CN103919275B - 一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及烟草香料制备领域，特别是涉及一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法。本发明提供一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，包括如下步骤：将复合酶缓冲液水溶液加入废弃烟末中，进行充分反应；将步骤1所得反应产物过滤，所得水溶液用有机溶剂提取；将步骤2所得的有机相浓缩；将步骤3所得产物加乙醇复溶，并再次充分浓缩以除去残留的有机物，所得产物过膜，即得所述烟用香料。本发明将生产过程中产生的废弃烟末实现再利用，降低了成本，提高了经济收益。

Description

一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法

技术领域

本发明涉及烟草香料制备领域，特别是涉及一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法。

背景技术

卷烟在生产过程中，尤其在各个制丝工艺段，加工方法和加工设备较为繁杂，在每个环节中必然会产生各种废弃物，并且在一定目数以下的废弃物无法为制造薄片所用，最终只能通过焚烧处理来消化，这样不仅浪费资源，又造成环境污染。据统计美国1974年在卷烟生产过程中就有3千万镑的烟末废料产生，若对这些废弃物进行“资源化”利用，不仅可以低成本获得符合绿色卫生标准的天然化工原料，而且能够保护环境，促进卷烟行业的健康发展。因此如能加以利用，将大大提高烟叶的利用率。

随着中国烟草行业降焦减害工程的实施，卷烟中焦油含量的不断降低，烟气中的香味成分也相应减少，因此对卷烟香味补偿技术的要求也日益提升。香味补偿技术已成为中式卷烟的重要研究内容和方向。回收再利用的烟草废弃物作为产品可用的香原料，香味成分源于天然，不失为一种具有很高的可行性与经济价值的方案。

微生物、酶在烟叶生产、调制、陈化、加工和贮存期间起着非常重要的作用。19世纪50年代中叶就开始有微生物和酶在烟草中的作用研究。酶水解法具有条件温和、接近自然，不破坏糖苷配体结构，且工艺简单、无污染物排放等优势。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于回收利用废弃烟末、并制备出优质的烟用香料，这类香料源于烟草自身，从天然中提取，避免外加合成香精香料引起的各种问题，并实现变废为宝，以用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，包括如下步骤：

（1）反应：将复合酶缓冲液水溶液加入废弃烟末中，进行充分反应；

（2）萃取：将步骤1所得反应产物过滤，所得水溶液用有机溶剂提取；

（3）浓缩：将步骤2所得的有机相浓缩；

（4）烟用香料：将步骤3所得产物加乙醇复溶，并再次充分浓缩以除去残留的有机物，所得产物过膜，即得所述烟用香料。

所述复合酶缓冲水溶液按质量浓度计，由如下组分组成：0.01-5%甘露聚糖酶、0.01-5%无花果蛋白酶、0.01-5%糖化酶、0.01-5%α淀粉酶、0.01-5%木聚糖酶、0.01-5%脂肪酶和1-10%果胶酶，pH为4.0-6.0。

优选的，所述复合酶缓冲水溶液按质量浓度计，由如下组分组成：0.5-2%甘露聚糖酶（endo-1,4-beta-mannanase，EC3.2.1.78，活性≥1000000MNU/g）、0.5-2%无花果蛋白酶（ficain，EC3.4.22.3，活性≥500000MCU/g）、0.5-2%糖化酶（Glucan1,4-alpha-glucosidase，EC3.2.1.3，活性≥40000μ/g）、0.5-2%α淀粉酶（alpha-amylase，EC3.2.1.1，活性≥40000μ/g）、0.5-2%木聚糖酶（Xylanase，EC3.2.1.8，活性≥1000000μ/g）、0.5-2%脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，活性≥1000000LUN/g)和3-8%果胶酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15，活性≥124000μ/g），pH为4.0-6.0。

优选的，所述步骤1中，反应的温度为20-55℃，反应时间为4-48h。

更优选的，所述步骤1中，反应的温度为45-55℃，反应时间为20-28h。

优选的，所述步骤1中，所述废弃烟末与缓冲液的质量体积比以g：ml计为1：1-20。

更优选的，所述步骤1中，所述废弃烟末与缓冲液的质量体积比以g：ml计为1：10-20。

优选的，所述步骤2中，有机溶剂选自乙醚、乙醇或甲基叔丁基醚中的一种或多种的选择。

更优选的，所述步骤2中，反应产物过滤后所得的滤渣还使用有机溶剂超声提取10-30min，所得有机相与水溶液用有机溶剂提取所获得的有机相合并。

在使用有机溶剂对水溶液或滤渣进行提取时，本领域技术人员可根据经验，加入适当量的有机溶剂，有必要时亦可进行多次提取以保证提取完全。

优选的，所述步骤3中，有机相浓缩至有机相含量低于5%。

更优选的，所述步骤3中，有机相浓缩至有机相含量低于5%的具体方法为：先将步骤2所得的有机相进行适当浓缩，冷冻除去不溶物后，再进一步浓缩至有机相含量低于5%（质量百分比浓度）。

本领域技术人员可根据经验选取适当的浓缩方法，如通过旋转蒸发仪等。

在使用乙醇复溶时，本领域技术人员可根据经验加入适当剂量的乙醇。

优选的，所述步骤4中，所得产物过0.45μm膜。

所述方法通过反应、萃取、浓缩及复溶、再浓缩等步骤，制备获得烟用香料，并由评吸专家为主体组成的评吸小组对烟用香料进行香味评吸比较。经评吸认为与空白卷烟相比，添加提取物后明显改善卷烟香气，提高烟气的丰富性，减轻杂气和刺激性。

具体评吸方法为：取4uL馏分添加于卷烟中。

本发明第二方面提供所述复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法在烟草香料制备领域的用途。

如上所述，本发明发明人利用复合酶的生物催化功能，可同时获得游离态与结合态的香味成分，香味物质含量高，处理方式天然、温和及环保；并完全以烟叶（废弃）为原料，所制备的产物不存在任何外加香精，使卷烟产品能够原汁原味的保持烟草特有的香味特征，安全性高。本发明将生产过程中产生的废弃烟末实现再利用，降低了成本，提高了经济收益。

附图说明

图1为本发明实施例1中评析结果的感官评价雷达图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等

MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATIN

STRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1

（1）反应：称10g废弃烟末与带塞的玻璃反应瓶中，加入150mL质量浓度为1%甘露聚糖酶、1%的无花果蛋白酶、1%的糖化酶、1%的α淀粉酶、1%的木聚糖酶、1%的果胶酶和1%脂肪酶、5%果胶酶（所述甘露聚糖酶活性≥1000000MNU/g，无花果蛋白酶活性≥500000MCU/g，糖化酶活性≥40000μ/g，淀粉酶活性≥40000μ/g，木聚糖酶活性≥1000000μ/g，脂肪酶活性≥1000000LUN/g，果胶酶活性≥124000μ/g，均由上海宝丰生化有限公司提供）的复合酶缓冲液水溶液（pH为5.05），在50℃温度下反应24h；

（2）萃取：反应后用无纺布过滤，水溶液用50mL乙醚萃取，萃取两遍，滤渣用50mL乙醚超声提取15min，乙醚相合并；

（3）浓缩：36℃，850mbar浓缩乙醚相，-80℃冷冻、除去蜡脂等不溶物，进一步浓缩至乙醚含量低于5%；

（4）烟用香料：加5mL乙醇复溶，50℃，102mbar旋转蒸发除去残留的乙醚，过0.45μm的膜获得烟用香料，用乙醇定容至2mL；

（5）评吸：取4uL馏分添加于卷烟（四川X21，为一种下部单料烟，口味较平淡，适合用来作对比实验）中作为处理样，对照样即为空白卷烟；实验结果表明，处理样明显改善了卷烟香气，提高了烟气的丰富性，减轻了杂气和刺激性，烟气品质得到了提升，评析结果的感官评价雷达图对比如图1所示。

其中，共涉及6项指标，每项指标均分为5个档次：1为差；2为较差；3为中等；4为较好；5为好；

香气质：卷烟香气质越好分值越高，越差分值越低；

香气量：卷烟香气量越足分值越高，越少分值越低；

刺激性：卷烟烟气刺激性越小分值越高，越大分值越低；

丰富性：卷烟烟气越丰富分值越大；越差分值越低；

杂气：卷烟烟气杂气越少分值越高，越多分值越低；

余味：卷烟评吸后整体余味感越干净舒适分值越高，越差分值越低。

实施例2

使用同体积的水和复合酶缓冲液水溶液同时对烟末进行提取，进行对比实验，实验方法如实施例1所述，其中使用水提取时仅将复合酶缓冲液水溶液替换为水，其他方法均相同。利用GC/MS比较了对照样品（不加酶）与添加复合酶后部分香味成分的变化，结果显示：经复合酶后处理，茄酮含量是对照样品的2.7倍，大马酮是对照样的2.2倍，3-氧代-alpha-紫罗兰醇是对照的2.9倍，苯甲醇是对照的7.1倍，苯乙醇是对照的6.2倍，3-羟基-beta-大马酮是1.7倍，巨豆三烯酮1、2、3和4分别是1.2倍、1.4倍、1.4和1.5倍，氧化茄酮是对照的1.5倍，可见大部分烟叶中的香味成分都有不同程度的提升。

实施例3

（1）反应：称10g废弃烟末与带塞的玻璃反应瓶中，加入200mL质量浓度为0.5%甘露聚糖酶、2%的无花果蛋白酶、2%的糖化酶、2%的α淀粉酶、0.5%的木聚糖酶、0.5%的果胶酶和2%脂肪酶、3%果胶酶（所述甘露聚糖酶活性≥1000000MNU/g，无花果蛋白酶活性≥500000MCU/g，糖化酶活性≥40000μ/g，淀粉酶活性≥40000μ/g，木聚糖酶活性≥1000000μ/g，脂肪酶活性≥1000000LUN/g，果胶酶活性≥124000μ/g，均由上海宝丰生化有限公司提供）的复合酶缓冲液水溶液（pH为4.2），在45℃温度下反应28h；

（2）萃取：反应后用无纺布过滤，水溶液用50mL乙醚萃取，萃取两遍，滤渣用40mL乙醚超声提取25min，乙醚相合并；

（3）浓缩：36℃，850mbar浓缩乙醚相，-80℃冷冻、除去蜡脂等不溶物，进一步浓缩至乙醚含量低于5%；

（4）烟用香料：加5mL乙醇复溶，50℃，102mbar旋转蒸发除去残留的乙醚，过0.45μm的膜获得烟用香料，用乙醇定容至2mL；

（5）评吸：取4uL馏分添加于卷烟（四川X21，为一种下部单料烟，口味较平淡，适合用来作对比实验）中作为处理样，对照样即为空白卷烟；实验结果表明，处理样明显改善了卷烟香气，提高了烟气的丰富性，减轻了杂气和刺激性，烟气品质得到了提升。

实施例4

（1）反应：称10g废弃烟末与带塞的玻璃反应瓶中，加入100mL质量浓度为2%甘露聚糖酶、0.5%的无花果蛋白酶、0.5%的糖化酶、0.5%的α淀粉酶、2%的木聚糖酶、2%的果胶酶和0.5%脂肪酶、8%果胶酶（所述甘露聚糖酶活性≥1000000MNU/g，无花果蛋白酶活性≥500000MCU/g，糖化酶活性≥40000μ/g，淀粉酶活性≥40000μ/g，木聚糖酶活性≥1000000μ/g，脂肪酶活性≥1000000LUN/g，果胶酶活性≥124000μ/g，均由上海宝丰生化有限公司提供）的复合酶缓冲液水溶液（pH为5.9），在55℃温度下反应20h；

（2）萃取：反应后用无纺布过滤，水溶液用50mL乙醚萃取，萃取两遍，滤渣用60mL乙醚超声提取10min，乙醚相合并；

（3）浓缩：36℃，850mbar浓缩乙醚相，-80℃冷冻、除去蜡脂等不溶物，进一步浓缩至乙醚含量低于5%；

（4）烟用香料：加5mL乙醇复溶，50℃，102mbar旋转蒸发除去残留的乙醚，过0.45μm的膜获得烟用香料，用乙醇定容至2mL；

（5）评吸：取4uL馏分添加于卷烟（四川X21，为一种下部单料烟，口味较平淡，适合用来作对比实验）中作为处理样，对照样即为空白卷烟；实验结果表明，处理样明显改善了卷烟香气，提高了烟气的丰富性，减轻了杂气和刺激性，烟气品质得到了提升。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，包括如下步骤：

(1)反应：将复合酶缓冲液水溶液加入废弃烟末中，进行充分反应，反应的温度为20-55℃，反应时间为4-48h；废弃烟末与缓冲液的质量体积比以g：ml计为1：1-20；

(2)萃取：将步骤1所得反应产物过滤，所得水溶液用有机溶剂提取，有机溶剂选自乙醚、乙醇或甲基叔丁基醚中的一种或多种的组合；

(3)浓缩：将步骤2所得的有机相浓缩，有机相浓缩至有机相含量低于5％；

(4)烟用香料：将步骤3所得产物加乙醇复溶，并再次充分浓缩以除去残留的有机物，所得产物过0.45μm膜，即得所述烟用香料；

所述复合酶缓冲水溶液按质量浓度计，由如下组分组成：0.01-5％甘露聚糖酶、0.01-5％无花果蛋白酶、0.01-5％糖化酶、0.01-5％α淀粉酶、0.01-5％木聚糖酶、0.01-5％脂肪酶和1-10％果胶酶，pH为4.0-6.0；

所述甘露聚糖酶活性≥1000000MNU/g，无花果蛋白酶活性≥500000MCU/g，糖化酶活性≥40000μ/g，淀粉酶活性≥40000μ/g，木聚糖酶活性≥1000000μ/g，脂肪酶活性≥1000000LUN/g，果胶酶活性≥124000μ/g。

2.如权利要求1所述的一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，其特征在于，所述复合酶缓冲水溶液按质量浓度计，由如下组分组成：0.5-2％甘露聚糖酶、0.5-2％无花果蛋白酶、0.5-2％糖化酶、0.5-2％α淀粉酶、0.5-2％木聚糖酶、0.5-2％脂肪酶和3-8％果胶酶，pH为4.0-6.0。

3.如权利要求1所述的一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，其特征在于，所述步骤1中，反应的温度为45-55℃，反应时间为20-28h。

4.如权利要求1所述的一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，其特征在于，所述步骤1中，所述废弃烟末与缓冲液的质量体积比以g：ml计为1：10-20。

5.如权利要求1所述的一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，其特征在于，所述步骤2中，反应产物过滤后所得的滤渣还使用有机溶剂超声提取10-30min，滤渣超声提取所得的有机相与水溶液提取所获得的有机相合并。

6.如权利要求1所述的一种复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法，其特征在于，所述步骤3中，有机相浓缩至有机相含量低于5％的具体方法为：先将步骤2所得的有机相进行适当浓缩，冷冻除去不溶物后，再进一步浓缩至有机相含量低于5％。

7.如权利要求1-6任一权利要求所述的复合酶催化废弃烟末制备烟用香料的方法在烟草香料制备领域的用途。