CN103908503B - 黑莓籽有效成分的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物提取物应用技术领域，具体涉及一种黑莓籽有效成分的新应用。应用涉及在制备保肝、护肝保健品或药物上的应用及在抗氧化方面的应用。本发明从黑莓籽中提取到了石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、黑莓籽油，研究证实了其对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤具有一定保护作用，同时增强急性肝损伤小鼠机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害。

Description

黑莓籽有效成分的应用

技术领域

本发明属于植物提取物应用技术领域，具体涉及一种黑莓籽有效成分的新应用。

背景技术

黑莓(Rubusspp.Blackberry)属于蔷薇科(Rasaceae)悬钩子属聚合果类植物，其果实具有很高的营养价值和药用价值，具有改善人体新陈代谢、清除自由基、延缓衰老、增强免疫力等功能，特别具有降低胆固醇含量、防治心脏疾病、抗癌(降低化疗引起的毒副作用)和抗血栓的功效。

黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工产品的副产物，含有丰富的多酚类化合物，多年来被大量遗弃，造成资源的大量浪费。近几年，技术人员从黑莓籽中提取了黑莓籽油。

研究表明，黑莓籽油含有较高的不饱和脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等，能够提供给人体基本的脂肪酸，而且这些脂肪酸不能通过任何已知的化学途径合成，必须从食物中获取。另外，籽油具有有效清除自由基、有效抑制H₂O₂诱导的小鼠红细胞氧化溶血和VC-FeSO₄体系诱导的小鼠肝组织丙二醛生成及VC-FeSO₄体系诱导的小鼠肝线粒体肿胀的作用，与其抗心血管脂氧化和抗癌活性息息相关；此外，还发现黑莓籽经脱脂后的主要有效成分为原花青素，是由单体黄烷-3-醇以不同聚合度连接而成的多酚类化合物，具有高效的清除自由基的能力，具有治疗动脉硬化、消炎防肿、抗突变和预防癌症等广泛用途。未见对黑莓籽治疗急性肝损伤作用的报道。

发明内容

本发明为了扩大黑莓籽的应用领域，通过腹腔注射CCl₄油溶液诱导小鼠急性肝损伤，测定血清中GPT和GOT的活力，评价其保肝护肝作用，测定肝脏匀浆液中SOD的活力和MDA的水平，评价其体内抗氧化作用，为合理开发和利用黑莓籽资源提供科学依据，提供了黑莓籽在保肝护肝、抗氧化方面的新应用。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

黑莓籽有效成分在制备保肝、护肝保健品或药物上的应用，所述黑莓籽有效成分为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和/或黑莓籽油。

黑莓籽有效成分在抗氧化方面的应用，所述黑莓籽有效成分为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和/或黑莓籽油。

黑莓籽有效成分（石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、黑莓籽油）采用以下方法制得，黑莓籽用石油醚冷浸脱脂，脱脂后的提取液回收石油醚得到黑莓籽油；脱脂后的黑莓籽残渣用乙醇（65-80V%）冷浸，乙醇提取液浓缩得乙醇总浸膏，乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，即分别为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

为了提高黑莓籽有效成分的提取效果，可以在石油醚冷浸前将黑莓籽粉碎。

石油醚冷浸脱脂时，重复4-5次，每次3-4d，合并提取液；每次石油醚的用量是黑莓籽质量的8-10倍，冷浸温度为室温。

乙醇冷浸时，重复2-3次，每次3-4d，合并乙醇提取液；每次乙醇的用量是黑莓籽残渣质量的8-10倍，冷浸温度为室温。

本发明从黑莓籽中提取到了石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、黑莓籽油，并采用腹腔注射四氯化碳诱导急性肝损伤小鼠模型，首次研究黑莓籽对四氯化碳诱导急性肝损伤小鼠的影响，研究证实了这些有效部位均具有不同程度的降低血清中GPT和GOT的活力，其对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤具有一定保护作用；能通过不同程度地降低急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中MDA的含量，升高SOD水平，增强急性肝损伤小鼠机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害，推测其可能是黑莓籽保肝护肝的作用机制之一。

具体实施方式

实施例1

黑莓籽有效成分的提取方法，步骤如下：500g黑莓籽粉碎，每次使用4000mL石油醚冷浸脱脂，重复4次，每次4d，过滤，合并提取液，提取液回收石油醚得到黑莓籽油145.04g；

脱脂后的黑莓籽残渣341g用2800mL乙醇（70V%）冷浸，重复3次，每次3d，合并乙醇提取液，乙醇提取液浓缩得乙醇总浸膏，乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到的石油醚萃取物2.34g、乙酸乙酯萃取物5.46g和正丁醇萃取物13.42g，即分别为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

实施例2

黑莓籽有效成分的提取方法，步骤如下：500g黑莓籽粉碎，每次使用5000mL石油醚冷浸脱脂，重复5次，每次3d，过滤，合并提取液，提取液回收石油醚得到黑莓籽油162.50g；

脱脂后的黑莓籽残渣332g用3000mL乙醇（65V%）冷浸，重复2次，每次4d，合并乙醇提取液，乙醇提取液浓缩得乙醇总浸膏，乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到的石油醚萃取物2.02g、乙酸乙酯萃取物5.10g和正丁醇萃取物14.28g，即分别为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

实施例3

黑莓籽有效成分的提取方法，步骤如下：500g黑莓籽粉碎，每次使用4500mL石油醚冷浸脱脂，重复4次，每次4d，合并提取液，提取液回收石油醚得到黑莓籽油162.26g；

脱脂后的黑莓籽残渣335g用3300mL乙醇（80V%）冷浸，重复3次，每次4d，合并乙醇提取液，乙醇提取液浓缩得乙醇总浸膏，乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到的石油醚萃取物2.26g、乙酸乙酯萃取物5.54g和正丁醇萃取物12.94g，即分别为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

效果实验黑莓籽不同部位对四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠的影响

实验原料：将实施例1-3制得的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、黑莓籽油分别混合作为四种实验原料。

实验动物：昆明种小鼠，体重22±2g，SPF级，由山东鲁抗医药股份有限公司质检中心动物实验室提供，生产许可证号：SCXD鲁20080002。

实验试剂：谷草转氨酶（GOT）试剂盒（20140115）、谷丙转氨酶（GPT）试剂盒（20140217）、丙二醛（MDA）试剂盒（20131214）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（20131214）均购于南京建成生物工程研究所；联苯双酯(120314，浙江万邦药业股份有限公司)；四氯化碳（分析纯，开封化学试剂总厂）；橄榄油（上海卫辉化学试剂厂）；考马斯亮蓝G250（20050115，上海化学试剂公司分装厂）；牛清蛋白（20100526，北京奥博星生物技术有限责任公司）；其它试剂均为分析纯。

实验仪器：LRH-150恒温培养箱；DELTA320型pH计；MultiskanMK3酶标仪；电子天平；旋转蒸发仪；UV-2000型紫外可见分光光度计；CS-H1型混合器；各规格的微量移液器及枪头等。

实验方法与结果

1、实验方法

动物分组和造模方法：取健康昆明小鼠（4～6周龄，体重22±2g）150只，随机分为15组，每组10只，分别为黑莓籽石油醚部位高、中、低剂量组（800、400、200mg/kg），黑莓籽乙酸乙酯部位高、中、低剂量组（400、200、100mg/kg），黑莓籽正丁醇部位高、中、低剂量组（600、300、150mg/kg），黑莓籽油高、中、低剂量组（1000、500、250mg/kg），联苯双酯阳性对照组（75mg/kg），模型组和空白组。模型组和空白组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水溶液，其它试验组用0.5%CMC-Na水溶液分别配制成相应浓度的溶液，灌胃给药，1次/天，连续给药8天。于末次给药2h后对小鼠进行造模（即按照0.1mL/10g小鼠体重腹腔注射0.4V%四氯化碳橄榄油溶液，空白组除外）。禁食不禁水16h后，摘除小鼠眼球取血并分离出血清，检测血清中GPT和GOT的活力。快速分离肝脏，制备10%和1%的肝脏组织匀浆液，离心取上清液，0-3℃保存，测定MDA的含量和SOD的活力，利用考马斯亮蓝除蛋白。

2、实验结果如下

表1黑莓籽不同部位对急性肝损伤小鼠血清中GPT和GOT活力的影响(`x±s，n=10)

注：联苯双酯为阳性对照；

与空白组比较：^△△△P<0.001，^△△P<0.01，^△P<0.05；

与模型组比较：^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05。

表2黑莓籽不同部位对急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中MDA含量和SOD活力的影响(`x±s，n=10)

注：联苯双酯为阳性对照；

与空白组比较：^△△△P<0.001，^△△P<0.01，^△P<0.05；

与模型组比较：^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05。

由表1可见，与空白组比较，模型组小鼠血清中GPT和GOT活力显著升高（P<0.001，P<0.01），说明四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组相比，石油醚部位高中低剂量组、乙酸乙酯部位中低剂量组和正丁醇部位高中低剂量组均能不同程度地降低四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠血清中GPT和GOT的活力，且具有显著性差异；乙酸乙酯部位高剂量组能显著性地降低GPT的活力，降低GOT活力不具有显著性，但其活力均低于模型组；黑莓籽油高中低剂量组能显著性地降低GOT的活力，降低GPT活力不具有显著性，但其活力均低于模型组。由该结果可以看出，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和黑莓籽油均能不同程度地降低血清中GPT和GOT的活力，对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤具有一定保护作用。

(2)从表2可以看出，与空白组相比，模型组小鼠肝脏匀浆液中MDA含量显著性的升高（P<0.001），SOD活力显著性的降低，可见，四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤会引起一定的脂质过氧化。与模型组相比，石油醚部位高低剂量组、乙酸乙酯部位高剂量组、正丁醇部位中低剂量组以及黑莓籽油高中低剂量均能不同程度地降低小鼠肝脏匀浆液中MDA含量，升高SOD活力，且具有一定的显著性，乙酸乙酯部位中剂量组能显著性的降低MDA含量，升高SOD活力不具有显著性，但其活力低于模型组；正丁醇部位高剂量显著性地升高SOD活力，降低MDA含量不具有显著性，但其含量低于模型组；石油醚部位中剂量组降低MDA含量和升高SOD活力均不具有显著性，但其MDA含量低于模型组，SOD活力高于模型组。乙酸乙酯部位低剂量组降低MDA含量不具有显著性，但其MDA含量低于模型组。可见，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和黑莓籽油均能通过不同程度地降低急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中MDA的含量，升高SOD水平，增强急性肝损伤小鼠机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害。

Claims (2)

1.黑莓籽有效成分在制备保肝、护肝保健品或药物上的应用，所述黑莓籽有效成分为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和/或正丁醇部位；

石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位采用以下方法制得，黑莓籽用石油醚冷浸脱脂，脱脂后的黑莓籽残渣用65-80V%的乙醇冷浸，乙醇提取液浓缩得乙醇总浸膏，乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，即分别为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

2.黑莓籽有效成分在制备抗氧化药物上的应用，所述黑莓籽有效成分为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和/或正丁醇部位；

石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位采用以下方法制得，黑莓籽用石油醚冷浸脱脂，脱脂后的黑莓籽残渣用65-80V%的乙醇冷浸，乙醇提取液浓缩得乙醇总浸膏，乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，即分别为黑莓籽的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。