CN103908429B - 一种热敏脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种热敏脂质体，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述光敏剂为吲哚菁绿或二氢卟吩e6，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm。所述热敏脂质体通过活体荧光成像可以实时观察热敏脂质体在体内的分布过程，在近红外光照射条件下，能够快速有效地释放化疗药物，使化疗药物很好地在靶部位富集，得到的热敏脂质体颗粒粒径为100nm以下，粒径较小，热敏脂质体的生物相容性良好；本发明热敏脂质体的制备方法简单易操作。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种热敏脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
热敏脂质体是一种给药系统的新剂型。在正常体温下，药物很难透过脂质体膜而扩散出来，而当热敏脂质体随血液循环经过被加热的靶部位时，局部的高温可促使药物在靶部位释放并形成较高的药物浓度；目前，热敏脂质体中的光敏剂一般为单壁或多壁碳纳米管、石墨烯、纳米金等材料，但这些热敏脂质体存在以下问题：
（1）热敏脂质体在体内的分布状况以及在靶部位的富集状况不清楚，难以控制靶部位的加热时间，导致热敏脂质体的治疗效果不好；（2）由于碳纳米管等不溶于水和有机溶剂，且在溶液中易聚集成束，制备出的热敏脂质体的粒径一般为100～200nm，粒径较大，且粒径均一性不好，不利于药物通过增强渗透滞留效应（EPR效应）进行高效治疗；（3）碳纳米管、石墨烯以及纳米金等材料的生物相容性不好，对生物体有一定毒害作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种热敏脂质体及其制备方法和应用。所述热敏脂质体可以通过活体荧光成像实时观察热敏脂质体在体内的分布过程，在近红外光照射条件下，能够快速有效地释放化疗药物，使化疗药物很好地在靶部位富集，得到的热敏脂质体颗粒粒径为100nm以下，粒径较小，同时，热敏脂质体的生物相容性良好；本发明热敏脂质体的制备方法简单易操作。
第一方面，本发明提供了一种热敏脂质体，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述光敏剂为吲哚菁绿（ICG）或二氢卟吩e6，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm。
所述磷脂酰胆碱形成磷脂双分子层，所述光敏剂和化疗药物被所述磷脂双分子层包裹，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂双分子层中。
优选地，所述化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1：（1～4）：（25～35）：（1～5）。
优选地，所述化疗药物为盐酸阿霉素（DOX）、表阿霉素、紫杉醇、去甲长春花碱或顺铂。
更优选地，所述化疗药物为盐酸阿霉素且所述光敏剂为吲哚菁绿。
生物体对650～900nm范围的近红外光具有高度透过性，而吲哚菁绿和二氢卟吩e6在此范围内具有高吸收的特性，然后进行光热转换，使热敏脂质体温度升高，在达到磷脂酰胆碱的相变温度时，导致脂质体的流动性和通透性大大增加，释放化疗药物，大大提高了化疗药物在靶部位上的富集和对靶细胞的杀伤力。同时哚菁绿和二氢卟吩e6可实现活体荧光成像，能够对热敏脂质体在生物体内的分布进行实时监测，有助于了解热敏脂质体在体内靶部位的富集量和在其他器官的生物分布，提高热敏脂质体的治疗效果；所述光敏剂可以被磷脂酰胆碱形成的磷脂双分子层包裹，形成粒径较小且粒径均一的热敏脂质体；同时，吲哚菁绿（ICG）和二氢卟吩e6生物相容性较好。
优选地，所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)中的至少一种。所述磷脂酰胆碱为热敏材料，当环境温度低于热敏材料的相变温度时，磷脂酰胆碱形成的磷脂双分子层呈凝胶态，流动性和通透性均较小，当热敏材料受热达到相变温度时，磷脂分子运动加强，如：翻转、移动、摆动等，此时，相邻的磷脂分子之间距离增加，磷脂双分子层的厚度减小，这种结构的变化导致脂质体的流动性和通透性大大增加，短时间内释放被磷脂双分子层包裹的化疗药物，所述热敏脂质体对化疗药物的控制释放能力好。同时所述磷脂酰胆碱具有良好的生物相容性。
优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)中的至少一种。聚乙二醇作为一种亲水性极性分子，避免了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，本发明所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂双分子层，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的聚乙二醇形成亲水性外层，显著延长了脂质体在体内的循环时间，进而借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，有助于实现肿瘤的被动靶向，从而增强药物的生物利用率。同时，本发明具有聚乙二醇的亲水保护层，能够避免热敏脂质体的聚集，可以提高热敏脂质体在储存期内的稳定性；制备出的热敏脂质体颗粒均一、尺寸稳定性好。
现有技术中对热敏脂质体进入体内后的分布状态很难得知，导致对靶部位的加热时间难以确定，如果加热时间过长，容易对正常组织造成损伤，如果加热时间过短，导致治疗效果不好。
吲哚菁绿或二氢卟吩e6具有光学成像性质和强光热转换特性，当所述热敏脂质体应用于治疗时，可以在给予热敏脂质体之前和/或期间和/或之后，对靶部位进行红外光照射，根据热敏脂质体的荧光成像图像，可以实时监测热敏脂质体在生物体内的分布状态，有利于了解热敏脂质体在靶部位中的富集状态和作用机制，同时根据光学成像的信息，可以更加容易地选择最佳加热时间，使热敏脂质体达到更好的治疗效果；同时吲哚菁绿或二氢卟吩e6在近红外光照射下产热，导致热敏材料发生相变，使热敏脂质体在靶部位定位释放药物，从而达到靶向治疗的作用；本发明热敏脂质体物理化学稳定性良好，热敏脂质体的粒径较小且粒径均一，使热敏脂质体更易滞留在靶部位中，有利于药物有效地到达靶部位中释放药物并进行高效治疗；同时热敏脂质体的生物相容性良好，副作用小。
所述化疗药物为盐酸阿霉素且所述光敏剂为吲哚菁绿。所述吲哚菁绿在近红外光照射下，具有强的光热转换性质，同时具有良好的荧光成像作用，吲哚菁绿是唯一一种被美国食品药品监督管理局（FDA)批准的用于人类医学成像和诊断的试剂，生物相容性较好，将所述吲哚菁绿作为光敏剂应用在热敏脂质体中一方面可以实时监测热敏脂质体在体内的分布状况以及在靶部位的富集状况，另一方面可以起到定位释放化疗药物，起到治疗的作用，同时，吲哚菁绿荧光成像的作用有助于更好的确定近红外光照射时间等因素，进一步提高治疗效果；吲哚菁绿和盐酸阿霉素为水溶性，可以被磷脂双分子层亲水腔包裹，不易团聚，形成的热敏脂质体粒径较小且粒径均一，得到的热敏脂质体生物相容性良好。
第二方面，本发明提供了一种热敏脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂按质量比为25～35:1～5的比例溶解，旋转蒸发后，得到磷脂薄膜，再将所述磷脂薄膜溶解得到磷脂溶液；
（2）将光敏剂和化疗药物按质量比为1～4:1的比例溶解后滴加至所述磷脂溶液中并超声5～10min，然后超滤3～5次，得到所述热敏脂质体，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述光敏剂为吲哚菁绿或二氢卟吩e6，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm。
优选地，所述步骤（1）的磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂溶解于乙醇和水的混合溶液中。
优选地，所述步骤（2）的光敏剂和化疗药物溶解于超纯水、磷酸盐缓冲溶液、乙腈、氯仿或乙醇和水的混合溶液中。
磷脂酰胆碱分子包括亲水性头部和两个疏水性尾部，当磷脂处于水性环境时，亲水性头部聚集成线性构型，而它们的疏水性尾部平行地排列。由于疏水性尾部试图避开水性环境，第二列磷脂分子与第一列磷脂分子尾部对尾部进行排列，为了最大程度地避免与水性环境接触，同时使表面积与体积之比最小从而达到最小能量构型，两列磷脂聚集成球（形成磷脂双分子层），磷脂双分子层包裹光敏剂和化疗药物；所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂通过物理作用和所述磷脂层中的磷脂分子结合从而穿插于所述磷脂层，进行超声分散后，使热敏脂质体的粒径更小，最后通过超滤，得到热敏脂质体。
本发明根据化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂的性质，将这些物质溶解后，化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂通过自组装过程形成所述热敏脂质体，不需要进行化学反应，制备过程环保无毒，制备方法简单易操作，制备出的热敏脂质体（表示为DI-NPs）的粒径较小且粒径均一。
第三方面，以上所述的热敏脂质体在抗肿瘤药物中的应用。
当所述热敏脂质体应用于肿瘤药物时，可以给予热敏脂质体之前和/或期间和/或之后，进行红外光照射，可以实时监测热敏脂质体在体内的分布以及在肿瘤部位的富集数量，确定最佳红外光照射时间，使热敏脂质体温度升高，选择在肿瘤部位释放化疗药物，从而使化疗药物很好地在肿瘤部位富集，实现对肿瘤的有效抑制和治疗；提高化疗药物的利用率，降低化疗药物毒副作用。本发明热敏脂质体物理化学稳定性良好，热敏脂质体的粒径较小且粒径均一，可以借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，有助于实现对肿瘤的被动靶向。
综上，本发明有益效果包括以下几个方面：
1、本发明热敏脂质体具有优良的温度敏感效果，能够高效的控制药物释放；
2、所述热敏脂质体可实现活体成像，能够对热敏脂质体的生物分布进行实时监测；
3、所述热敏脂质体生物相容性好，减小化疗药物的毒副作用；
4、本发明制备方法简单，成本低，易实现产业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的热敏脂质体的TEM图像；
图2为实施例1制备的热敏脂质体在43℃条件下发生结构崩解的TEM图像；
图3为实施例1制备的热敏脂质体的粒径分布图；
图4为对比实施例1制备的空白脂质体的粒径分布图；
图5为实施例1制备的热敏脂质体在不同温度下化疗药物的释放曲线；
图6为实施例1制备的热敏脂质体在加/不加近红外光照射条件下的化疗药物释放曲线。
图7为对比实施例1制备的空白脂质体在不同ICG浓度下对MCF-7/ADR细胞存活率的影响；
图8为实施例1制备的热敏脂质体与单独DOX药物在不同DOX浓度下对MCF-7/ADR细胞存活率的影响。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供了一种热敏脂质体，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述光敏剂为吲哚菁绿或二氢卟吩e6，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm。
所述磷脂酰胆碱形成磷脂双分子层，所述光敏剂和化疗药物被所述磷脂双分子层包裹，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂双分子层中。
所述化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1：（1～4）：（25～35）：（1～5）。
所述化疗药物为盐酸阿霉素（DOX）、表阿霉素、紫杉醇、去甲长春花碱或顺铂。
生物体对650～900nm范围的近红外光具有高度透过性，而吲哚菁绿和二氢卟吩e6在此范围内具有高吸收的特性，然后进行光热转换，使热敏脂质体温度升高，在达到磷脂酰胆碱的相变温度时，导致脂质体的流动性和通透性大大增加，释放化疗药物，大大提高了化疗药物在靶部位上的富集和对靶细胞的杀伤力。同时哚菁绿和二氢卟吩e6可实现活体荧光成像，能够对热敏脂质体在生物体内的分布进行实时监测，有助于了解热敏脂质体在体内靶部位的富集量和在其他器官的生物分布，提高热敏脂质体的治疗效果；所述光敏剂可以被磷脂酰胆碱形成的磷脂双分子层包裹，形成粒径较小且粒径均一的热敏脂质体。同时，吲哚菁绿或二氢卟吩e6生物相容性较好。
所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)中的至少一种。所述磷脂酰胆碱为热敏材料，当环境温度低于热敏材料的相变温度时，磷脂酰胆碱形成的磷脂双分子层呈凝胶态，流动性和通透性均较小，当热敏材料受热达到相变温度时，磷脂分子运动加强，如：翻转、移动、摆动等，此时，相邻的磷脂分子之间距离增加，磷脂双分子层的厚度减小，这种结构的变化导致脂质体的流动性和通透性大大增加，短时间内释放被磷脂双分子层包裹的化疗药物，所述热敏脂质体对化疗药物的控制释放能力好。同时所述磷脂酰胆碱具有良好的生物相容性。
所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）。所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）两种热敏材料时，当热敏材料受热达到两种材料的相变温度时，该热敏材料更容易液化，更加有利于脂质体的结构的崩解，有助于化疗药物的释放。在实施例中，用近红外光照射使热敏材料温度达到42～43℃进行相变。
所述DSPC和DMPC的质量比为（1～4）:1。
所述聚乙二醇衍生化磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)中的至少一种。聚乙二醇作为一种亲水性极性分子，避免了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，本发明所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂双分子层，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的聚乙二醇形成亲水性外层，显著延长了脂质体在体内的循环时间，进而借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，有助于实现对肿瘤的被动靶向，从而增强药物的生物利用率。
同时，本发明具有聚乙二醇的亲水保护层，能够避免热敏脂质体的聚集，可以提高热敏脂质体在储存期内的稳定性；制备出的热敏脂质体颗粒均一、尺寸稳定性好。
所述聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)。
所述热敏脂质体中还包括胆固醇，所述胆固醇分子镶嵌于磷脂酰胆碱分子之间，可以提高磷脂双分子层的刚性，提高了磷脂分子层的稳定性。
所述化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇的质量比为1：（1～4）：（25～35）：（1～5）：（1～5）。
吲哚菁绿或二氢卟吩e6具有光学成像性质和强光热转换特性，当所述热敏脂质体应用于治疗时，可以在给予热敏脂质体之前和/或期间和/或之后，对靶部位进行红外光照射，根据热敏脂质体的荧光成像图像，可以实时监测热敏脂质体在生物体内的分布状态，有利于了解热敏脂质体在靶部位中的富集数量和作用机制，同时根据光学成像的信息，可以更加容易地选择最佳加热时间等因素，使热敏脂质体达到更好的治疗效果；同时吲哚菁绿或二氢卟吩e6在近红外光照射下产热，导致热敏材料发生相变，使热敏脂质体在靶部位定位释放药物，从而达到靶向治疗的作用；本发明热敏脂质体物理化学稳定性良好，热敏脂质体的粒径较小且粒径均一，有利于药物有效地到达靶部位中释放药物并进行高效治疗；同时热敏脂质体的生物相容性良好，副作用小。
所述化疗药物为盐酸阿霉素且所述光敏剂为吲哚菁绿。所述吲哚菁绿在近红外光照射下，具有强的光热转换性质，同时具有良好的荧光成像作用，吲哚菁绿是唯一一种被美国食品药品监督管理局（FDA)批准的用于人类医学成像和诊断的试剂，生物相容性较好，将所述吲哚菁绿作为光敏剂应用在热敏脂质体中一方面可以实时监测热敏脂质体在体内的分布状况以及在靶部位的富集状况，另一方面可以起到定位释放化疗药物，起到治疗的作用，同时，吲哚菁绿荧光成像的作用有助于更好的确定近红外光照射时间等因素，进一步提高治疗效果；吲哚菁绿和盐酸阿霉素为水溶性，可以被磷脂双分子层亲水腔包裹，不易团聚，形成的热敏脂质体粒径较小且粒径均一，得到的热敏脂质体生物相容性良好。
本发明热敏脂质体不仅具有温度敏感性，在一定的温度下可以定位释放化疗药物，同时所述热敏脂质体具有荧光成像的性质，根据该性质可以实时监测热敏脂质体在体内的分布状态，为更好地定位定时释放化疗药物、提高治疗效果提供了重要的支持；所述热敏脂质体粒径小，粒径均一，且生物相容性良好。
第二方面，本发明提供了一种热敏脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂按质量比为25～35:1～5的比例溶解，旋转蒸发后，得到磷脂薄膜，再将所述磷脂薄膜溶解得到磷脂溶液；
（2）将光敏剂和化疗药物按质量比为1～4:1的比例溶解后滴加至所述磷脂溶液中并超声5～10min，然后超滤3～5次，得到所述热敏脂质体，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述光敏剂为吲哚菁绿或二氢卟吩e6，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm。
所述步骤（1）的磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂溶解于乙醇和水的混合溶液中。
所述步骤（1）的所述磷脂薄膜溶解于超纯水或磷酸盐缓冲溶液中。
所述步骤（2）的光敏剂和化疗药物溶解于超纯水、磷酸盐缓冲溶液、乙腈、氯仿或乙醇和水的混合溶液中。
当所述步骤（2）的光敏剂和化疗药物为水溶性物质时，将所述光敏剂和化疗药物溶解于超纯水或磷酸盐缓冲溶液中。当所述步骤（3）的光敏剂和化疗药物为脂溶性物质时，将所述光敏剂和化疗药物溶解于乙腈、氯仿或乙醇和水的混合溶液中。
所述步骤（2）超声时，使用细胞超声波破碎仪以20kHz的频率及130W的功率超声5～10min。
所述步骤（2）超滤时，使用10kDa的超滤管离心超滤3～5次。
步骤（2）超滤后得到热敏脂质体水溶液。
超滤后制得的所述热敏脂质体中DOX在水中的浓度为60～100μg/ml，所述热敏脂质体中吲哚菁绿或二氢卟吩e6在水中的浓度为150～300μg/ml。
所述化疗药物为盐酸阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、去甲长春花碱或顺铂。
生物体对650～900nm范围的近红外光具有高度透过性，而吲哚菁绿和二氢卟吩e6在此范围内具有高吸收的特性，然后进行光热转换，使热敏脂质体温度升高，在达到磷脂酰胆碱的相变温度时，导致脂质体的流动性和通透性大大增加，释放化疗药物，大大提高了化疗药物在靶部位上的富集和对靶细胞的杀伤力。同时哚菁绿和二氢卟吩e6可实现活体荧光成像，能够对热敏脂质体在生物体内的分布进行实时监测，有助于了解热敏脂质体在体内靶部位的富集量和在其他器官的生物分布，更好地确定近红外光的照射时间等因素，提高热敏脂质体的治疗效果；所述光敏剂可以被磷脂酰胆碱形成的磷脂双分子层包裹，形成粒径较小且粒径均一的热敏脂质体。同时，吲哚菁绿（ICG）或二氢卟吩e6生物相容性较好。
所述化疗药物为盐酸阿霉素且所述光敏剂为吲哚菁绿。
所述吲哚菁绿在近红外光照射下，具有强的光热转换性质，同时具有良好的荧光成像作用，吲哚菁绿是唯一一种被美国食品药品监督管理局（FDA)批准的用于人类医学成像和诊断的试剂，生物相容性较好，将所述吲哚菁绿作为光敏剂应用在热敏脂质体中一方面可以实时监测热敏脂质体在体内的分布状况以及在靶部位的富集状况，另一方面可以起到定位释放化疗药物，起到治疗的作用，同时，吲哚菁绿荧光成像的作用有助于更好的确定近红外光照射时间等因素，进一步提高治疗效果；吲哚菁绿和盐酸阿霉素为水溶性，可以被磷脂双分子层亲水腔包裹，不易团聚，形成的热敏脂质体粒径较小且粒径均一，得到的热敏脂质体生物相容性良好。
所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)中的至少一种。所述磷脂酰胆碱为热敏材料，当环境温度低于热敏材料的相变温度时，磷脂酰胆碱形成的磷脂双分子层呈凝胶态，流动性和通透性均较小，当热敏材料受热达到相变温度时，磷脂分子运动加强，如：翻转、移动、摆动等，此时，相邻的磷脂分子之间距离增加，磷脂双分子层的厚度减小，这种结构的变化导致脂质体的流动性和通透性大大增加，短时间内释放被磷脂双分子层包裹的化疗药物，所述热敏脂质体对化疗药物的控制释放能力好。同时所述磷脂酰胆碱具有良好的生物相容性。
所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）。所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸（DSPC）和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）两种热敏材料时，当热敏材料受热达到两种材料的共同相变温度时，该热敏材料更容易液化，更加有利于脂质体的结构的崩解，有助于化疗药物的释放。在实施例中，用近红外光照射使热敏材料温度达到42～43℃进行相变。
所述DSPC和DMPC的质量比为（1～4）:1。
所述聚乙二醇衍生化磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)中的至少一种。聚乙二醇作为一种亲水性极性分子，避免了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，本发明所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂双分子层，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的聚乙二醇形成亲水性外层，显著延长了脂质体在体内的循环时间，进而借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，有助于实现对肿瘤的被动靶向，从而增强药物的生物利用率。
同时，本发明具有聚乙二醇的亲水保护层，能够避免热敏脂质体的聚集，可以提高热敏脂质体在储存期内的稳定性；制备出的热敏脂质体颗粒均一、尺寸稳定性好。
所述聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)。
所述热敏脂质体中还包括胆固醇，所述胆固醇分子镶嵌于磷脂酰胆碱分子之间。所述胆固醇分子镶嵌于磷脂酰胆碱分子之间，可以提高磷脂双分子层的刚性，提高了磷脂分子层的稳定性。
所述化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇的质量比为1：（1～4）：（25～35）：（1～5）：（1～5）。
磷脂酰胆碱分子包括亲水性头部和两个疏水性尾部，当磷脂处于水性环境时，亲水性头部聚集成线性构型，而它们的疏水性尾部平行地排列。由于疏水性尾部试图避开水性环境，第二列磷脂分子与第一列磷脂分子尾部对尾部进行排列，为了最大程度地避免与水性环境接触，同时使表面积与体积之比最小从而达到最小能量构型，两列磷脂聚集成球（形成磷脂双分子层），磷脂双分子层包裹光敏剂和化疗药物；所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂通过物理作用和所述磷脂层中的磷脂分子结合从而穿插于所述磷脂层，进行超声分散后，使热敏脂质体的粒径更小，最后通过超滤，得到热敏脂质体。
本发明根据化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂的性质，将这些物质溶解后，化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂通过自组装过程形成所述热敏脂质体，不需要进行化学反应，制备过程环保无毒，制备方法简单易操作，制备出的热敏脂质体的粒径较小且粒径均一。
第三方面，以上所述的热敏脂质体在抗肿瘤药物中的应用。
当所述热敏脂质体应用于肿瘤药物时，可以给予热敏脂质体之前和/或期间和/或之后，进行红外光照射，可以实时监测热敏脂质体在体内的分布以及在肿瘤部位的富集数量，确定最佳红外光照射时间，使热敏脂质体温度升高，选择在肿瘤部位释放化疗药物，从而使化疗药物很好地在肿瘤部位富集，实现对肿瘤的有效抑制和治疗；提高化疗药物的利用率，降低化疗药物毒副作用。本发明热敏脂质体物理化学稳定性良好，热敏脂质体的粒径较小且粒径均一，可以借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，有助于实现对肿瘤的被动靶向。
实施例1
一种热敏脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.7mg的DSPC（购自Sigma-Aldrich公司）、1.5mg的DMPC（购自Sigma-Aldrich公司）、0.15mg的胆固醇（购自Avanti公司）和0.15mgDSPE-PEG-MAL（购自Avanti公司）溶于4mL体积分数为4%的乙醇水溶液中；然后使用旋转蒸发仪将乙醇溶液蒸干，在50mL圆底烧瓶中形成均匀的磷脂薄膜；再加入3ml超纯水溶解磷脂薄膜，形成磷脂溶液；
（2）将0.15mg的DOX与0.6mg的ICG（均购自Sigma-Aldrich公司）溶于0.15mL超纯水中并混合均匀后滴加至圆底烧瓶中的磷脂溶液中，其间使用细胞超声波破碎仪以20kHz的频率及130W的功率超声5min；最后使用10kDa的超滤管离心超滤3次，即得热敏脂质体（表示为DI-NPs）。
对比实施例1
一种空白脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）的操作同实施例1的步骤（1）；
（2）仅将0.6mg的ICG溶于超纯水中，并使用同样方法制备出仅包载ICG的空白脂质体（表示为I-NPs）。
图1为实施例1制得的热敏脂质体的透射电镜图，从图1中可以看出，本实施例制得的热敏脂质体的粒径为50nm左右，粒径较小。图2为热敏脂质体在43℃加热以后热敏脂质体结构崩解的TEM图像，热敏脂质体由正常的圆形或椭圆形结构变成纺锤形；粒度分析仪测得该DI-NPs粒径（Number平均值）大小为48.94±3.35nm（如图3所示），测得表面电位为-17.07±1.08mV；I-NPs粒径（Number平均值）大小为53.6±7.3nm（如图4所示），测得表面电位为-36.53±0.3mV。结果表明，说明本发明热敏脂质体颗粒显示出良好的颗粒形态和分散度。
实施例1制备的热敏脂质体在不同温度下化疗药物的释放曲线如图5所示，将两组等量的热敏脂质体分别放置在37℃和43℃的恒温环境下振荡，并分别在第1、2、3、4、5、6小时取样，通过Lambda750紫外/可见光光度计检测DOX药物释放速率（DOX释放百分比=释放的DOX量/初始DOX量×100%），结果表明，在43℃条件下热敏脂质体表现出更快的药物释放效果，说明本发明的热敏脂质体中在43℃达到磷脂酰胆碱的相变温度，导致热敏脂质体的流动性和通透性大大增加，短时间内释放了化疗药物。
实施例1制备的热敏脂质体在加/不加近红外光照射条件下的化疗药物释放曲线如图6所示，将两组等量的热敏脂质体放置在37℃恒温环境下振荡，第一组样品不作任何处理，第二组样品在第1、3、5小时分别用1.6W/cm2的波长为808nm的近红外光照射5min，两组分别在1、2、3、4、5、6小时点取样，同样通过Lambda750检测DOX药物释放速率，结果表明，经过近红外光照射的热敏脂质体药物释放速率会得到明显的提升。说明本发明的热敏脂质体在近红外光照射下，吲哚菁绿进行光热转换，使热敏脂质体温度升高，导致热敏脂质体的流动性和通透性大大增加，有效地释放了化疗药物。
本发明同时对DI-NPs在细胞水平的生物安全性和治疗效果进行了评价。以多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR为例，使用含有不同ICG浓度的I-NPs的细胞培养液孵育细胞，在细胞对I-NPs摄取4小时后更换成不含有I-NPs的普通培养液，1.6W/cm2的波长为808nm的近红外光治疗5分钟，用以检测该脂质体颗粒及近红外光强度的生物安全性；实验结果如图7所示，图7为对比实施例1制备的空白脂质体在不同ICG浓度下对MCF-7/ADR细胞存活率的影响；结果表明，在ICG浓度达到160μg/mL时，细胞依然具有很高的存活率，证明本发明的热敏脂质体具有很高的生物安全性，单一的ICG光热响应对细胞的损伤很小。
使用含有不同DOX浓度的单独盐酸阿霉素和DI-NPs的细胞培养液孵育细胞4小时，1.6W/cm2的波长为808nm的近红外光治疗5分钟，用以检测DI-NPs细胞的治疗效果；结果如图8所示，图8为实施例1制备的热敏脂质体与单独DOX药物在不同DOX浓度下对MCF-7/ADR细胞存活率的影响。实验结果表明，在DOX浓度为相同的情况下，DI-NPs的对肿瘤细胞的治疗效果要好于单独盐酸阿霉素的治疗效果，DI-NPs通过光敏剂ICG响应将热敏脂质体中的DOX释放出来，进而对肿瘤细胞产生良好的治疗效果，实现了化疗药物的可控释放。
实施例2
一种热敏脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.7mg的DSPC（购自Sigma-Aldrich公司）、1.5mg的DMPC（购自Sigma-Aldrich公司）、0.45mg的胆固醇和0.75mg DSPE-PEG-MAL（购自Sigma-Aldrich公司）溶于4mL体积分数为4%的乙醇溶液中；然后使用旋转蒸发仪将乙醇溶液蒸干，在50mL圆底烧瓶中形成均匀的磷脂薄膜；再加入3ml超纯水溶解磷脂薄膜，形成磷脂溶液；
（3）将0.15mg的DOX与0.15mg的ICG溶于0.15mL超纯水中并混合均匀后逐滴加至圆底烧瓶中的磷脂溶液中，其间使用细胞超声波破碎仪以20kHz的频率及130W的功率超声5min；最后使用10kDa的超滤管离心超滤3次，即得热敏脂质体（表示为DI-NPs）。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种热敏脂质体，其特征在于，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述化疗药物为盐酸阿霉素，所述光敏剂为吲哚菁绿，所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，所述聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm，所述化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:4:28:1。
2.一种热敏脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂按质量比为28:1的比例溶解，旋转蒸发后，得到磷脂薄膜，再将所述磷脂薄膜溶解得到磷脂溶液；
(2)将光敏剂和化疗药物按质量比为4:1的比例溶解后滴加至所述磷脂溶液中并超声5～10min，然后超滤3～5次，得到所述热敏脂质体，所述热敏脂质体包括化疗药物、光敏剂、磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂，所述化疗药物为盐酸阿霉素，所述光敏剂为吲哚菁绿，所述磷脂酰胆碱为1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，所述聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，所述热敏脂质体的粒径为40～60nm。
3.如权利要求2所述的热敏脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生化磷脂溶解于乙醇和水的混合溶液中。
4.如权利要求2所述的热敏脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的光敏剂和化疗药物溶解于超纯水、磷酸盐缓冲溶液、乙腈、氯仿或乙醇和水的混合溶液中。
5.如权利要求1所述的热敏脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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