CN103898036A - 一种高效表达儿茶素的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种高效表达儿茶素的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明公开了一种高效表达儿茶素的基因工程菌，携带有二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)两种外源基因，能够用于高效生成儿茶素。

Description

一种高效表达儿茶素的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种能够高效表达儿茶素的基因工程菌，属于生物工程领域。

背景技术

儿茶素是茶叶中的重要成分，又称儿茶精、茶单宁，是一种黄烷醇衍生物，由糖类经一系列酶的作用，通过莽草酸途径，形成苯环化合物，最后再经一系列酶合成。已有的研究证实，儿茶素具有防治心血管疾病、预防癌症等多种功能；右旋儿茶素还能降低毛细血管的通透性、止泻、止血、抗病毒、杀真菌、抑制ACE及预防胃溃疡；同时，儿茶素属于还原性多元酚类物质，在水溶液中易被空气氧化，常用作抗氧化剂。

在现有技术中，溶剂萃取法是提取儿茶素最常见方法，其原理是利用儿茶素易溶于水、酒精和乙酸乙酯等而不溶于氯仿等溶剂进行分离提纯。近年来，本领域也广泛发展了超临界流体萃取(SFE)等方法来提高儿茶素的萃取率(宓晓黎，超临界二氧化碳萃取技术在茶叶中EGCC等儿茶素组分的研究，中国茶叶，1997(6)：18～19；Xue-Li Cao et al lSupercritical fluid extraction of catechinsfrom Cratoxylum pruunifolium Dyer and subsequent purification byhigh-speed counter-current chromtography.Journal of Chmatography A，2000(898)：75～81)；也有研究尝试使用多种吸附树脂对儿茶素不同程度的吸附与解吸作用进行提纯(HiroShi Horita.Extraction and purification ofcatechins form tea[M]，Proceedings of the Internat ional Sympos ium on TeaScience，Shizuoka，Japan，1991，625～633)；还有尝试通过高速逆流色谱制备技术(HSCCC)分离制备不同种类儿茶素(李军等，茶多酚超临界萃取法研究，浙江化工，1995(4)：10～13)。

上述方法都是早期传统化学分离方法的改进，存在的主要缺点是需要消耗大量的茶叶才能得到少量精细品；同时，在提纯过程中需要使用大量的有机试剂影响成品质量，也导致了潜在的安全性风险。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种基因工程菌，该菌株通过生物合成技术制备儿茶素，具有产率高、成本低、可高效表达生产等优点。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

一种高效表达儿茶素的基因工程菌，携带有LAR和DFR基因序列，其中DFR基因序列、LAR基因序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

通过上述序列可表达二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)，从而与二氢槲皮素(DHQ)反应底物作用生成儿茶素。

相应的，本发明公开了上述基因工程菌的构建方法，包括下述步骤：

1)通过PCR扩增DFR和LAR基因序列；

2)利用限制性内切酶双酶切步骤1)得到的DNA片段并回收；然后用同样的限制性内切酶双酶切PRSF和PET载体并回收；

3)利用T4-DNA连接酶连接DFR片段和PRSF片段，得到DFR-PRSF重组质粒；连接LAR片段和PET片段，得到LAR-PET重组质粒；

4)将重组质粒DFR-PRSF和LAR-PET同时转化大肠杆菌，制得含有DFR和LAR基因序列的基因工程菌；

5)从步骤4)所得基因工程菌中提取重组质粒DFR-PRSF和LAR-PET，再同时转化大肠杆菌，得到高效表达儿茶素的基因工程菌。

在上述方法中，步骤1)用于扩增DFR和LAR基因序列的引物序列分别为DFR/F：ATGAAAGACTCTGTTGC，DFR/R：TTAAACCTTGTTGCCATTG；LAR/F：ATGACTGTGTTGGAATCTG，LAR/R：TCAAGCACACATTGTGATG，步骤2)采用的限制性内切酶为Xho I和Nde I。

在上述方法中，步骤4)所用大肠杆菌为DH5α，步骤5)所用大肠杆菌为BL21(还包括但不限于其衍生的BL21(DE3)、BL21(DE3)PLySs等)。

在上述方法中，PCR反应条件采用本领域常规方法，也可参考分子生物学实验手册等教材的记载。

相应的，本发明还公开了所述基因工程菌在生产儿茶素中的应用，具体包括下述步骤：

1)将所述基因工程菌接种于LB培养基里培养，然后再加入新的LB培养基中培养，采用IPTG诱导；

2)在步骤1)所培养的菌液中加入底物二氢槲皮素继续培养，然后离心取上清利用有机溶剂萃取，旋蒸后得到儿茶素粉末。

步骤1)培养方法采用本领域常规菌株培养诱导方法；所述LB培养基组成为50μg/mL Kan和50μg/mL Amp。

附图说明

图1为产物的阳性克隆验证，其中1-3为CsDFR菌落阳性克隆验证，4-6为CsLAR菌落阳性克隆验证；

图2为以二氢槲皮素为底物的酶活HPLC检测。

具体实施方式

在下述实施例中，外源基因分别为二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)的表达基因，反应底物为二氢槲皮素(DHQ)。

在下述实施例中，采用大肠杆菌作为宿主，大肠杆菌具有遗传操作简单、培养条件温和、生长速度迅速等特点，采用大肠杆菌BL21(或其衍生的BL21(DE3)、BL21(DE3)PLySs等)作为生产菌株表达质粒PRSF和PET，并将其改造为可以表达DFR和LAR基因的载体。

实施例1 构建高效表达儿茶素的基因工程菌

1)DFR和LAR序列的扩增

根据登陆的DFR和LAR序列，设计双酶切引物，扩增带有Xho I和Nde I酶切位点的序列。

DFR对应的引物序列为DFR-Nde I/F：CATATGATGAAAGACTCTGTTGC，DFR-Xho I/R：CTCGAGTTAAACCTTGTTGCCATTG；

LAR对应的引物序列为LAR-Nde I/F：CATATGATGACTGTGTTGGAATCTG，LAR-XhoI/R：CTCGAGTCAAGCACACATTGTGATG；

以茶树cDNA为模板，用上述引物进行扩增。

其中，PCR反应体系为：1μL模板，10μL5×buffer，0.5μL高保真酶，4μL dNTP Mix，上下游引物各1μL，无菌水32.5μL。PCR扩增条件为：98℃10s，62℃15s，72℃30s。程序结束后，对产物进行胶回收。

2)构建含有DFR和LAR基因序列的基因工程菌

用Xho I和Nde I两种限制性内切酶双酶切上述得到的DNA片段，纯化回收小片段；用同样的两种限制性内切酶双酶切PRSF和PET载体，纯化回收大片段。利用DNA连接酶连接DFR小片段和PRSF大片段，得到DFR-PRSF重组质粒；连接LAR小片段和PET大片段，得到LAR-PET重组质粒。

将重组质粒DFR-PRSF和LAR-PET同时转化大肠杆菌DH5α，得到含有LAR和DFR基因序列的基因工程菌。

参考图1所示的CsDFR菌落阳性克隆验证、CsLAR菌落阳性克隆验证，显示本发明成功构建了含有目的外源基因的基因工程菌。

3)构建高效表达儿茶素的基因工程菌

从上述基因工程菌提取重组质粒DFR-PRSF和LAR-PET，同时转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达儿茶素的基因工程菌。

实施例2 利用实施例1的基因工程菌生产儿茶素

1)将构建好的基因工程菌接种于20mL含50μg/mL Kan和50μg/mL Amp LB培养基里，37℃，200rpm培养过夜；再以1∶50的比例加入400mL新的含50μg/mLKan和50μg/mL Amp LB培养基里，培养至OD600＝0.5；加入终浓度为1mmol/L的IPTG在28℃下诱导5h。

2)制备儿茶素：在上述所培养菌液中加入底物DHQ，继续培养过夜。4℃，5000rpm离心取上清，用等体积乙酸乙酯进行萃取，再用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到儿茶素粉末。甲醇溶解后用高效液相进行检测，检测结果如图2所示。

由图2可以看到(C为儿茶素)，本发明的菌株可以用于特异性地生产儿茶素，无杂质干扰，产率高。

Claims (7)

1.一种高效表达儿茶素的基因工程菌，其特征在于携带有DFR和LAR基因序列，其中DFR基因序列、LAR基因序列分别为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括下述步骤：

1)通过PCR扩增DFR和LAR基因序列；

2)利用限制性内切酶双酶切步骤1)得到的DNA片段并回收；然后用同样的限制性内切酶双酶切PRSF和PET载体并回收；

3)利用T4-DNA连接酶连接DFR片段和PRSF片段，得到DFR-PRSF重组质粒；连接LAR片段和PET片段，得到LAR-PET重组质粒；

4)将重组质粒DFR-PRSF和LAR-PET同时转化大肠杆菌，制得含有DFR和LAR基因序列的基因工程菌；

5)从步骤4)所得基因工程菌中提取重组质粒DFR-PRSF和LAR-PET，再同时转化大肠杆菌，得到高效表达儿茶素的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤1)用于扩增DFR和LAR基因序列的引物序列分别为

DFR/F：ATGAAAGACTCTGTTGC，DFR/R：TTAAACCTTGTTGCCATTG；

LAR/F：ATGACTGTGTTGGAATCTG，LAR/R：TCAAGCACACATTGTGATG；

步骤2)采用的限制性内切酶为Xho I和Nde I。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤4)所用大肠杆菌为DH5α，步骤5)所用大肠杆菌为BL21。

5.权利要求1所述基因工程菌在生产儿茶素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于包括下述步骤：

1)将所述基因工程菌接种于LB培养基里培养，然后再加入新的LB培养基中培养，采用IPTG诱导；

2)在步骤1)所培养的菌液中加入底物二氢槲皮素继续培养，然后离心取上清利用有机溶剂萃取，旋蒸后得到儿茶素粉末。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述LB培养基组成为50μg/mL Kan和50μg/mL Amp。

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