CN103913531A - 一种能同时测定替米考星与磺胺含量的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，该方法能有效检测1 μg/mL-1.0mg/mL浓度范围的替米考星与磺胺二甲嘧啶钠，且结果准确、可靠，具有很强的实用性与推广价值。

Description

一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法

技术领域

本发明属于制剂分析方法，具体是发明了一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，该测定方法稳定、准确度高，能很好的指导兽药临床对药物有效成分含量的检测，能大幅度提高监测效率。

背景技术

随着各种抗生素药物的使用，畜禽面临着耐药性更强的细菌和病毒的威胁，在临床上复方制剂的开发、使用是解决细菌耐药性的一个重要方向。大环内酯类和磺胺类药物因有明显的增效作用，因此在临床上经常进行联合使用。

作为大环内酯类新型兽用药品，替米考星（tilmicosin）原料药于2005 年初，由农业部批准山东济兴医化有限公司济宁兽药厂生产；磺胺类药物是近十几年来广泛使用、高效的抑菌药，它通过干扰细菌叶酸代谢而抑制细菌的生长繁殖。

磺胺类药物与大环内酯类药物的联用虽然已经非常普遍，在进口兽药审批中，农业部1993年批准美国礼来公司的磷酸泰乐菌素－磺胺二甲嘧啶预混剂产品在中国销售，该产品在中国实现了连续3次、每次5年期的再注册；我国从2005年开始批准四川巴尔动物药业有限公司的磷酸泰乐菌素、磺胺二甲嘧啶预混剂，2008年公开的发明专利“畜禽饲料的抗菌促生长预混剂及其制备方法”（公开号CN101238857A，公开日2008年8月13日），公开了磷酸替米考星和磺胺二甲嘧啶的预混剂组方。但这些复方制剂中，磺胺二甲嘧啶钠含量的测定都使用了滴定法。滴定法测定含量时存在误差大、测定不准确等严重不足。并且上述两种成分的制剂在进行含量测定时，大环内酯类采用的是液相法，磺胺二甲嘧啶采用的是滴定法，这也制约工作效率、耗费人力、物力。因此本发明主要发明了一种同时测定含替米考星与磺胺二甲嘧啶钠含量的HPLC方法。对此方法我们进行了方法专属性、线性关系实验、精密度实验、重现性实验、耐用性以及加样回收测定实验，结果证明该方法能有效的对复方制剂中的替米考星、磺胺二甲嘧啶钠的含量进行测定，具有较强的实用性。该方法在临床使用中将发挥更大作用。

发明内容

本发明解决了替米考星和磺胺二甲嘧啶钠同时、准确测定的问题。

本发明的特色在于

一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，是通过改变梯度洗脱的流动相比例和提取液的配比，达到将制剂中的主要成分逐一分离并进行外标法含量测定。

本发明涉及的梯度洗脱程序为：

本发明涉及的流动相为：乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8mL，加磷酸溶液（1→10）70mL，边加边搅拌，放冷后，加水至100mL〕（975：25）用磷酸调节pH值至2.5±0.1为流动相B； 10%甲醇溶液为流动相C。

本发明所使用的提取液的配制方法为：取乙腈400-600ml和pH5.0-8.0的磷酸盐缓冲液25 mL加入适量水中，用水稀释至1000 mL。

本发明其所述的磺胺主要为磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶钠、磺胺氯吡嗪钠、磺胺氯哒嗪钠中的一种或多种。

本发明是这样来实现的：

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Diamonsil   C18，4.6mm×  250mm，5μm, 10 nm），柱温30±5℃；流速为1.1mL/min；检测波长为280nm；

取含替米考星、磺胺的组合物适量，精密称定，置棕色量瓶中，加提取液稀释至每1ml含替米考星0.5 mg，摇匀，滤过，作为供试品溶液；

替米考星对照品溶液的制备  精密称取替米考星对照品约25mg，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含0.5mg的溶液，作为替米考星对照品溶液。

磺胺对照品溶液的制备  精密称取磺胺对照品约25mg，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含0.5mg的溶液，作为磺胺对照品溶液。

精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算替米考星（C₄₆H₈₀N₂O₁₃）（以顺式和反式异构体峰面积之和）和磺胺的含量。

本发明的有益效果是：

本发明为方法学发明，此方法基于HPLC法建立，本发明不仅很好的解决了替米考星和磺胺的同时测定问题，而且还可以有效检测此两主要成分带入的杂质成分。

本发明耐用性的考察

本发明因为是梯度洗脱，在含量测定方法上直接确定选择250mm长的C₁₈色谱柱，耐用性重点考察了流速和柱温对测定方法的影响。

1流速对含量测定方法的影响

为了考察在流速变化情况下含量检测方法的影响，试验设定了0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mLl/min三个流速，其他条件同含量测定方法；待检样品为分别含替米考星  磺胺二甲嘧啶钠各5%的复方制剂。两者含量分别进行HPLC测定，比较分离度、理论塔板数、保留时间、含量，结果如下表17所示。

表1  流速对含量测定方法的影响

通过上表1数据看出，不同流速下理论塔板数、分离度都能满足检测的需要，只是流速大时，主成分出峰时间提前，计算替米考星不同流速下含量测定的RSD为0.13%，磺胺二甲嘧啶钠的RSD为0.36%，说明本方法对流速的耐用性良好。

2柱温对本发明的影响

为了考察柱温变化对本发明的影响，试验中通过柱温箱控制柱子温度，设定了25℃、30℃、35℃、40℃四个条件，分别采集相应温度下样品的色谱信号，待检样品为瑞普（天津）生物药业有限公司中试样品，分别含替米考星  磺胺二甲嘧啶钠各5%的复方制剂，比较不同温度下色谱图参数中分离度、理论塔板数、分离度、含量，结果如下表2所示。

表2 柱温对含量测定方法的影响

通过上表2数据可以看出，不同柱温下，复方替米考星可溶性粉主要成分的理论塔板数、分离度符合要求，计算不同柱温条件下替米考星含量的RSD为1.05%，磺胺二甲嘧啶钠的RSD为3.51%，可以看出柱温升高至40℃时，替米考星、磺胺二甲嘧啶钠的相对含量均有所降低，因此柱温要求控制在30±5℃范围内。

具体实施方式

以下实施例是用以说明本发明的优选的实施方案，本领技术人员应当理解，以下描述不应用于限制本发明的保护范围。

实施例一：一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法

待检样品：含替米考星  磺胺二甲嘧啶钠各5%的复方制剂。两者含量照本发明进行测定。

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Diamonsil   C18，4.6mm×  250mm，5μm, 10 nm），柱温30±5℃；以乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8mL，加磷酸溶液（1→10）70mL，边加边搅拌，放冷后，加水至100mL，即得〕（975：25）用磷酸调节pH值至2.5±0.1为流动相B； 10%甲醇溶液为流动相C；流速为1.1mL/min；检测波长为280nm，按以下程序进行梯度洗脱：

测定法  替米考星对照品溶液的制备  精密称取替米考星对照品约25mg，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含0.5mg的溶液，作为替米考星对照品溶液。

磺胺二甲嘧啶对照品溶液的制备  精密称取磺胺二甲嘧啶对照品约25mg，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含0.5mg的溶液，作为磺胺二甲嘧啶对照品溶液。

供试品溶液的制备  取本品0.5g，精密称定，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，加提取液稀释成每1 mL约含替米考星0.5 mg的溶液，滤过待测。

精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算替米考星（C₄₆H₈₀N₂O₁₃）（以顺式和反式异构体峰面积之和）和磺胺二甲嘧啶钠（C₁₂H₁₃N₄Na O₂S）的含量。

提取液：取乙腈500 mL和pH6.0的磷酸盐缓冲液（1.1 mol/L）25mL加入400 mL水中，用水稀释至1000 mL，即得。pH6.0的磷酸盐缓冲液（1.1 mol/L）：取磷酸二氢钾136.0 g与磷酸氢二钾23.0 g，加水使溶解成1000 mL，即得。

测得替米考星和磺胺二甲嘧啶钠的含量分别为4.98%和4.94%，进行含量测定时的对照品、样品HPLC图谱分别见附图1-附图3。

实施例二：一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法的检测限和定量限

将实施例一中供试品溶液用乙腈-磷酸盐缓冲液稀释，记录不同稀释度情况下主峰的信噪比，直至供试品中主峰的响应值约为噪音值的10倍，此时磺胺二甲嘧啶钠定量限为0.0833μg/mL，替米考星的定量限为2.5μg/mL。

将上述供试品溶液用乙腈-磷酸盐缓冲液稀释，记录不同稀释度情况下主峰的信噪比，至供试品中主峰的响应值约为噪音值的3倍，此时磺胺二甲嘧啶钠检测限为5ng/mL，替米考星的检测限为1μg/mL（检测限图谱见附图4所示）。

实施例三：一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法的线性关系实验

由于本检测方法中替米考星、磺胺的考察浓度为0.5mg/mL，因此本实施例选择了替米考星、磺胺二甲嘧啶钠，分别精密称分别称10mg、30mg、50mg、70mg和90mg的5份替米考星对照品、5份磺胺二甲嘧啶对照品，加提取液制成每1mL中均含0.1mg 、0.3mg 、0.5mg、0.7mg 、0.9mg的替米考星和磺胺二甲嘧啶的溶液，摇匀，分别精密量取20μL对照品溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标进行线性回归，得到的线性图谱分别见说明书附图5和附图6。

表3替米考星、磺胺二甲嘧啶浓度与峰面积

根据上述表格中的数值，分别获得了磺胺二甲嘧啶浓度和峰面积的回归方程y = 33798x+6265.0，相关系数R² = 0.9958，替米考星浓度和峰面积的回归方程y = 25266x＋236.60，相关系数R² = 0.9991。替米考星、磺胺二甲嘧啶浓度和峰面积之间呈正比关系，并且线性关系很好。线性范围0.1～0.9mg/mL之间具有良好的线性关系。

实施例四：一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法的重复性考察

用提取液将实施例一中的样品配制成浓度为0.5mg/mL的供试品溶液，按照拟定的含量测定条件进行精密度实验，将供试品溶液连续进样6次，计算含量以及RSD，结果见下表4所示。

表4 替米考星、磺胺二甲嘧啶钠含量测定方法精密度的考察

重复性实验结果表明，替米考星、磺胺二甲嘧啶钠测定相对标准偏差RSD分别为0.40%、0.33%，说明本方法精密度良好。

实施例五：一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法的中间精密度试验

分别精密称瑞普（天津）生物药业有限公司中试含替米考星  磺胺二甲嘧啶钠各5%的复方制剂。本发明的方法进行方法的中间精密度试验，由不同操作者，使用不同仪器、于不同时间，照含量测定项下方法操作，测定并计算含量，结果见表5。

表5  复方替米考星可溶性粉中间精密度试验

注：1、SM₂-Na标示磺胺二甲嘧啶钠；2、上述含量均为相对于标示量的百分含量。

根据上述测定结果进行计算替米考星平均含量为105.0%，不同测定者、不同时间测定替米考星的RSD为2.0%；SM₂-Na平均含量为102.9%，不同测定者、不同时间测定磺胺二甲嘧啶钠的RSD为1.2%。上述测定结果表明，本法的中间精密度较好。

附图说明：

附图1、使用本发明测得替米考星对照品的HPLC图谱

附图2、使用本发明测得磺胺二甲嘧啶对照品的HPLC图谱

附图3：测定含替米考星与磺胺二甲嘧啶钠含量时典型的HPLC图谱

附图4：替米考星检测限HPLC图谱

附图5：磺胺二甲嘧啶含量和峰面积关系图

附图6：替米考星含量和峰面积关系图

Claims (7)

1.一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其特征在于通过改变梯度洗脱的流动相比例和提取液的配比，达到将制剂中的主要成分逐一分离并进行外标法含量测定。

2.根据权利要求1 所述的一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其特征在于流动相的梯度洗脱程序。

3.根据权利要求2所述的一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其特征在于其特征的流动相梯度洗脱程序为：

4.根据权利要求3所述的一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其特征在于所述流动相为：乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8mL，加磷酸溶液（1→10）70mL，边加边搅拌，放冷后，加水至100mL〕（975：25）用磷酸调节pH值至2.5±0.1为流动相B；10%甲醇溶液为流动相C。

5.根据权利要求1所述的一种能同时测定替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其使用的提取液的配制方法为：取乙腈400-600ml和pH5.0-8.0的磷酸盐缓冲液25mL加入适量水中，用水稀释至1000 mL。

6.根据权利要求1所述的一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其所述的磺胺主要为磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶钠、磺胺氯吡嗪钠、磺胺氯哒嗪钠中的一种或多种。

7.根据权利要求1至6任一所述的一种能同时测定含替米考星与磺胺含量的HPLC方法，其特征在于具体实施步骤如下：

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Diamonsil   C18，4.6mm×  250mm，5μm, 10 nm），柱温30±5℃；流速为1.1mL/min；检测波长为280nm；

取含替米考星、磺胺的组合物适量，精密称定，置棕色量瓶中，加提取液稀释至每1ml含替米考星0.5 mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液；

替米考星对照品溶液的制备  精密称取替米考星对照品约25mg，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含0.5mg的溶液，作为替米考星对照品溶液；

磺胺对照品溶液的制备  精密称取磺胺对照品约25mg，置50mL棕色量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含0.5mg的溶液，作为磺胺对照品溶液；

精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算替米考星（C₄₆H₈₀N₂O₁₃）（以顺式和反式异构体峰面积之和）和磺胺的含量。