CN103937702B - 一株铜绿假单胞菌及其在去除重金属离子中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株铜绿假单胞菌（<i>Pseudomonas？aeruginosa</i>）ZC6，铜绿假单胞菌ZC6对重金属离子Zn2+具有去除作用，从土壤和水体中筛选对重金属离子Zn2+有去除作用的铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：a.金属选择培养基的制备；b.耐重金属菌株的富集驯化;c.耐重金属菌株的筛选及复筛；d.菌体对重金属去除能力的检测。通过含有金属离子的培养基对耐重金属菌株进行富集驯化和纯化后菌体对重金属去除能力的检测试验，建立合理、有效的去除重金属菌株的筛选方法，得到适合需要的菌株。本发明应用于重金属污染的治理，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一株微生物及其在去除重金属离子中的应用，特别涉及一株铜绿假单胞菌及其在去除重金属污染中的应用，属于微生物的检测及应用技术领域。
背景技术
重金属广泛分布于大气圈、生物圈、岩石圈和水圈中，被排入环境后具有永久性，且有明显的累积效应，能够污染水体土壤并通过食物链循环最终在生物体内富集，从而严重的危害生态环境及人体健康。
微生物治理重金属污染技术是国际上新兴起并不断探索发展的领域，利用微生物体系制备的生物吸附剂处理重金属污染，是目前实践证明最有发展前途的一种重金属污染治理方法。与传统的处理方法相比，其具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低等优点，在低浓度下，金属可被选择性地去除、分离回收。近十年来我国耐重金属微生物研究主要集中在微生物的性质及重金属对菌细胞的影响方面，而对于菌种筛选、菌种特征、生长条件研究较少。目前已分离的耐重金属种群少，菌体生长繁殖受栖息地环境的影响大，去除重金属的能力不强，还不能满足外部实际环境复杂的污染现状，迫切需要丰富其种群多样性，提高对重金属的去除能力。因此应加强具有高效修复能力的微生物的研究，在筛选大量耐重金属微生物的基础上，可将菌种驯化后进一步与适当的工艺结合构建高效去除重金属的工程菌，为微生物治理复杂环境的重金属污染提供更多选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，通过耐重金属菌株的富集驯化及筛选，从土壤和水体中筛选能够去除重金属的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）ZC6。建立合理有效的耐重金属菌株的筛选方法，并对筛选出的细菌去除重金属的作用效果进行评价，得到适合的去除重金属效果好的菌株。通过菌种驯化后进一步与适当的工艺结合，构建高效去除重金属的安全、有效、经济的工程菌产品。将产品应用于被重金属污染的土壤和水体中，提高重治理金属污染的效率，减少二次污染，降低成本，为微生物治理复杂环境的重金属污染提供更多选择。
本发明的另一目的是提供上述菌株在去除重金属离子中的应用。
该菌株于2014年2月18日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.8827，分类命名：铜绿假单胞菌。
为解决上述技术问题，本发明提供了一株铜绿假单胞菌ZC6，所述铜绿假单胞菌对重金属离子Zn2+具有去除作用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种从土壤和水体中筛选对重金属离子具有去除作用的方法，包括以下步骤：
a.金属选择培养基的制备；
b.耐重金属菌株的富集驯化;
c.耐重金属菌株的筛选及复筛；
d.菌体对重金属去除能力的检测。
所述步骤a可以进一步包括：计算硫酸锌[ZnSO4×7H2O]中金属离子的质量分数，溶于去离子水中配成10g/L的贮藏液。配制基础培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）—牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0。基础培养基灭菌后，将金属贮藏液根据浓度要求添加于培养基中。
所述步骤b可以进一步包括：取10g环境采集样品加入90mL液体牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养，37℃150r/min培养24h；取1mL富集培养液分别接种于含0.1g/L不同金属离子的新鲜液体培养基，37℃150r/min培养；待金属选择培养基混浊后，从中取1mL培养液接种于含0.2g/L金属离子的液体培养基中，逐级类推提高金属离子浓度。根据菌体对各金属耐受程度的不同，选取较高浓度的耐受生长条件进行多次驯化培养。
所述步骤c可以进一步包括：用接种环取最高耐受浓度培养物划线接种于含相应金属离子的固体平板上，37℃培养24～72h。根据平板菌落形态分别挑取单菌落再接种至液体金属选择培养基进行验证，循环三次，以获得金属耐受能力较好的纯菌株。
所述步骤d可以进一步包括：将筛选获得的耐重金属单菌落分别接种于相应的适当浓度的液体金属选择培养基中，37℃150r/min培养24～48h。12000r/min离心5min，取上清用ICP-MS方法测定金属离子浓度。
ICP-MS仪器测试条件：反射功率1550w，采样深度7mm，载气流量1.04L/min，雾化室温度2℃。Zn的积分时间为0.30S，重复测定3次。提升速度0.30rps，提升时间45S，稳定时间30S。
重金属去除率计算公式为：
P=[（C0-C）/C0]×100%
P：去除率（%）；
C0：菌处理前金属离子浓度；
C：菌处理后金属离子浓度。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一株铜绿假单胞菌ZC6，包含下述基因序列：
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为解决上述技术问题，本发明再提供了一株铜绿假单胞菌ZC6，采用如下方法进行鉴定时，包含下述基因序列：
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鉴定方法：PCR扩增采用细菌16SrDNA通用引物：27f(5'-AGAGTTTGATCMTGGC-TCAG-3')和1541r(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')。PCR反应体系（50μL）：MgCl2（1.5mM）、基因组DNA（10ng）、dNTP（200μM）、引物（0.4μM）和TaqDNA聚合酶（1.25U）。反应条件：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环。按PCR回收试剂盒（TIANgelMidiPurificationKit，Dp209，TIANGEN）的说明书操作，纯化PCR产物，测序由上海生物工程有限公司完成。
测得的基因序列为：
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挑取各菌种纯培养物单菌落，接种于BUG培养基平板，33℃恒温培养24h，转接1-2代。在无菌条件下，使用Inoculatorz棉签从BUG平板中沾取直径约3mm的菌落接种于IF-A接种液中，将浊度调整为90-98%。菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，每孔100μL。微孔板33℃恒温培养16-24h，使用BiologGenIIIMicroStation自动微生物鉴定系统进行鉴定。
Biolog微生物鉴定系统利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，在BiologGenIII微孔板上对微生物进行94种表型测试（71种碳源利用、23种化学敏感性测试）。通过检测微生物代谢过程中产生的氧化还原物质与四唑类物质（如TTC、TV）发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得出鉴定结果，见图4。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种所述铜绿假单胞菌ZC6及其在去除重金属污染中的应用。
本发明有益的技术效果在于：通过金属选择培养基的制备；耐重金属菌株的富集驯化;耐重金属菌株的筛选及复筛；菌体对重金属去除能力的检测试验，从土壤和水体中建立合理、有效的去除重金属菌株的筛选方法，得到适合需要的菌株。本发明应用于重金属污染的治理，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低等优点。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为具备去除Zn2+能力的菌株平板形态；
图2为菌株ZC6对不同浓度Zn2+的生长能力和去除效果；
图3为菌株ZC6对不同浓度Zn2+的去除能力比较；
图4为菌株ZC6的Biolog鉴定结果。
具体实施方式
去除重金属离子Zn2+的菌株筛选
1实验材料
1.1实验菌株
样品来源
从潍坊、日照、南京等地区采集不同地点的土样或水样，土壤样品在取样地的多处取1-4cm的表层土，分别混合。样品共计27份。
1.2实验仪器
立式压力蒸汽灭菌器（日本HirayamaHVE-50）；空气浴摇床（德国IKAKS4000ic）；分析天平（瑞士MettlerToledoPL602-S）；恒温培养箱（德国MMMIncucell111）；移液枪（德国Eppendorf）；台式高速离心机（德国Eppendorf5417R）；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，美国Agilent7700X）等。
1.3实验试剂
硫酸锌[ZnSO4×7H2O]化学试剂为分析纯。计算金属离子的质量分数，分别溶于去离子水中配成10g/L的贮藏液。
1.4培养基
基础培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）—牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0。
金属选择培养基：基础培养基灭菌后，将金属贮藏液根据浓度要求添加于培养基中。
2实验方法
2.1金属选择培养基的制备
计算硫酸锌[ZnSO4×7H2O]中金属离子的质量分数，溶于去离子水中配成10g/L的贮藏液。配制基础培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）—牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl5.0。基础培养基灭菌后，将金属贮藏液根据浓度要求添加于培养基中。
2.2.耐重金属菌株的富集驯化
取10g环境采集样品加入90mL液体牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养，37℃150r/min培养24h；取1mL富集培养液分别接种于含0.1g/L不同金属离子的新鲜液体培养基，37℃150r/min培养；待金属选择培养基混浊后，从中取1mL培养液接种于含0.2g/L金属离子的液体培养基中，逐级类推提高金属离子浓度。根据菌体对各金属耐受程度的不同，选取较高浓度的耐受生长条件进行多次驯化培养。
2.3耐重金属菌株的筛选及复筛
用接种环取最高耐受浓度培养物划线接种于含相应金属离子的固体平板上，37℃培养24～72h。根据平板菌落形态分别挑取单菌落再接种至液体金属选择培养基进行验证，循环三次，以获得金属耐受能力较好的纯菌株。
2.4.菌体对重金属去除能力的检测
将筛选获得的耐重金属单菌落分别接种于相应的适当浓度的液体金属选择培养基中，37℃150r/min培养24～48h。12000r/min离心5min，取上清用ICP-MS方法测定金属离子浓度。
ICP-MS仪器测试条件：反射功率1550w，采样深度7mm，载气流量1.04L/min，雾化室温度2℃。Zn的积分时间为0.30S，重复测定3次。提升速度0.30rps，提升时间45S，稳定时间30S。
重金属去除率计算公式为：
P=[（C0-C）/C0]×100%
P：去除率（%）；
C0：菌处理前金属离子浓度；
C：菌处理后金属离子浓度
2.5时间和金属离子浓度对去除率的影响
Zn2+选择0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L共5组金属浓度的培养基，从平板上挑取单菌落接种至100mL低金属浓度培养基，37℃振荡培养24h后取1mL菌液转接至较高一级浓度培养基，逐级类推至最高浓度。每个浓度每24h取样测定菌液OD600，离心取上清测定溶液金属含量，连续监测6～7天。
2.6菌株对相应金属离子的最高耐受浓度研究
根据已获得的时间和金属离子浓度对去除率的影响，逐级加大金属浓度，待培养基浑浊后以1%接种量转接高一级金属浓度的培养基，直至无生长现象。每一级浓度培养6天后取样，离心取上清测定溶液金属含量。
2.7菌株鉴定
16SrDNA基因序列PCR反应：上游引物：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，下游引物：TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件：94℃5min；94℃45s，58℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃10min。
测得的基因序列为：
1acgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggat
61tcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccg
121gaaacgggcgctaataccgcatacgtcctgagggagaaagtgggggatcttcggacctca
181cgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcg
241acgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccaga
301ctcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccat
361gccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcag
421taagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgc
481cagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgc
541gcgtaggtggttcagcaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatcc
601aaaactactgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatg
661cgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactg
721aggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacg
781atgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcga
841ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaa
901gcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatg
961ctgagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatgg
1021ctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgt
1081ccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggagg
1141aaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctaca
1201atggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgt
1261agtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaat
1321cagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatggga
1381gtgggttgctccagaagtagctagtctaaccgcaagggggacggttaccacggagtgatt
1441catgactgg。
3实验结果与分析
3.1重金属Zn2+耐受菌株的筛选
Zn2+耐受菌株：经过含Zn2+的培养基驯化筛选以及反复纯化验证后，有9株细菌在Zn2+浓度达到0.6g/L时可保持正常速度生长，分别标记为Zn4、Zn5、Zn6、Zn8、Zn10、ZnB11、ZnC2a、ZnC2b、ZC6。
3.2对重金属Zn2+的去除能力的测定
Zn2+耐受菌共有9株，其中有2株表现出了对Zn2+的去除能力，其余7株虽然可以在较高浓度Zn2+的环境中生长，但是溶液上清中的Zn2+含量未见明显减少。表1列出了2株有除Zn2+能力的菌株情况，其纯培养的平板形态如图1所示。对效果较好的ZC6进行了深入研究。
表1具备去除Zn2+能力的菌株性质
| 菌株编号 | Zn2+去除率 | 平板菌落形态 | |
| 1 | Zn10 | 2.5% | 浅绿色小菌落，表面光滑、湿润，边缘整齐 |
| 2 | ZC6 | 12.6% | 白色菌落，表面光滑、湿润，边缘整齐 |
3.3时间和金属离子浓度对去除率的影响
菌株ZC6在Zn2+浓度为0.1g/L时，随时间增加，去除率缓慢上升，在第三天达到最高值40.1%，菌液浓度指标OD600在此时也达到最高，随后菌体衰老裂解，OD600逐步降低，但Zn2+浓度未出现明显回升，可能是由于该菌与金属发生不可逆作用，菌体死亡不影响可溶性金属含量（图2a）。
Zn2+浓度为0.2g/L时，菌株ZC6生长量降低，菌液OD600在第二天达到最高后逐步降低，去除金属能力明显减弱，在第三天达到最高去除率12.2%（图2b）。
Zn2+浓度为0.3g/L时，菌株ZC6在第二天达到最大生长量且OD600与Zn2+浓度0.2g/L时相差不大，但其后菌体迅速衰亡，金属去除率在第五天达到最高值11.2%（图2c）。
Zn2+浓度为0.4g/L时，菌株ZC6的生长能力进一步降低，第一天的OD600仅为前两个浓度生长量的一半左右且衰亡迅速。去除金属能力与之前相比变化不大，在第六天达到最高去除率10.7%（图2d）。
Zn2+浓度为0.5g/L时，菌株ZC6的生长能力很差，生长至第三天才有明显浑浊且迅速衰亡，在第五天金属去除能力达到最高值16.3%（图2e）。
将五组浓度Zn2+的最高去除率做比较，如图3所示，菌株ZC6在Zn2+浓度较低时具有较好的去除率，当Zn2+浓度升高，菌体对Zn2+的耐受能力降低，生长受到抑制，去除金属的能力维持在较低水平。
所有上述为本发明的首要实施方法，并没有设定限制以其他形式实施这种新方法和/或新产品。本领域技术人员将利用这一重要信息，对上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有基于本发明的修改或改造新方法，属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (2)
1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）ZC6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC8827。
2.一种如权利要求1中所述铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）ZC6在去除重金属离子Zn2+中的应用。
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