碳源，使C/N为2～20，于30～55℃、0～200r/min条件下培养进行脱氮处理。

所述地衣芽孢杆菌的培养温度为45～55℃。

所述碳源为葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠中的一种或两种以上。

所述反硝化培养基成分如下（g/L）：KNO₃1.0；Na₂HPO₄·7H₂O7.9；KH₂PO₄1.5；MgSO₄·7H₂O0.1；微量元素溶液2mL/L；pH7.0～7.3；微量元素溶液成份(g/L)：EDTA50.0；ZnSO₄2.2；CaCl₂5.5；MnCl₂·4H₂O5.06；FeSO₄·7H₂O5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O1.1；CuSO₄·5H₂O1.57；CoCl₂·6H₂O1.61。

该地衣芽孢杆菌还用于烟气或废气的脱硝处理。

所述地衣芽孢杆菌用于45～55℃烟气或废气的脱硝处理。

将烟气或废气通入由地衣芽孢杆菌挂膜的生物滴滤塔，地衣芽孢杆菌生长所需营养物质由循环液提供；烟气经生物过滤作用后外排，完成烟气的生物过滤脱硝过程。

所述循环液的成分如下（g/L）：Na₂HPO₄·7H₂O7.9；KH₂PO₄1.5；MgSO₄·7H₂O0.1；柠檬酸钠8.0；微量元素溶液2mL/L；pH7.0～7.5。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明涉及的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8对温度耐受程度强，在20～55℃温度条件内均可以生长，在45～55℃条件下具有高效的（硝酸盐去除率>90%）好氧反硝化能力。其生长细胞、细胞悬浮液能以硝酸盐为唯一氮源生长，可在好氧条件下还原硝酸盐为亚硝酸盐，并能够继续在好氧条件下还原亚硝酸盐为氮气等气体产物，使废水中氮化合物降低，达到脱氮的目的。

附图说明

图1为Bacillus licheniformis JH8的系统发育树图;

图2不同碳源下菌Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能比较;

图3不同温度下菌Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能比较;

图4不同C/N下菌Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能比较;

图5不同转速下菌Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能比较;

图6烟气生物过滤系统脱硝装置示意图：1－洗涤塔；2－风机；3－气体测量口；4－压力表；5－温度计；6－阀门；7－除雾器；8－洗涤液储槽；9－流量计；10－喷头；11－生物滴滤塔；12－填料；13－微生物活性再生系统；14－循环水泵。

具体实施方式

实施例1

菌种的分离、纯化及鉴定

本研究从华南理工大学建立在广州瑞明电力有限公司的生物滴滤系统的反应器内取出一块长有生物膜的填料至装有90mL灭菌的反硝化培养液并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡至生物膜脱落，取出填料。然后将三角瓶放入空气振荡器中把生物膜充分摇匀打碎。打碎后的生物膜在初始温度为30℃，160r/min的摇床振荡培养48h后，将10%（体积比）的菌液接入100mL新鲜的灭菌的反硝化培养液中，升温至35℃，摇床振荡培养48h后，按10%（体积比）接种菌液至100mL新鲜的灭菌的反硝化培养液中，如此按照上述方法筛选在高温条件下的优势菌种，直至升温至50℃。升温培养期间，每隔24h取培养后的菌液检测硝态氮（硝态氮和亚硝态氮）浓度。

取50℃培养第3d的菌液1mL稀释涂平板。平板培养基中加入溴百里酚蓝，菌落周围产生蓝色晕圈，说明培养基中pH值升高，发生了反硝化作用。24h后挑选有蓝色晕圈的单菌落，在DM培养基经3次划线分离，分离纯化具有反硝化性能的菌种。

将上述分离纯化后得到的纯菌种菌落，分别接种于装有100mL DM培养液的三角瓶中，按上述操作测各自24h内的硝酸盐去除率，将脱氮率大于80%的菌株进行生理生化鉴定及16S rDNA测序。PCR引物为通用引物16SF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和16SR：5′-GGTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增反应条件为：94℃预变性1min，经过30个循环，56℃退火1min，72℃扩增2min，最后72℃延伸7min。得到的产物进行16S rDNA测序（上海英濰捷基），测序结果见序列表。将测序结果通过BLAST程序进行同源性比较，其中一株菌与Bacillus licheniformis同源性达99%，命名为JH8（GenBank登录号为No.:KF148636，长度为1428bp），图1为该菌的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，请广东省微生物所对该菌进行生理生化鉴定，最终确定该菌为Bacillus licheniformis。

实施例2

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8反硝化性能检测

不同碳源下Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能

考察菌株对于丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、乙酸钠和蔗糖这几种碳源的利用情况。具体操作步骤如下：

将5mL菌悬液接种于95mL反硝化培养基中，反硝化培养基成分如下（g/L）：KNO₃1；Na₂HPO₄·7H₂O7.9；KH₂PO₄1.5；MgSO₄·7H₂O0.1；微量元素溶液2mL/L；pH7.0～7.5。微量元素溶液成份(g/L)：EDTA50.0；ZnSO₄2.2；CaCl₂5.5；MnCl₂·4H₂O5.06；FeSO₄·7H₂O5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O1.1；CuSO₄·5H₂O1.57；CoCl₂·6H₂O1.61。分别加入5种碳源，使C/N为10，于50℃、200r/min条件下振荡培养。

取0h和24h的样检测硝酸根、亚硝酸根、OD₄₈₀含量，结果如图2所示，菌株对葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠的利用率都比较高，硝酸根去除率均超过90%，其中碳源为柠檬酸钠时硝酸根去除率最高，达96.83。而酒石酸钾钠作为碳源时，细菌几乎不生长，硝酸根去除率仅为9.63%。

不同温度下Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能

考察30℃、40℃、45℃、50℃、55℃温度下，Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能。

将5mL菌悬液接种于95mL反硝化培养基中，于160r/min转速、上述不同温度条件下振荡培养。反硝化培养基成分如上所述，加入4g/L柠檬酸钠作为碳源。

取0h和24h的样检测硝酸根、亚硝酸根、OD₄₈₀含量，结果如图2所示，菌株在50℃条件下的硝酸根去除率最高，达95.05%。

不同碳氮比条件下Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能

将5mL菌悬液接种于95mL反硝化培养基中，反硝化培养基中KNO₃含量固定为1g/L，改变柠檬酸钠含量使C/N为2、4、6、8、10、12、16、20，其他组分如上述实验，于160r/min、50℃条件下振荡培养。

取0h和24h的样检测硝酸根、亚硝酸根、OD₄₈₀含量，结果如图4所示，菌株在C/N为16的条件下硝酸根去除率达到最大，为99.29%。

不同转速条件下Bacillus licheniformis JH8的反硝化性能

将5mL菌悬液接种于95mL反硝化培养基中，反硝化培养基中组分不变，调节摇床转速分别为0、60、120、160、200r/min，温度均为50℃，振荡培养。

取0h和24h的样检测硝酸根、TN、OD₄₈₀含量，结果如图5所示，菌株160r/min转速条件下硝酸根去除率最高，为96.93%；当转速达到200r/min时，硝酸根去除率稍有下降，说明转速过高时，有可能会抑制该菌的反硝化酶的活性。

实施例3

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8的烟气脱硝实验

烟气生物过滤脱硝系统如图6所示，主体部分为2.5L的生物滴滤塔11，由有机玻璃制成，内装蜂窝陶瓷填料12（空隙率0.55，直径4～6mm）。用经除尘、脱硫后的烟气，调节进气量后，通过洗涤塔1，经洗涤塔中冷却水喷淋等控制方式调节烟气温度在50℃左右，之后烟气以一定的流量和流速从底部进入生物滴滤塔，经生物过滤作用后再外排，最终完成烟气的生物过滤脱硝过程。滤塔外建一微生物活性再生系统，滤塔与微生物活性再生系统间水体用水泵进行循环，循环水经喷头喷入滤塔，喷头的出水以雾状充满整个滤塔。

地衣芽孢杆菌的挂膜：每天更换一次微生物活性再生系统中的循环液，确保JH8成为系统内的优势好氧反硝化菌，经过1个月的培养，可在生物过滤系统填料表面形成生物膜。然后启动进气装置，停止加入KNO₃，通入实际烟气（其中O₂体积体积分数约占8%）。初始NOx进气浓度为100ppm，流速为1L·min^-1，停留时间为1min；然后每隔5d进气浓度增加100ppm。循环液的成分如下（g/L）：Na₂HPO₄·7H₂O7.9；KH₂PO₄1.5；MgSO₄·7H₂O0.1；柠檬酸钠8.0；微量元素溶液2mL/L；pH7.0～7.5。循环液中适量添加EDTA二钠盐等物质，促进NO的吸附络合过程。每天用烟气分析仪检测NOx含量变化。滤塔运行初期NOx去除率为45.9%，随着反应的进行，NOx去除率逐渐增加，运行22d后NOx去除率达到最大，为92.1%。然后在运行第25d时（此时NOx进气浓度为600ppm），NOx的去除率有所下降，下降到81.4%，之后又逐渐恢复至90.7%。

该实施例证明在高温高氧浓度条件下，菌Bacillus licheniformis JH8具有高效的好氧反硝化性能，能够有效脱除烟气中不同浓度环境下的NOx。

实施例4

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8用于市政废水脱氮处理

将该菌用于某污水处理厂BAF生物曝气滤池进行脱氮处理，原水水质检测数据为COD173.25mg/L，NO₃-N278.37mg/L，NH₄-N98.54mg/L，pH7.8，水温45～47℃。将该菌按0.2%的投菌量（菌体干重为8g/L）添加到曝气生物池中，处理后水质为COD25.08mg/L，NO₃-N18.46mg/L，NH₄-N2.09mg/L，相应的污染物去除率为85.52%、93.37%、97.88%。与未投加该菌的对照组比较，COD、NO₃-N、NH₄-N的去除率分别为72%、65%、80%。因此，该菌的投加明显提高了系统的脱氮能力。

实施例5

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）JH8用于市政供水脱氮处理

将该菌用于处理某自来水厂的供水，水质含亚硝酸盐氮1.2mg/L，氨氮2.8mg/L，溶解氧含量在7.5mg/L左右；将该菌按0.1%的投菌量（菌体干重为8g/L）加入曝气生物滤池中，测得处理后水质含亚硝酸盐氮0.025mg/L，氨氮0.18mg/L，与对照组未投加该菌的处理后水质（亚硝酸盐氮0.16mg/L，氨氮0.44mg/L比较，亚硝酸盐氮与氨氮含量均有所下降。所以，该菌对低浓度的亚硝酸氮也能起到脱除效果，该菌的投加能够提升自来水供水水质，达到供水水质标准（《生活饮用水卫生标准》GB5749-2006规定，亚硝酸盐≤1mg/L，氨氮≤0.5mg/L，硝酸盐氮≤10mg/L）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）JH8，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8122，保藏日期为2013年9月3日。

2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于，该地衣芽孢杆菌用于含氮废水的脱氮处理。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于反硝化培养基中，添加碳源，使C/N为2～20，于30～55℃、0～200r/min条件下培养进行脱氮处理。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的培养温度为45～55℃。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠中的一种或两种以上。

6.根据权利要求3或4或5所述的应用，其特征在于，所述反硝化培养基成分如下（g/L）：KNO₃1.0；Na₂HPO₄·7H₂O7.9；KH₂PO₄1.5；MgSO₄·7H₂O0.1；微量元素溶液2mL/L；pH7.0～7.3；微量元素溶液成份(g/L)：EDTA50.0；ZnSO₄2.2；CaCl₂5.5；MnCl₂·4H₂O5.06；FeSO₄·7H₂O5.0；(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O1.1；CuSO₄·5H₂O1.57；CoCl₂·6H₂O1.61。

7.权利要求1所述地衣芽孢杆菌的应用，其特征在于，该地衣芽孢杆菌用于烟气或废气的脱硝处理。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌用于45～55℃烟气或废气的脱硝处理。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，将烟气或废气通入由地衣芽孢杆菌挂膜的生物滴滤塔，地衣芽孢杆菌生长所需营养物质由循环液提供；烟气经生物过滤作用后外排，完成烟气的生物过滤脱硝过程。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述循环液的成分如下（g/L）：Na₂HPO₄·7H₂O7.9；KH₂PO₄1.5；MgSO₄·7H₂O0.1；柠檬酸钠8.0；微量元素溶液2mL/L；pH7.0～7.5。