CN103910809A - 山药多糖的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山药多糖的分离纯化方法，包括前处理、热水水浴浸提、Sevage法除蛋白、采用高速逆流色谱法进行粗分多糖和SephadexG-100层析柱进一步纯化等步骤。本发明确定了山药多糖的提取工艺流程和工艺参数，确定了高速逆流色谱及SephadexG-100纯化山药多糖的色谱条件，并鉴定了所提山药多糖的结构，测定了山药多糖的抗氧化和抑菌活性。

Description

山药多糖的分离纯化方法

技术领域

本发明属于食品领域，特别涉及提取、纯化山药多糖的方法。 

背景技术

在过去几年，多糖的研究是食品、化学、生物领域研究的热点，随着人们对多糖功能的不断了解，尤其是对多糖的分离、纯化，活性分析以及结构鉴定有了长足的进步，也对多糖的生物学性能有了新的认识。但是，多糖的研究仍任重道远。可以展望，多糖的研究仍将成为生物学、药物学、食品科学不可或缺的部分。 

山药为薯蓣科薯蓣属植物薯蓣的干燥的根茎，是我国传统的药食同源的作物之一。主要产于河南，湖南、湖北、江西等省区亦有生产。根茎略呈圆柱形，长15-30cm，直径1.5-6cm，表面黄白色或淡黄色，有纵皱纹及须根痕。质坚实，断面白色，粉质。味微酸，带粘性。本品性平，味甘。山药是一年生或多年生缠绕性藤本植物，能形成肥大的地下肉质块茎供食用或药用，营养价值很高。以焦作一带出产的山药品质最好、药效最高，又称为怀山药。是良好的滋补强壮剂，对肾脾病、糖尿病、慢性肠炎等有辅助的疗效，在我国也是重要的出口的特产蔬菜之一。李时珍在《本草纲目》中将其功用概括为：“益肾气，健脾胃，止泄痢，化痰生，润皮毛。”用于治疗脾虚食少、久泻不止、慢性肠炎、肺虚喘咳、肾虚遗精、慢性肾炎、糖尿病、遗尿、白带等病症。山药主要含有蛋白质、糖类、维生素、脂肪、胆碱和淀粉酶等成分，并含有碘、钙、铁和磷等人体不可缺少的微量元素，具有很高的营养价值及药用价值，是养生健身的佳品，深得世人喜爱。 

如今，山药多糖具有的广泛生物活性已逐渐被人们认知，其独特活性和来源的天然性在保障人体健康的应用中具有很大的潜力。此外，我国山药资源丰富，应用历史悠久，因此，具有巨大的开发前景。但是，我国山药的开发主要以粗加工为主，例如山药干、山药精粉等。或是作食疗药膳，被制成糕点、粥等食品。山药精制产品很少，若能将山药多糖高效地提取出来并制成相应的保健胶囊，这将大大地提高山药相关产品的附加值。 

目前，对山药多糖的研究主要集中在提取、分离方法的研究和简单的单糖组成分析，而对其进一步的结构分析研究不够深入。因此，进一步优化山药多糖提取条件，提高多糖产品纯度，剖析山药多糖的结构并应用于山药多糖相关产品的研发，将有效促进山药多糖产品的现代化进程。建立操作简单，可行的提取纯化工艺，降低山药多糖提取和生产成本，对山药相关食品企业、医药领域都具有重要的现实以及经济意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供山药多糖的提取和纯化工艺，并鉴定了其结构，研究了其抗氧化及抗菌活性。本发明对于应用于山药多糖相关产品的研发，有效促进山药多糖产品的现代化进程具有重要意义。 

本发明采用如下技术方案： 

山药多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）前处理：将新鲜山药洗净，切片，50℃下烘箱中干燥，干燥后的山药片用粉碎机粉碎成山药粉； 

（2）热水水浴浸提：在步骤（1）所得山药粉中加入水，使料水比为1:8.59g/ml，在pH值为8.9、提取温度76.79℃条件下，提取1.38h得提取液，提取液离心后取上清液； 

（3）Sevage法除蛋白：采用6次Sevage法去除步骤（2）所得上清液中的蛋白质； 

（4）采用高速逆流色谱法进行粗分多糖：以12.5%PEG1000，8%KH₂PO₄、8%K₂HPO₄、71.5%H₂O作为高速逆流色谱分离山药多糖的溶剂系统；色谱条件为：转速700r/min，流速2.5mL/min； 

（5）SephadexG-100层析柱进一步纯化：层析柱大小为1.0×100cm，色谱条件为：以水作为流动相，上样浓度3mg/mL，洗脱流速为0.2mL/min，收集洗脱液，得山药多糖产品。 

进一步地，步骤（1）中山药切片后加入护色剂护色30min，所述护色剂为含有1.5%柠檬酸、0.75%亚硫酸钠和1.5%氯化钠的水溶液。 

步骤（2）中提取液8000r/min离心15min。 

本发明多糖的具体分离方法如下：取自浙江的山药，利用多糖为生物大分子，较难溶于冷水，可溶于热水且不溶于一般的有机溶剂的特点，在pH8.9，提取时间1.38h、提取温度76.79℃、料水比1:8.59g/ml的条件下，获取到最高山药得率，且经过响应面优化提取条件后得到的理论得率为5.88%。 

本发明多糖的纯化方法如下：采用Sevage法除蛋白，除蛋白次数为6次为宜。通过实验摸索，最终选取12.5%PEG1000，8%KH₂PO₄、8%K₂HPO₄、71.5%H₂O作为高速逆流色谱分离山药多糖的溶剂系统，经计算分配系数为1.95。实验条件为：转速700r/min，流速2.5mL/min，固定相保留率为59%。SephadexG-100层析柱进一步纯化，层析柱大小：1.0×100cm，色谱条件为：以水作为流动相，上样浓度3mg/mL，洗脱流速为0.2mL/min，3mL/管收集，得山药多糖产品。 

鉴定纯度采用高效凝胶渗透色谱法，色谱条件为：以TSK-gel G4000PWxL为分析色谱柱，蒸发光散射检测器。超纯水为流动相，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。本发明 提取的山药多糖的分子量为16619Da。 

本发明采用气相-质谱联用技术鉴定多糖中单糖的种类及摩尔比，单糖残基类型、键的连接方式，气质-质谱条件为：GC-MS配备DB-SMS石英毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm。程序升温：柱初温80℃，保持1min，以5℃/min升至185℃，保持1min，再以2℃/min升至202℃，保持1min，最后以10℃/min升至270℃，保持1min，以氦气作载气，进样口温度250℃，分流比1:10，柱流速为10mL/min。El(70eV)，灯丝电流250μA，离子源温度230℃，质量数扫描范围42-462amu，扫描速率2.5scan/s。运用化学分析方法（乙酰化反应、甲基化反应）以及波谱学方法（红外光谱、气相色谱-质谱联用、核磁共振）对山药多糖的结构进行了研究，并针对实验结果对所提取的山药多糖进行了结构表征。通过傅立叶红外变换分析，确定了山药多糖作为多糖物质所具备的特征吸收峰，糖醛酸。气相色谱-质谱联用分析表明多糖主要由葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为1.52:1，结合甲基化结果及¹H-NMR和 ¹³C-NMR图谱推测此次提取的山药多糖中可能存在β-1,3-Glc、α-1-Gal、α-1,6-Gal。 

本发明还探讨山药多糖清除DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基的能力。此外，采用牛津杯法对多糖的抑菌活性进行了探讨，主要取用了金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、尼氏芽孢杆菌为供试菌种，并采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度。实验结果表明，山药多糖基本无清除DPPH自由基的能力。但是山药多糖具有清除羟基自由基的能力和清除超氧阴离子自由基的能力，虽在同等浓度下清除·OH和·O₂ ^-能力不及Vc。此外，抗菌活性方面的结果表明，山药多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌无抑菌活性，对大肠杆菌有抑菌能力，但抑菌能力并不强，经测定，最小抑菌浓度为2.5mg/mL。本发明对于解决山药多糖的应用这一问题具有重要意义。 

附图说明

图1A、图1B、图1C、图1D分别是影响山药多糖得率的四个因素（Ph值、提取时间、提取温度、料液比）结果图。 

图2A是本发明Sevage法蛋白质含量与多糖损失率的关系。 

图2B是本发明HSCCC分离山药多糖样品结果图谱。 

图2C是本发明凝胶柱层析分离山药多糖样品结果图谱。 

图2D是本发明高效凝胶渗透色谱图谱。 

图3A是本发明傅立叶红外变换分析图谱示意图。 

图3B是混合单糖标准品的总离子流图。 

图3C是纯山药多糖水解后的单糖气质示意图。 

图3D是本发明多糖的部分甲基化质谱示意图。 

图3E是本发明多糖的¹H-NMR谱图。 

图3F是本发明多糖的¹³C-NMR谱图。 

图4A是本发明多糖清除羟基自由基的能力与Vc的比较示意图。 

图4B是本发明多糖清除超氧阴离子自由基的能力与Vc的比较示意图。 

具体实施方式

实施例1.山药多糖的提取及四个影响因素 

将新鲜山药洗净，切片（尽可能的薄），加入护色剂（1.5%柠檬酸、0.75%亚硫酸钠、1.5%氯化钠）护色30min，50℃下烘箱中干燥（防褐变），隔两小时翻片，以防干燥过程中受热不均。干燥后的山药片用粉碎机粉碎，称取10g粉碎后的山药粉放入锥形瓶中，水浴提取得提取液。提取液取出后8000r/min离心15min，取上清液，量体积。将上清液稀释300倍之后，取1mL分别加入试管中，另加入5%苯酚1mL，浓硫酸5mL，震荡混匀，45℃水浴30min，在490nm波长处测量吸光值，以相同体积的水作对照，计算总糖含量。另取1mL的上清液，稀释50倍后，取1mL分别加入试管中，然后加入4mL DNS溶液，在100℃下水浴15min，冷却后，在550nm波长处测量吸光值，以相同体积的水作为对照，计算得出多糖含量及得率。 

分别选取pH值为6、7、8、9、10五个点，研究不同的pH值对山药多糖得率的影响。研究1.25、1.5、1.75、2、2.25h五个提取时间对山药多糖提取率的影响。分别选取50、60、70、80、90、100℃六个点的温度，探讨不同温度对山药多糖提取率的影响。分别选取料水比1:5、1:6、1:7、1:8、1:9（g/mL），研究料水比对山药多糖提取率的影响。 

图1A、图1B、图1C、图1D分别是影响山药多糖得率的四个因素（Ph值、提取时间、提取温度、料液比）结果图。 

结果表明：pH值、提取时间、提取温度、料水比四个因素在不同程度上影响山药多糖的得率。在选取的实验条件范围内，多糖得率均呈现出先增长后下降的趋势，多糖得率分别在pH：9，温度：80℃，提取时间：1.5h，料水比1:8时达到最大值，这为响应面进一步优化分析提供了实验基础。 

实施例2.响应面优化提取条件分析 

在单因素分析的基础上，根据Design Expert7.1.6软件对提取条件进行优化。试验因素和水平设计见表1。 

表1Box-Behnken实验因素与水平 

以A、B、C、D为自变量，多糖得率为响应值，共进行29组实验，实验方案如表2 

表2 Box-Behnken 实验设计及结果 

通过Design Expert 7.1.6软件对表2的实验数据进行二次多项回归拟合，获得的二次多项式回归方程为： 

R1=+5.56-0.31*A-0.44*B-0.97*C+0.32*D-0.19*A*B-0.25*A*C-0.23*A*D-0.090*B*C-0.14*B*D-0.44*C*D-1.55*A²-1.01*B²-1.84*C²-0.44*D²

其中，A、B、C、D分别是pH、提取时间、提取温度、料水比的编码值。 

回归方程的方差分析结果表3： 

表3回归方程的方差分析 

由表3可知，方程的F值为14.95，Model的Prob＞F值小于0.0001，说明模型是显著（significant）的，即这种试验方法是可靠的。失拟项(Lack of Fit)检验为不显著(not significant)，该项F值为3.01，表明失拟项不显著于净误差，说明该方程对实验拟合较好，从而表明该模型对山药多糖的提取可以进行预测及分析。最终得到优化后的条件为：pH8.9，提取时间1.38h、提取温度76.79℃、料水比1:8.59g/mL、理论得率：5.88%。考虑到实际操作，采用此条件得到的多糖得率为5.82%，与理论预测值的相对误差为1.02%。 

实施例3.山药多糖的纯化 

对山药多糖进行进一步的优化，以提高其纯度。本发明纯化多糖的首要任务是去除蛋白质，实验采用Sevage法，该法较温和，但并不能一次就达到目的，本实施例探讨了除蛋白次数对多糖的损失率的影响，并确定了除蛋白的最佳次数。粗多糖的纯化试探性地采用高速逆流色谱法进行粗分多糖，摸索出了相关色谱条件。随后通过透析除去残余的小分子化合物。经过Sephadex G-100层析柱纯化，获取多糖纯品，最后进行多糖纯度的鉴定及分子量的测定。 

结果如下：图2A显示了Sevage法蛋白质含量与多糖损失率的关系，由图可知，随着除蛋白次数的增加，多糖损失率增加，蛋白含量逐渐减少，除蛋白次数在6-7次时，蛋白含量基本维持不变，但多糖损失率仍在增加。最终选择除蛋白次数为6次为宜，此时蛋白含量为5.91%。图2B为HSCCC分离山药多糖样品结果图谱，经过高速逆流色谱分离得到山药多糖的两个组分。但第二个组分管数少，含量低，收集后经透析损失大，难收集。因此，第二个组分不做考虑。收集45-65管，合并，减压浓缩，透析，真空冷冻干燥得到白色絮状固体。图2C为凝胶柱层析分离山药多糖样品结果图谱，经过SephadexG-100纯化的山药多糖表现为单一峰，峰形对称性较好，表明分离得到的多糖较纯。出峰时间较慢，说明该组分的分子量较小。收集10-25管，真空冷冻干燥。而后，高效凝胶渗透色谱法鉴定纯度并测定分子量大小。如图2D所示，提取纯化的山药多糖为单一组分，峰形好，纯度高，保留时间为11.723min。根据葡聚糖各标准品保留时间与分子量的关系得到其线性回归方程：Log(Mw)=-0.5365Rt+10.51，代入多糖的出峰时间，可得分离纯化后的山药多糖的分子量约16619Da。 

实施例4.傅里叶变换红外分析、GC-MS分析、NMR分析 

依次应用傅里叶红外光谱确定常规官能团，采用气相-质谱联用技术鉴定多糖中单糖的种类及摩尔比，单糖残基类型、键的连接方式，采用核磁共振了解多糖糖环构型，糖残基和取代基等结构信息。通过这些化学及波谱学的研究方法，初步推出了所提多糖的化学结构。通过运用化学分析方法（乙酰化反应、甲基化反应）以及波谱学方法（红外光谱、气相色谱-质谱联用、核磁共振）对山药多糖的结构进行了研究，从而对所提取的山药多糖进行了结构表征。 

结果表明：通过傅立叶红外变换分析，确定了山药多糖作为多糖物质所具备的特征吸收峰，糖醛酸。气相色谱-质谱联用分析表明多糖主要由葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为1.52:1，结合甲基化结果及¹H-NMR和¹³C-NMR图谱推测此次提取的山药多糖中可能存在β-1,3-Glc、α-1-Gal、α-1,6-Gal。本发明傅里叶变换红外分析、GC-MS分析、NMR分析结果示意图如图3A-F所示。 

由图3A傅立叶红外变换分析图谱可知，山药多糖具有典型的多糖吸收峰。3426.93cm^-1处的强烈吸收峰，表明样品中存在着分子间和分子内的氢键，是-OH的伸缩振动峰。2927.71 cm^-1处有吸收峰表示有糖类的C-H伸缩振动特征吸收峰。1730.78cm^-1表示糖醛酸对应的吸收峰，这与糖醛酸含量测定的结果相符。糖的α-与β-的端基差向异构体，是由端基的C-H变角振动造成，β-型的C-H取直立键，在891±7cm^-1处有吸收峰，图中890.91cm^-1处的吸收峰表明样品中可能存在β-型糖苷键，根据Whistler和House(1953)研究的35种单糖及其衍生物的端基差向异构体的红外光谱得知，β-D-葡萄吡喃糖与β-D-半乳吡喃糖分别在905-876cm^-1与914-886cm^-1波长处有吸收峰，因此890.91cm^-1处的吸收峰是β-D-葡萄吡喃糖还是β-D-半乳吡喃糖还需其他鉴定方式进行判定。1395-1440cm^-1是C-O伸缩振动峰。1023.11cm^-1、1411.35cm^-1以及1616.69cm^-1处的吸收峰可能分别是由羟基中O-H变角振动、羧基中C-O伸缩振动以及-COO基团中C=O非对称伸缩振动引起。 

结合图3B、图3C、图3D及结合甲基化裂解规律，通过对质谱图的分析及质谱图谱库的比对，将可能结构列于表4 

表4山药多糖甲基结果分析 

由表4甲基化产物分析的结果表明，其摩尔比与单糖组成分析中的摩尔比大体上一致。Gal存有两种键型，一种以端基的形式存在，一种为1,6取代，葡萄糖则以1,3取代形式存在。 

图3E和3F为¹H-NMR谱图及¹³C-NMR谱图。一般而言，¹H-NMR中端基质子信号在δ4.3-6.0，为异头氢的共振峰区域，α-型H-1质子化学位移大于4.9ppm，β-型H-1质子化学位移小于4.9ppm，借此可以判断糖环的构型。由¹H-NMR谱图3E，δ4.55ppm、δ4.99ppm、δ5.30ppm表明此样品中含有两种α-构型、一种β-构型。在¹³C-NMR的异头碳区域，由图3F¹³C-NMR谱图可知，δ105.61ppm、δ100.86ppm、δ100.21ppm可以判断这三种糖为两种α-构型、一种β-构型，这在1H-NMR图中得到印证。文献报道，α-D-葡聚糖的异头碳化学位移小于102ppm，β-D-葡聚糖的异头碳化学位移大于102ppm，故推测1,3链接的葡萄糖残基为β-构型，由此推出两种不同半乳糖残基为α-构型，结合甲基化结果，推测出此次提取的山药多糖中主要以β-1,3-Glc、α-1-Gal、α-1,6-Gal存在。 

实施例5.纯山药多糖抗氧化、抗菌研究 

在最优提取条件下，提取的山药多糖，对其抗氧化及抗菌活性进行研究，配制纯品多糖 溶液加入1,1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液（无水乙醇配置），用无水乙醇为空白，在517nm测定其吸光度A，以Vc作为阳性对照测定清除DPPH自由基能力。其次，利用H₂O₂与Fe²⁺产生·OH，在体系内加入水杨酸产生有色物质从而可以捕捉·OH，该物质在510nm处有最大吸收。测定清除羟基自由基能力。第三，清除超氧阴离子自由基能力的测定：不同浓度的山药多糖溶液，再加入6.0mL50mmol/L pH8.2的Tris-Hcl缓冲液，补足至9mL，37℃水浴10min。加入1.0mL3.5mmol/L37℃预热过的邻苯三酚溶液，精确反应6min，立即用0.5mL8.0mol/L的浓盐酸终止反应，于320nm波长处测定吸光度，Vc作为阳性对照。 

抗菌研究：菌种的活化：以大肠杆菌为例，阐述菌种活化过程：取用甘油保存的大肠杆菌，接种环接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，200r/min条件下培养过夜。用接种环蘸取已培养完毕的大肠杆菌，在固体牛肉膏蛋白胨上平板上划线，37℃培养一至两天。挑取典型的单个菌落，将大肠杆菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃，200r/min培养过夜，然后用血球计数板确定菌的浓度，用无菌生理盐水稀释，最终制成一系列菌液浓度约为10⁸CFU/mL备用。无菌环境下，取灭菌培养皿，依次编号，用移液枪以1%的接种量接种四种菌于溶化后的培养基中，迅速摇匀后，倒平板。待培养基凝固后，用灭菌的镊子在每个培养皿上等距离放置牛津杯，并在每只牛津杯中加入不同浓度（5、10、15、20、25mg/mL）的多糖溶液0.2mL，无菌水作为空白对照，放置于37℃恒温培养箱中培养过夜，有抑菌圈的测定抑菌圈直径，实验做3个平行对照，取平均值。在上述结果的基础上，采用二倍稀释法，将山药多糖稀释成浓度梯度，测定山药多糖对该菌的最小抑菌浓度，以未见抑菌圈的最低浓度为最低抑菌浓度，实验做3个平行对照。 

结果表明：1、纯山药多糖实验的糖浓度下测得抗DPPH自由基能力均与空白无异，受限于山药多糖溶解度小，未能继续摸索。2、采用水杨酸法测定多糖对羟基自由基的清除作用，由图4A可知，在实验的浓度范围内，山药多糖具有清除羟基自由基的能力，且随着多糖浓度的增加，清除能力逐渐增强，但同浓度下该清除能力不及Vc。3、由图4B可知在实验浓度范围内，山药多糖与Vc对超氧阴离子自由基均有一定的清除能力，且清除率随着浓度的增加而增加，浓度在1.0mg/mL时山药多糖的清除率仅43%。4、如表5所示，山药多糖对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、尼氏芽孢杆菌均无抑菌作用，对大肠杆菌有抑菌作用，但并不明显，随着多糖浓度的增加，抑菌圈的直径也在增加，抑菌效果有所增加，但是浓度的增大并没有带来抑菌效果显著的增强。在25mg/mL时抑菌圈直径反而在减小，推测可能是由于多糖的溶解性不大，25mg/mL时多糖粘稠不易向外渗透，降低了多糖对大肠杆菌的抑制能力。以二倍稀释法测定最小抑菌浓度，得知山药多糖对大肠杆菌的抑菌浓度为2.5mg/mL。抗氧化、抗菌活性的研究结果具有很好的商业化应用价值。 

表5山药多糖对实验菌的抑制效果 

注：“─”指无抑菌圈 

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。 

Claims (3)

1.山药多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）前处理：将新鲜山药洗净，切片，50℃下烘箱中干燥，干燥后的山药片用粉碎机粉碎成山药粉；

（2）热水水浴浸提：在步骤（1）所得山药粉中加入水，使料水比为1: 8.59 g/ml，

在pH值为 8.9、提取温度76.79℃条件下，提取1.38 h得提取液，提取液离心后取上清液；

（3）Sevage法除蛋白：采用6次Sevage法去除步骤（2）所得上清液中的蛋白质；

（4）采用高速逆流色谱法进行粗分多糖：以12.5% PEG1000，8% KH₂PO₄、8% K₂HPO₄、71.5% H₂O作为高速逆流色谱分离山药多糖的溶剂系统；色谱条件为：转速700 r/min，流速2.5 mL/min；

（5）SephadexG-100层析柱进一步纯化：层析柱大小为1.0×100 cm，色谱条件为：以水作为流动相，上样浓度3 mg/mL，洗脱流速为0.2 mL/min，收集洗脱液，得山药多糖产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中山药切片后加入护色剂护色30 min，所述护色剂为含有1.5%柠檬酸、0.75%亚硫酸钠和1.5%氯化钠的水溶液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中提取液8000 r/min离心15 min。