CN103920192B

CN103920192B - 一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103920192B
Application number: CN201410136642.4A
Authority: CN
Inventors: 唐志辉; 李箐; 廖运茂
Original assignee: Peking University Hospital Of Stomatology
Current assignee: Peking University Hospital Of Stomatology
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2034-04-04
Also published as: CN103920192A

Abstract

本发明涉及一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法及应用，该方法包括以下步骤：步骤1，配制海藻酸钠水溶胶；步骤2，利用步骤1的水溶胶制成海藻酸钠-壳聚糖水溶胶；步骤3，配制甘油磷酸钠水溶液，将其在搅拌条件下加入所述海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，形成均一溶胶；步骤4，向步骤3制备的均一溶胶中加入脂联素，并加入Ca²⁺，搅拌均匀；步骤5，将煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中并混合均匀，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体。本发明针对现有拔牙窝牙槽骨壁的缺损和缺失的修复技术的不足，大大改善普通凝胶载体的生物活性，生物相容性、机械耐受性及缓释性能，为拔牙窝牙槽骨壁的缺损和缺失的治疗提供一种新型修复材料。

Description

一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物活性因子缓释载体制备技术领域，特别是涉及一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，以及该复合凝胶载体在骨科修复，特别是拔牙窝牙槽骨壁保留治疗术方面的应用。

背景技术

牙齿因创伤、炎症等病因被拔除后，剩余牙槽嵴将发生持续性骨吸收，导致剩余牙槽骨高度下降，宽度变窄。牙槽骨萎缩不仅造成义齿修复困难，而且影响患者的咀嚼功能和颜面美观。因此，研究牙缺失后剩余牙槽骨吸收发生的机制与防治技术，对于研制新的治疗药物和开发新的治疗手段具有重要的临床应用价值。

牙槽嵴位点保留是在拔牙的当时对牙槽骨吸收过程进行干预，通过人工骨替代材料维持拔除牙齿遗留的空隙，达到牙槽嵴保留目的。为促进拔牙窝骨壁的保留，促进成骨作用的生物活性因子的研究和应用被关注。例如重组骨形态发生蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2），血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等。近年来，骨代谢的研究发现，脂肪组织分泌的细胞因子—脂联素（adiponectin，APN）具有调节人成骨细胞的表达、促进成骨细胞的增殖与分化、抑制破骨细胞形成的功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，以提高骨替代产品的生物活性、生物相容性、机械耐受性，并使其具有缓释性能。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将海藻酸钠加入蒸馏水中，以乙酸或盐酸调节胶体的pH为4～5，配制成2wt%～4wt%的海藻酸钠水溶胶；

步骤2，取步骤1中制备的海藻酸钠水溶胶，在搅拌条件下向其中加入壳聚糖制成海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，其中海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为0.15～1.5；

步骤3，配制甘油磷酸钠水溶液，将其在搅拌条件下加入所述海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量配比在5.6～22.4，形成均一溶胶；

步骤4，搅拌条件下向步骤3制备的均一溶胶中加入占均一溶胶重量0.1%～0.3%的脂联素，并加入占海藻酸钠重量0.1%～0.5%的Ca²⁺，搅拌均匀；

步骤5，将煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中并混合均匀，煅烧骨粉与所述溶胶的重量配比在0.1～0.25；调节溶胶pH至6.5～7.2，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体。

如上所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，优选的，步骤5中所用煅烧骨粉的制备方法为：选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得煅烧骨粉。

如上所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，优选的，所述煅烧骨粉的骨基质晶相羟基磷灰石:β-磷酸三钙=1:3。

如上所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，优选的，所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或几种。

如上所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，优选的，步骤2，海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为0.2～1.2；步骤3，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量配比在8.5～18，形成均一溶胶；步骤5，煅烧骨粉与溶胶的重量配比在0.1～0.25,混合均匀，再调节溶胶pH至6.7～7.0。

如上任一项载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法所制得的产品在骨科修复中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明针对现有拔牙窝牙槽骨壁的缺损和缺失的修复技术的不足，通过在拔牙窝局部注射一种新型载生物活性因子的温敏（体温，37℃）复合凝胶载体，在拔牙窝原位形成凝胶（in situ gel）体。凝胶体系以壳聚糖与藻酸钠形成互穿的网络结构为支架，多孔Ca-P骨粉充填于这种网络结构中，溶胶体系中的脂联素则以凝胶体为载体，大大改善普通凝胶（in situ gel）载体的生物活性，生物相容性、机械耐受性及缓释性能，为拔牙窝牙槽骨壁的缺损和缺失的治疗提供一种新型修复技术。

材料的固化时间对于临床操作影响较大，应当具有适宜的固化时间，时间过短将导致过早凝固，堵塞注射器；固化时间过长，则导致临床等待时间过长，容易造成材料流失，软组织瓣缺血等情况发生。理想的固化时间应当在7～10分钟这一区间内，方便术者操作。本发明中采用的温敏载体在加入了适量的骨粉后，固化时间大大缩短，37℃下8分钟左右即完全固化。这是由于骨粉具有大量孔隙，吸附水分，降低了材料中自由水分子的比率，从而加速凝固。本发明方法中，当GPS/CS为8.5～18，AS/CS为0.2～1.2，pH为6.7～7.0，并加入10%～25%的双相骨粉时，胶凝温度可调节为约37℃。

附图说明

图1为不同摩尔比的GPS/CS对载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝时间的影响；

图2为pH对载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝时间的影响；

图3为本发明载生物活性因子的温敏复合凝胶载体中Ca-P骨粉的XRD图谱；

图4为本发明实施例1制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体表面的SEM形貌；

图5为实施例1制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体在人工体液中浸泡240h后载体表面的降解形貌。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

步骤1，将海藻酸钠在60℃下溶解到100mL的蒸馏水中，同时机械搅拌10min，超声15min，以乙酸调节胶体的pH为4，制成2wt%的海藻酸钠水溶胶；

步骤2，分别取步骤1制备的海藻酸钠水溶胶，搅拌条件下加入壳聚糖，在60℃下机械搅拌10min，超声15min，制成的海藻酸钠-壳聚糖水溶胶中海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为0.2；

步骤3，配制质量浓度为50%的甘油磷酸钠水溶液：将甘油磷酸钠水溶液搅拌条件下加入海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，由于溶胶pH为4～5，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量比为18，形成均一溶胶；

步骤4，搅拌条件下向步骤3制备的均一溶胶中加入均一溶胶重量0.1%～0.3%的脂联素，并加入海藻酸钠重量0.1%～0.5%的Ca²⁺（以磷酸氢钙形式加入），搅拌均匀；AS与CS在GPS与Ca2⁺络合的协同作用下发生部分交联。

步骤5，将按照煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中，煅烧骨粉与溶胶的重量配比在0.1～0.25,混合均匀，然后用NaOH溶液调节溶胶pH至7.0，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体。由于Ca-P骨粉的加入，会大量吸收胶体中的水分，促成凝胶的形成。溶胶pH至7.0有利于胶凝。

步骤5中所用煅烧骨粉的制备方法为：选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用磷酸氢二铵对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得煅烧骨粉（优选的孔隙率达70%-80v/v%，粒度为60-100目）。

实施例1制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝温度为37℃，胶凝时间为10.5min，APN缓释时间为150h。该载体在生理体温（37℃）下经8～15min可转变为乳白色凝胶，凝胶为均质固相，具有一定强度和弹性，可以根据模具随意塑形。

APN缓释时间测试方法为：采用37℃人工体液中脂联素缓释模型进行观察，测定不同时间段脂联素的释放量。对照组壳聚糖为缓释载体时，释放期仅为12小时。

实施例2

步骤2，分别取步骤1制备的海藻酸钠水溶胶，搅拌条件下加入壳聚糖，在60℃下机械搅拌10min，超声15min，制成的海藻酸钠-壳聚糖水溶胶中海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为0.4；

步骤3，配制质量浓度为50%的甘油磷酸钠水溶液：将甘油磷酸钠水溶液搅拌条件下加入海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，由于溶胶pH为4～5，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量比为22.4，形成均一溶胶；

步骤4，搅拌条件下向步骤3制备的均一溶胶中加入均一溶胶重量0.1%～0.3%的脂联素，并加入海藻酸钠重量0.1%～0.5%的Ca²⁺（以磷酸氢钙形式加入），搅拌均匀；

步骤5，将按照煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中，煅烧骨粉与溶胶的重量配比在0.1～0.25,混合均匀，然后用NaOH溶液调节溶胶pH至6.5，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体。由于Ca-P骨粉的加入，会大量吸收胶体中的水分，促成凝胶的形成。

步骤5中所用煅烧骨粉的制备方法同实施例1。

实施例2制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝温度为37℃，胶凝时间为9.5min，APN缓释时间为180h。该载体在生理体温（37℃）下经8～15min可转变为乳白色凝胶，凝胶为均质固相，具有一定强度和弹性，可以根据模具随意塑形。

实施例3

步骤1，将海藻酸钠在60℃下溶解到100mL的蒸馏水中，同时机械搅拌10min，超声15min，以盐酸调节胶体的pH为5，制成3wt%的海藻酸钠水溶胶；

步骤2，分别取步骤1制备的海藻酸钠水溶胶，搅拌条件下加入壳聚糖，在60℃下机械搅拌10min，超声15min，制成的海藻酸钠-壳聚糖水溶胶中海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为0.8；

步骤3，配制质量浓度为50%的甘油磷酸钠水溶液：将甘油磷酸钠水溶液搅拌条件下加入海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，由于溶胶pH为4～5，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量比为15，形成均一溶胶；

步骤4，搅拌条件下向步骤3制备的均一溶胶中加入均一溶胶重量0.1%～0.3%的脂联素，并加入海藻酸钠重量0.1%～0.5%的Ca²⁺（以磷酸二氢钙形式加入），搅拌均匀；

步骤5，将按照煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中，煅烧骨粉与溶胶的重量配比在0.1～0.25,混合均匀，然后用NaOH溶液调节溶胶pH至7.2，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体。由于Ca-P骨粉的加入，会大量吸收胶体中的水分，促成凝胶的形成。

步骤5中所用煅烧骨粉的制备方法与实施例1相同。

实施例3制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝温度为37℃，胶凝时间为8.0min，APN缓释时间为210h。该载体在生理体温（37℃）下经8～15min可转变为乳白色凝胶，凝胶为均质固相，具有一定强度和弹性，可以根据模具随意塑形。

实施例4

步骤1，将海藻酸钠在60℃下溶解到100mL的蒸馏水中，同时机械搅拌10min，超声15min，以乙酸调节胶体的pH为4.5，制成3wt%的海藻酸钠水溶胶；

步骤2，分别取步骤1制备的海藻酸钠水溶胶，搅拌条件下加入壳聚糖，在60℃下机械搅拌10min，超声15min，制成的海藻酸钠-壳聚糖水溶胶中海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为1.2；

步骤3，配制质量浓度为50%的甘油磷酸钠水溶液：将甘油磷酸钠水溶液搅拌条件下加入海藻酸钠-壳聚糖水溶胶，由于溶胶pH为4～5，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量比为8.5，形成均一溶胶；

步骤5，将按照煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中，煅烧骨粉与溶胶的重量配比在0.1～0.25,混合均匀，然后用NaOH溶液调节溶胶pH至6.7，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体。由于Ca-P骨粉的加入，会大量吸收胶体中的水分，促成凝胶的形成。

步骤5中所用煅烧骨粉的制备方法与实施例1相同。

实施例4制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝温度为37℃，胶凝时间为9min，APN缓释时间为230h。该载体在生理体温（37℃）下经8～15min可转变为乳白色凝胶，凝胶为均质固相，具有一定强度和弹性，可以根据模具随意塑形。

本发明载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法中：

1、生长因子的选择

骨组织改建包括两个方面：成骨细胞（osteoblasts）参与的骨形成过程和破骨细胞（osteoclasts）介导的骨吸收过程，二者共同构成了一个精细的动态平衡过程。骨形成与骨的平衡，受机体局部和全身因素的影响，通过改变成骨细胞以及破骨细胞的细胞分化和细胞活性得以实现。因此，可以在拔牙窝局部使用生物活性因子，促进局部成骨细胞的成骨能力或抑制破骨细胞的骨吸收活性，达到牙槽嵴骨壁保留的目的。发明人近年详细研究了脂联素抑制破骨细胞功能的分子学机理，证实了在8～10周龄脂联素基因敲除小鼠背部肌肉内移植股骨后，其生长速度较野生对照组明显迟缓；在合并骨质疏松条件下，脂联素复合羟基磷灰石材料可以促进去势兔下颌骨缺损的修复。

近年来，骨代谢的研究发现，脂肪组织分泌的细胞因子（脂联adiponectin，APN）的生物学效应是通过脂联素受体介导的，调节人成骨细胞的表达，促进成骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞的形成。除了具有抑制破骨细胞的骨吸收活性，增加成骨细胞的活性，增加骨基质的矿化增量外，还能改善机体胰岛素抵抗等方面的作用。APN是由脂肪细胞特异性分泌的一种脂肪因子，通过自分泌、旁分泌和远距离分泌方式，起多种生物学作用，主要参与机体糖脂代谢、能量代谢、增加胰岛素敏感性、抗炎和抗动脉粥样硬化的生物学作用。

2、生物活性因子缓释技术

随着细胞生物学、分子生物学以及生物材料学理论与技术的进步，本发明方法应用合成技术与方法制备载药聚合物，通过组织工程方法和应用脂联素的缓释作用促进牙槽骨的修复，为预防剩余牙槽嵴萎缩开辟了一条新的途径。传统的活性生长因子缓释系统中，人体在摄入生物活性因子后，生物活性因子一次性在人体内释放，导致宿区中该生长因子的浓度在很大的范围内波动，在生物活性因子刚被释放后，血清中的生长因子浓度会达到一个峰值，维持时间较短，然后生物活性因子的浓度会迅速下降。生物活性因子浓度达到峰值时，会出现生物利用度低，甚或给人体带来某些副作用，而在生物活性因子浓度迅速降低之后，又会导致生物活性因子疗效的下降。为了解决上述问题，发明人在本发明方法重利用了可以将副作用减小到最低并延长药效时间的生物活性因子缓释技术。

壳聚糖（chitosan,CS）是甲壳素（chitin）的N-脱乙酰基的产物，是一种天然的高分子多糖。CS在自然界中广泛存在于甲壳类动物的外壳、骨骼中，以及真菌类生物的细胞壁中，因而壳聚糖是来源十分广泛的一种天然多糖。已有的研究结果表明，CS具有很好的生物降解性、生物相容性以及良好的抗菌作用。实验表明，当脂联素以壳聚糖凝胶为载体时，脂联素在48小时内即释放完毕，而在本发明实施例1制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体中可持续240小时以上。

3、温敏凝胶技术

现阶段，尽管以壳聚糖为载体制作了多种缓释系统，但目的物主要为药物，适合于体内埋植的生物活性因子缓释体系的研究尚处于初始阶段，在生物相容性，机械耐受性及缓释特性方面还存在许多不足。近年来，基于温度敏感性的在体原位凝胶给药系统成为药剂学及生物材料领域研究的一个热点，其特点是以液体给药后，在药用部位因温度变化刺激(体温，37℃)而发生相转变，固化或形成凝胶，从而控制药物的释放。研究发现壳聚糖（CS）／甘油磷酸钠体系(Sodium Glycerphosphate，GPS)水凝胶具有温敏性，在药物控释、智能生物材料等方面具有良好的应用前景。GPS在生物医药中，常作为肠外营养的磷补充剂，用以满足人体每天对磷的需要。磷也参与骨质的形成，以磷脂形式参与细胞膜的组成，同时磷与许多代谢中的酶活性有关，在能量代谢中的作用也至关重要。甘油磷酸钠在水性凝胶中，是一种安全有效的交联剂，以甘油磷酸钠（GPS）和壳聚糖（CS）为主要成分，可合成温度敏感性水凝胶。研究发现，该温敏水凝胶在室温（20℃）和体温（37℃）环境下具有“溶胶-凝胶”的相变特性。通过显微镜和扫描电镜观察该温敏载体的微观结构，以确定其是否能够作为生物活性因子的温敏载体。实验中，吸取5ml GPS/CS复合溶液，装入10ml离心管，将实验组离心管插入37℃恒温水浴箱中，将对照组插入试管架暴露在室温中（室温为20℃），每组各8个样本。每30秒钟检测凝胶形成的情况，GPS/CS的相对比例对胶凝时间的影响试验结果如图1所示；胶体的pH对胶凝时间的影响如图2所示。胶体中GPS/CS的摩尔比对胶凝温度的影响如表2所示。图1为不同摩尔比的GPS/CS对载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝时间的影响；图2为pH对载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的胶凝时间的影响；

表2GPS/CS的摩尔比对胶凝温度的影响

表中最左侧一列为凝胶温度；第二列为GPS/CS摩尔比为6时在不同凝胶温度下的凝胶时间。

CS内富含氨基和羟基，可形成氢键，因此CS不溶于水和有机溶剂。在酸性溶液中CS上的碱性氨基能够质子化形成NH³⁺，使CS分子链间带同种电荷而相互排斥，CS分子可溶于稀酸溶液中，本发明中选用醋酸水溶液为溶剂。GPS为弱碱性化合物，结构中存在羟基和磷酸根负离子，是一种对人体安全的双官能团阴离子偶联剂，磷酸根负离子可与壳聚糖的质子化氨基NH³⁺通过静电引力作用进行交联，使CS溶液产生凝胶化，形成三维凝胶网络。凝胶网络的形成与胶体浓度，GPS/CS的相对比例及环境温度关，凝结机理是凝胶中存在的静电作用，氢键及亲、疏水平衡的共同作用结果。凝胶化复合物的IR光谱与CS、GPS的IR谱图比较，吸收峰的变化和位移说明二者不是简单的物理混合，GPS／CS复合物红外光谱表征，复合凝胶的IR光谱不同于CS和GPS的IR谱图中CH³⁺。在实验中发现，2850～2960cm处的-H伸缩振动吸收峰有明显增强，而GPS中典型的P=O伸缩振动吸收双峰910cm和960cm，在复合物位的IR谱图中位移至920cm和970cm出现。吸收峰的变化和位移说明GPS的磷酸根和CS的氨基存在偶极静电作用，以及羟基间的氢键作用，而不是简单的物理混合。温敏凝胶为骨科及牙槽嵴修复手术过程带来很大方便。

4、壳聚糖/海藻酸钠复合凝胶

壳聚糖/海藻酸钠(CS/AS)温敏凝胶体系的制备：壳聚糖作为自然界中唯一带正电荷的天然大分子多糖，已证实具有良好的生物相容性和适宜的生物降解性，并且降解产物安全无毒，本发明中选择GPS为交联剂。海藻酸钠系存在于褐藻类中的天然高分子，从其结构上看是由β-1,4结构的D型甘露糖醛酸的钠盐(M)和α-1,4结构的L型古罗糖醛酸的钠盐(G)共聚而成，其可以与二价金属离子（Ca²⁺,Mg²⁺）络合形成水凝胶。

由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，壳聚糖和海藻酸钠可以通过正负电荷吸引形成聚电解质膜。藻酸钠AS是一种高粘性的高分子化合物，亲水性强，形成的真溶液具有柔软性，可制成强韧的纤维或薄膜，具有防止胶体龟裂的作用，在药剂上主要用作助悬剂、乳化剂、黏稠剂、微囊的囊材等，在口腔材料应用中常用作印模材料。AS在美国可用于馅饼的馅心、肉类沙司、肉汁、冷冻食品、巧克力、奶油硬糖等，其用量为0.1%～0.5%，它作为海藻胶的一种，以其固有理化性质，能够改善食品的性质和结构。藻酸钠在欧美、日本诸国已被列为不受限制使用的安全的食品添加剂。AS的这些理化特性说明其具有良好的生物相容性。

测定了复合胶体浓度对凝胶体抗压强度的影响。分别配制3wt%浓度CS及AS胶体，采用压缩法，以破裂时承受的最大压力代表凝胶体的机械强度，每批取10个样本测定，取其平均值，凝胶体密闭放置72h,观察直径的变化率。以CS为标准，对AS/CS的不同体积比抗压强度进行了比较，结果见表2。

这种复合水凝胶在Ca²⁺的协同交联作用下，抗压强度得到改善，在相同浓度下，较CS水凝胶可提高1.5～1.9倍左右，胶凝过程中同时降低了收缩量（经72h密闭存放），收缩量仅为CS的0.7～0.9倍，改善了与组织的结合界面,参见表2。

表2AS/CS(v/v)相对抗压强度及相对收缩量

AS/CS	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
						抗压强度（CS的倍率）	1.5	1.6	1.7	1.8	1.9

收缩量（CS的倍率）

0.9

0.8

0.7

5、可注入复合温敏凝胶体系

本发明除选择生物相容性好的GPS为交联剂而外，还引入藻酸钠与壳聚糖形成贯穿网络结构，并利用这种凝胶网络结构包裹多孔的Ca-P骨粉。本发明中的Ca-P骨粉为含磷酸钙的双相钙磷陶瓷，系采用骨龄为6个月的乳牛骨煅烧并改性而成，它既保留了无机钙磷矿物质，又基本保留了骨组织的多孔结构，在原合成工艺的基础上引入磷酸根后部分HA转变为TCP，图3为本发明载生物活性因子的温敏复合凝胶载体中Ca-P骨粉的XRD图谱。新型骨粉的粒度为60～100目，多孔结构的孔隙率为60%～80%（体积比），复合温敏溶胶包覆Ca-P骨粉，图4为本发明实施例1制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体表面的SEM形貌，图5为本发明实施例1制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体在人工体液中浸泡240h后载体表面的降解形貌。本发明方法制备的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体采用专用注射器可方便进行注入操作。本发明的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体除作为脂联素的载体而外，也可运用于其他生物活性植入因子的载体，如BMP-2、血小板生长因子等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，将海藻酸钠加入蒸馏水中，以乙酸或盐酸调节胶体的pH为4～5，配制成2wt％～4wt％的海藻酸钠水溶胶；

步骤4，搅拌条件下向步骤3制备的均一溶胶中加入占均一溶胶重量0.1％～0.3％的脂联素，并加入占海藻酸钠重量0.1％～0.5％的Ca²⁺，搅拌均匀；

步骤5，将煅烧骨粉加入步骤4制备的溶胶中并混合均匀，煅烧骨粉与所述溶胶的重量配比为0.1～0.25；调节溶胶pH至6.5～7.2，即制得载生物活性因子的温敏复合凝胶载体；步骤5中所用煅烧骨粉的制备方法为：选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66～1.5；然后在800℃～1100℃温度条件下煅烧改性后的骨原料以彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得煅烧骨粉。

2.根据权利要求1所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述煅烧骨粉的骨基质晶相羟基磷灰石:β-磷酸三钙＝1:3。

3.根据权利要求1所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或几种。

4.根据权利要求1至3任一项所述的载生物活性因子的温敏复合凝胶载体的制备方法，其特征在于，步骤2，海藻酸钠/壳聚糖的相对重量比为0.2～1.2；步骤3，控制甘油磷酸钠/壳聚糖的质量配比在8.5～18，形成均一溶胶；步骤5，煅烧骨粉与溶胶的重量配比在0.1～0.25,混合均匀，再调节溶胶pH至6.7～7.0。