CN103898008B - 一种有机物料腐熟剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业微生物菌剂制备工艺技术领域，特别涉及一种有机物料腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：（1）菌种选育选择及其安全性鉴定；（2）种子液制备，包括培养基制备、种子液制备、二级种子液制备和沤堆发酵种子液制备；（3）堆沤发酵，包括堆沤发酵培养基配方及其发酵条件设置；（4）堆制产品干燥、粉化、计量、包装，即制成有机物料腐熟剂。本发明的生产成本低廉、工艺简洁成熟、方便使用、腐熟应用效果显著，有利于普遍推广和应用。

Description

一种有机物料腐熟剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种有机物料腐熟剂的制备方法。

背景技术

现有技术中，有机物料腐熟剂的核心微生物一般按照微生物分类水平的差异进行液体或固体发酵，然后将其菌剂的制品按照一定配比进行混合、载体吸附、干燥等工艺。

目前，多数腐熟剂产品通过对复合菌种的扩大培养，通过混合发酵或者经单一发酵过后充分混合简单混合后即为一种有机物料腐熟剂的新产品，而未涉及到有机物料腐熟剂的评价指标中涉及的执行标准、质量监督、田间示范推广等商业性范畴，缺乏有机物料腐熟剂在批量生产、推广、使用等方面的探索，其专利产品在进程中的潜力未做描述。其缺点是，腐熟剂产品追求功能性菌种的数量，而未对其发酵水平和酶活力进行评价，造成生产发酵工艺繁琐、生产周期长、活菌数及酶活力水平不确定；制品未严格执行农业部制定的相关标准；在使用方法上，没有在不同地区、不同气候、土壤环境下对多种作物秸秆直接还田模式下的功能设置田间试验进行验证。

中国专利申请号为201010615828.X的发明专利，公开了一种秸秆腐熟剂，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉。然而该对比文件仅将五种菌简单混合制成腐熟剂，在实际生产中，生产工艺复杂、效率低下、生产成本高、对其制备的产品的性能指标未作评价，在其进一步进程中，存在潜在的不确定因素，且腐熟对象及使用环境不具备广谱性，制得的腐熟剂使用效果较差。

然而，现有技术中，通过堆沤的方式对秸秆腐熟剂的功能性菌种进行繁殖培养，制备出一种原材料来源广泛、价格低廉、生产工艺简洁、活菌数量多、酶活力旺盛且具有广谱性应用效果的商品有机物料腐熟剂，尚未报道。

发明内容

本发明目的在于针对现有腐熟菌剂技术生产成本高昂、制备工艺复杂、使用方法繁琐、应用效果不稳定等问题，提出一种成本低廉、工艺简洁、方便使用、效果显著的有机物料腐熟剂的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现的。

一种有机物料腐熟剂的制备方法，它包括以下步骤：

(1)菌种选育

A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillusslaterosporus)、康氏木霉菌(Trichodermakoningii)、黄孢原毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)、嗜热侧孢霉菌(Sporotrichumthermophile)、嗜冷芽孢八叠球菌(Sporosarcinapsychropilus)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocecrllum)中五种或五种以上的菌种组成一组菌种组合。其中，侧孢芽孢杆菌的保藏单位名称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2006年7月13日，保藏编号是CGMCCNO.1755，分类命名是Bacillusslaterosporus。

本发明根据木质纤维素的组成成分及其腐熟特征，选用含细菌和真菌的混合微生物本发明产品的核心微生物，能够在不同腐熟时间和环境温度等条件下，对作物秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素进行有序腐解。其中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌，代谢产生纤维素酶；康氏木霉既可以产生纤维素酶也可以产生木聚糖酶；嗜热侧孢霉菌代谢产生半纤维素酶；黄孢原毛平革菌代谢产生木质素酶；嗜冷芽孢八叠球菌能够在低温环境下代谢产生纤维素酶，并且在低温环境中产生热量，提升有机物料腐熟体堆制温度；热纤维梭菌能够在高温厌氧环境下能够将纤维素水解为单糖。

A2、菌种生物安全性鉴定：根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株。对上述各个菌种进行横向安全性鉴定筛选，将被感染的有毒的不安全的菌种去除，保留无安全隐患的菌种，确保制得的有机物料腐熟剂无毒安全。

腐熟剂的生物安全性鉴定方法参照《微生物肥料生物安全通用技术总则》(NY1109-2006)，采用小鼠急性经口试验，委托北京市疾病预防控制中心鉴定，鉴定结果如下表所示。

表1：菌种安全性鉴定

由上表可以看出，本有机物料腐熟剂及其选用的菌种的安全性鉴定结果均为：无毒、无安全隐患，可以作为农业微生物核心菌种进行繁殖、使用。

(2)种子液制备。

B1、试管斜面培养。

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

枯草芽孢杆菌斜面培养基(营养琼脂培养基)-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

地衣芽孢杆菌斜面培养基(营养琼脂培养基)-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

康氏木霉菌斜面培养基-草粉60～80g/L，硫酸铵25～35g/L，磷酸二氢钾4～8g/L，硫酸镁1～2g/L，氯化钙0.1～0.3g/L，调节pH为6～7，加入琼脂15g/L，60～100℃加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌；

冷却后切割成条的作用是：培养基中的草粉遇水变成粘稠物，流动性差，无法直接装入斜面中，所以冷却成条装，便于装入斜面中，使用方便，实用。

黄孢原毛平革菌斜面培养基(麦麸浸汁-蔗糖培养基)-麦麸120～140g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖10～15g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌；

嗜热侧孢霉菌斜面培养基(PDA斜面培养基)-去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸15～20min，用四层纱布过滤，加蔗糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L，灭菌。

侧孢芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌。

嗜冷芽孢八叠球菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌。

热纤维梭菌斜面培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌。

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用5～10ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件为：培养温度为25～50℃，培养时间为24～96h。

B2、种子液制备。

B21、一级种子液制备：将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为10～120亿cfu/ml，真菌的活菌数为0.5～3亿cfu/ml；分别储存于无菌钢制容器中，备用。

B22、二级种子液制备：将B21步骤得到的一级种子液分别接种于经121℃灭菌120min的专用固体培养基中进行单个菌种发酵，接种2-7天后采用平板计数法测定活菌数并用无菌水调节目标菌种的活菌数，制备成菌种单一的均匀菌悬液；制得二级种子液，备用；

枯草芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸150～170份、谷壳40～60份、玉米粉30～50份、豆粕20～30份、蔗糖1～3份、磷酸二氢钾0.5～1.5份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.01～0.1份、石灰粉4～6份、水290～300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用。

其中，平板计数法的详细测定方法可参照《农用微生物菌剂》(GB20287～2004)。

优选地，枯草芽孢杆菌的固体发酵培养条件如下表所示。

地衣芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕15～20份、玉米粉40～55份、麦麸200～240份、酵母粉4～6份、磷酸二氢钾0.5～1.5份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.05～0.15份、碳酸钙12～16份、石灰粉5～6份、水295～300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，地衣芽孢杆菌的固体发酵培养条件如下表所示。

康氏木霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳100～120份、麦麸60～80份、硫酸铵4～6份、磷酸氢二钾1～2份、七水硫酸镁0.1～0.5份、无水氯化钙0.1～0.5份，水200～230份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5～6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5～3亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，康氏木霉菌的固体发酵培养条件如下表所示。

黄孢原毛平革菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑200～300份、谷壳400～600份、麦麸100～200份、硫酸铵10～20份、磷酸氢二钾5～10份、七水硫酸镁0.5～1份、无水氯化钙0.5～1份、水200～250份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5～6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为05～3亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，黄孢原毛平革菌的固体发酵培养条件如下表所示。

嗜热侧孢霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳150～180份、麦麸20～40份、硫酸铵3～5份、磷酸氢二钾1～2份、七水硫酸镁0.1～02份、无水氯化钙0.1～0.3份、水200～240份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5～6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5～3亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，嗜热侧孢霉菌的固体发酵培养条件如下表所示。

侧孢芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸400～600份、玉米粉100～200份、豆粕60～100份、蔗糖5～10份、谷壳粉50～80份、磷酸氢二钾3～10份、七水硫酸镁1～5份、石灰30～50份，水800～1000份。分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将侧孢芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，侧孢芽孢杆菌的固体发酵培养条件如下表所示。

嗜冷芽孢八叠球菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麸皮700～800份、谷壳50～100份、玉米粉10～50份、豆粕10～50份、硫酸镁0.5～1.0份、硫酸锰0.1～0.5份，石灰40～60份，水1000～1100份。分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将嗜冷芽孢八叠球菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，嗜冷芽孢八叠球菌的固体发酵培养条件如下表所示。

热纤维梭菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕15～20份、玉米粉40～55份、麦麸200～240份、酵母粉4～6份、磷酸二氢钾0.5～1.5份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.05～0.15份、碳酸钙12～16份、石灰粉5～6份、水295～300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述热纤维梭菌一级种子液进行接种，装入密封袋，厌氧发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为1～20亿cfu/ml的液体种子液，备用。

优选地，热纤维梭菌的固体发酵培养条件如下表所示。

B23、沤堆发酵种子液制备

将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成沤堆发酵种子液，沤堆发酵种子液中活菌总数为5-20亿/ml；

(3)堆沤发酵

C1、堆沤发酵培养基

包括以下重量百分比的原料：木屑30～35％、稻草粉10～20％、谷壳15～25％、麸皮20～25％、蔗糖0.5～1％、硫酸铵3～5％、磷酸氢二钾0.3～0.5％、七水硫酸镁0.1～0.3％，自然pH值，水料重量比为1：1～4:1。

C2、堆沤方法及初始培养条件

将上述堆沤发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的沤堆发酵种子液喷洒到堆料表面；沤堆发酵种子液与堆沤发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵。

C3、设置初始发酵条件

含水量：调节初始含水量为50～60％，含种子液；

初始pH值：自然pH值；

初始温度：自然温度；

接种量：沤堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基的总质量的5-10％；

翻堆：将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到60～80℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8～12天，每隔48～72小时翻堆一次，使堆体温度保持在25～50℃；

具体地，放置接种后的堆沤发酵培养基用的发酵槽的底面设置塑胶地板，四壁材料采用用聚乙烯材质的硬质塑料板，方便进行机械化翻堆操作，根据实际生产空间，可以灵活调整发酵槽的数量、形状、大小，优化使用空间；

通气量：通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度≥35℃，通入0.4～0.6MPa的高压空气，通气量为每6～12小时通气每次10～20min；堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.4～0.6MPa的高压空气，通气量为每24～36小时通气5～10分钟；

发酵过程中通过输入高压空气的方法来提高堆体内部氧气含量，为菌体的生长、繁殖提供足量的氧气。发酵过程中好养，需要氧气维持其生命活动；通过打孔的方式调节堆体通气量，将带有通气管道的钢钎插入堆沤材料底部，通入0.4～0.6mpa的高压空气。

培养时间：7～12天。

(4)堆制产品干燥、粉化、计量、包装

堆体干燥温度为40～60℃，至堆体含水量为6～10％，将堆料粉碎，过2mm筛，检测后备用，其有效活菌数为2.3～23亿/g，纤维素酶活为300～1000U/g，蛋白质酶活为35～200U/g，水份为2～30％，pH为5.5～7.5，细度70～100％；利用包装设备进行计量、封包，即制成有机物料腐熟剂。

参照《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)中的条款要求：活菌数≥0.5亿/g、纤维素酶活≥30U/g、蛋白质酶活≥15、pH介于5-8之间、水分≤35％，有效期≥12个月，且无害化指标均能要求范围之内。使用时可根据作物类型及腐熟承担要求添加20～40％的膨润土作为填充料，适当调节各项指标，使其均能满足标准中的条款要求即可施用。

参照《农用微生物菌剂》(GB20287～2004)和《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)，采用平板计数法和三、五～二硝基水杨酸比色法测定发酵产物中的活菌数及其酶活进行测定。

参照《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)中的条款要求，有机物料腐熟剂的基本条件应满足：活菌数≥0.5亿/g、纤维素酶活≥30U/g、蛋白质酶活≥15、pH介于5-8之间、水分≤35％，有效期≥12个月，且无害化指标均能要求范围之内。根据《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)条款要求，对本专利设计到的重要指标进行检测，测定结果如下表所示：

试验结果显示，检测指标活菌数、蛋白质酶活、水分、细度、pH测定结果显示均能满足国家标准《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)的基本要求。

其中，组合二中的活菌总数最高，为4.380亿/克，且各单一菌种的活菌数菌大于0.1亿/克。考虑到本专利产品主要应用与农田废弃物处理，优先选择考虑纤维素酶活。由上表可以看出，组合二的纤维素酶活为801.6U/g，高于其他菌种组合。同时，组合二中蛋白质酶活为70.2U/g，说明以动物粪便为腐熟对象，本目标菌种组合制备而成的有机物料腐熟剂也具备优越的应用前景。

综上分析得出，组合二中的菌种组成为五个组合中的最佳菌种组合，其菌种组成分别是：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌。因此，选择最优菌种组合：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌等五种菌为本专利发明的优势菌种进行生产、包装，制备出一种有机物料腐熟剂。

其中，所述步骤B12、培养条件，具体为：

枯草芽孢杆菌的培养温度为30～40℃，培养时间为24～48h；优选地，培养温度为37℃，培养时间为24-36h；

地衣芽孢杆菌的培养温度为30～40℃，培养时间为24～48h；优选地，培养温度为37℃，培养时间为24-36h；

康氏木霉菌的培养温度为25～32℃，培养时间为72～96h；优选地，培养温度为28℃，培养时间为84-96h；

黄孢原毛平革菌的培养温度为35～42℃，培养时间为72～96h；优选地，培养温度为37℃，培养时间为80-96h；

嗜热侧孢霉菌的培养温度为38～50℃，培养时间为72～96h；优选地，培养温度为45℃，培养时间为84-96h；

侧孢芽孢杆菌的培养温度为28～35℃，培养时间为24～48h；优选地，培养温度为33℃，培养时间为36-48h；

嗜冷芽孢八叠球菌的培养温度为20～30℃，培养时间为24～48h；优选地，培养温度为27℃，培养时间为30-36h；

热纤维梭菌的培养温度为30～37℃，培养时间为24～48h。优选地，培养温度为35℃，培养时间为30-42h。

优选地，所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉和热纤维梭菌；所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉和热纤维梭菌五种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液。

更优选地，所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌；所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的沤堆发酵种子液的重量比的比例为2.0～2.5∶2.0～2.5∶1.0～2.0∶2.0～3.0∶2.0～3.0，上述五种菌的重量比的比例为优选为2∶2.5∶1∶2.5∶2。

进一步优选地，所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌和侧孢芽孢杆菌；所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌和侧孢芽孢杆菌六种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液。

更进一步优选地，所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌；所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌七种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液。

再进一步优选地，所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌、嗜冷芽孢八叠球菌；所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌和嗜冷芽孢八叠球菌七种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液。

优选地，所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌和嗜冷芽孢八叠球菌；所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌和嗜冷芽孢八叠球菌八种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液。

优选地，所述步骤B21的一级种子液制备工艺中，每种细菌的活菌数为90～115亿cfu/ml，真菌的活菌数为1～2亿cfu/ml。

其中，所述步骤B22的二级种子液制备中的枯草芽孢杆菌的固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸155～165份、谷壳45～55份、玉米粉35～45份、豆粕25～28份、蔗糖1.5～2份、磷酸二氢钾0.5～1份、七水硫酸镁0.5～1份、硫酸锰0.03～0.08份、石灰粉4.5～5份、水298份。

其中，所述步骤B22的二级种子液制备中的地衣芽孢杆菌的固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕16～18份、玉米粉45～50份、麦麸200～220份、酵母粉4.5～5.5份、磷酸二氢钾0.5～1份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.05～0.1份、碳酸钙12～14份、石灰粉5.5份、水300份。

其中，所述步骤B22的二级种子液制备中的康氏木霉菌的固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳105～115份、麦麸65～70份、硫酸铵4～5份、磷酸氢二钾1～1.5份、七水硫酸镁0.1～0.5份、无水氯化钙0.1～0.5份，水220份。

其中，所述步骤B22的二级种子液制备中的黄孢原毛平革菌的固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑240～280份、谷壳440～500份、麦麸80～160份、硫酸铵13～17份、磷酸氢二钾5～8份、七水硫酸镁0.5～0.8份、无水氯化钙0.6～1份、水200～210份。

其中，所述步骤B22的二级种子液制备中的嗜热侧孢霉菌的固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳160～170份、麦麸25～38份、硫酸铵3～4份、磷酸氢二钾1～1.5份、七水硫酸镁0.1～0.2份、无水氯化钙0.1～0.3份、水220份；

其中，所述C1中堆沤发酵培养基包括以下重量百分比的原料：木屑33～35％、稻草粉12～15％、谷壳20～25％、麸皮22～24％、蔗糖0.5～1％、硫酸铵3～5％、磷酸氢二钾0.3～0.5％、七水硫酸镁0.1～0.3％，自然Ph值、水料重量比为1∶1～2∶1。

本发明的有益效果是：(1)培养基采用的配方合理，营养丰富，能够满足菌种繁殖营养需要。

(2)本发明的菌种采用小鼠急性经口试验，并委托权威机构进行鉴定，确保选取的菌种无毒、无安全隐患，可以作为农业微生物核心菌种进行繁殖、使用，使用安全性高。

(3)培养基无需灭菌，直接生料发酵，生产工艺简洁、成本低廉、生产设备简单。

(4)采用本发明的制备工艺制得的有机物料腐熟剂的腐熟效果好，腐解时间短。

(5)根据田间试验应用可以看出，本发明的有机物料腐熟剂能有效改善土壤有机质含量、提高无机养分含量、促产增收。

(6)本方法制得的有机物料腐熟剂能显著提升作物产品，提高作物的经济收益，有利于大规模推广应用。

(7)本发明制得的有机物料腐熟剂其有效活菌数为2.3～23亿/g，纤维素酶活为300～1000U/g，蛋白质酶活为35～200U/g，比指标要求明显优于《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)的理化指标均(条款要求：有效活菌数≥0.5亿/g、纤维素酶活≥30U/g、蛋白质酶活≥15％等)，可以同时满足国家标准和农业部标准中对有机物料腐熟剂的条款要求。

具体实施方式

下面结合实施例1～8对本发明作进一步的说明。

实施例1。

一种有机物料腐熟剂的制备方法，它包括以下步骤。

(1)菌种选育

A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌组成一组菌种组合；

A2、菌种生物安全性鉴定：根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株。

(2)种子液制备

B1、斜面培养

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

枯草芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

地衣芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

康氏木霉菌斜面培养基-草粉60g/L，硫酸铵25g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，调节pH为6，加入琼脂15g/L，60℃加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌；

黄孢原毛平革菌斜面培养基-麦麸120g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖10g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌；

嗜热侧孢霉菌斜面培养基-去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸15min，用四层纱布过滤，加蔗糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用5ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件，具体为：

枯草芽孢杆菌的培养温度为30℃，培养时间为48h；

地衣芽孢杆菌的培养温度为30℃，培养时间为48h；

康氏木霉菌的培养温度为25℃，培养时间为96h；

黄孢原毛平革菌的培养温度为35℃，培养时间为96h；

嗜热侧孢霉菌的培养温度为38℃，培养时间为96h；

B2、种子液制备

B21、一级种子液制备：将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成五种均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为80亿cfu/ml，真菌的活菌数为0.5亿cfu/ml；分别储存于无菌钢制容器中，备用；

B22、二级种子液制备：

枯草芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸150份、谷壳40份、玉米粉30份、豆粕20份、蔗糖1份、磷酸二氢钾0.5份、七水硫酸镁0.5份、硫酸锰0.01份、石灰粉4份、水290份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为80亿cfu/ml的液体种子液，备用；

地衣芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕15份、玉米粉40份、麦麸200份、酵母粉4份、磷酸二氢钾0.5份、七水硫酸镁0.5份、硫酸锰0.5份、碳酸钙12份、石灰粉5份、水295份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80亿cfu/ml的液体种子液，备用；

康氏木霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳100份、麦麸60份、硫酸铵4份、磷酸氢二钾1份、七水硫酸镁0.1份、无水氯化钙0.1份，水200份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5亿cfu/ml的液体种子液，备用；

黄孢原毛平革菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑200份、谷壳400份、麦麸100份、硫酸铵10份、磷酸氢二钾5份、七水硫酸镁0.5份、无水氯化钙0.5份、水200份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜热侧孢霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳150份、麦麸20份、硫酸铵3份、磷酸氢二钾1份、七水硫酸镁0.1份、无水氯化钙0.1份、水200份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5亿cfu/ml的液体种子液，备用。

B23、沤堆发酵种子液制备

将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成沤堆发酵种子液，沤堆发酵种子液中活菌总数为20亿/ml；

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的二级种子液按照2∶2∶1∶2∶3的重量比的比例均匀混合配制沤堆发酵种子液；

(3)堆沤发酵

C1、堆沤发酵培养基

包括以下重量百分比的原料：木屑30％、稻草粉20％、谷壳25％、麸皮20％、蔗糖0.5％、硫酸铵4％、磷酸氢二钾0.4％、七水硫酸镁0.1％，自然pH值，水料重量比为1∶1：

C2、堆沤方法及初始培养条件

将上述堆沤发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的沤堆发酵种子液喷洒到堆料表面；沤堆发酵种子液与堆沤发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵；

C3、设置初始发酵条件

含水量：调节初始含水量为50％，含种子液；

初始pH值：自然pH值；

初始温度：自然温度；

接种量：沤堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基的5％；

翻堆：将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到60℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8～12天，每隔48小时翻堆一次，使堆体温度保持在50℃；

通气量：通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度≥35℃，通入0.4MPa的高压空气，通气量为每6小时通气每次20min；堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.4MPa的高压空气，通气量为每24小时通气10分钟；

培养时间：7天。

(4)堆制产品干燥、粉化、计量、包装

堆体干燥温度为40℃，至堆体含水量为10％，将堆料粉碎，过2mm筛，其有效活菌数为2.3亿/g，纤维素酶活为300U/g，蛋白质酶活为35U/g，水份为2％，pH为5.5，细度70％；利用包装设备进行计量、封包，即制成有机物料腐熟剂。

实施例2。

一种有机物料腐熟剂的制备方法，它包括以下步骤。

(1)菌种选育

A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌组成一组菌种组合；

A2、菌种生物安全性鉴定：根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株。

(2)种子液制备

B1、斜面培养

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

枯草芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

地衣芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

康氏木霉菌斜面培养基-草粉65g/L，硫酸铵30g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁1.5g/L，氯化钙0.15g/L，调节pH为6.5，加入琼脂15g/L，60℃加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌；

黄孢原毛平革菌斜面培养基-麦麸130g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖12g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌；

嗜热侧孢霉菌斜面培养基-去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸16min，用四层纱布过滤，加蔗糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用6ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件，具体为：

枯草芽孢杆菌的培养温度为35℃，培养时间为30h；

地衣芽孢杆菌的培养温度为35℃，培养时间为30h；

康氏木霉菌的培养温度为27℃，培养时间为80h；

黄孢原毛平革菌的培养温度为37℃，培养时间为84h；

嗜热侧孢霉菌的培养温度为40℃，培养时间为84h；

B2、种子液制备

B21、一级种子液制备：将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成五种均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为100亿cfu/ml，真菌的活菌数为1亿cfu/ml；分别储存于无菌钢制容器中，备用；

B22、二级种子液制备：

枯草芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸160份、谷壳45份、玉米粉35份、豆粕25份、蔗糖1.5份、磷酸二氢钾0.8份、七水硫酸镁0.9份、硫酸锰0.05份、石灰粉4.5份、水295份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为100亿cfu/ml的液体种子液，备用；

地衣芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕16份、玉米粉45份、麦麸220份、酵母粉4.5份、磷酸二氢钾0.8份、七水硫酸镁0.8份、硫酸锰0.9份、碳酸钙14份、石灰粉5.5份、水295份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为100亿cfu/ml的液体种子液，备用；

康氏木霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳110份、麦麸65份、硫酸铵4.5份、磷酸氢二钾1.5份、七水硫酸镁0.2份、无水氯化钙0.2份，水210份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为1亿cfu/ml的液体种子液，备用；

黄孢原毛平革菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑230份、谷壳450份、麦麸150份、硫酸铵15份、磷酸氢二钾7份、七水硫酸镁0.6份、无水氯化钙0.7份、水220份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为1亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜热侧孢霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳160份、麦麸24份、硫酸铵3.5份、磷酸氢二钾1.5份、七水硫酸镁0.15份、无水氯化钙0.15份、水220份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为1亿cfu/ml的液体种子液，备用。

B23、沤堆发酵种子液制备

将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成沤堆发酵种子液，沤堆发酵种子液中活菌总数为16亿/ml；

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的二级种子液按照2∶2.5∶1∶2∶2.5的重量比配制沤堆发酵种子液；

(3)堆沤发酵

C1、堆沤发酵培养基

包括以下重量百分比的原料：木屑31％、稻草粉18％、谷壳22％、麸皮25％、蔗糖0.6％、硫酸铵3％、磷酸氢二钾0.3％、七水硫酸镁0.1％，自然pH值，水料重量比为2∶1：

C2、堆沤方法及初始培养条件

将上述堆沤发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的沤堆发酵种子液喷洒到堆料表面；沤堆发酵种子液与堆沤发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵；

C3、设置初始发酵条件

含水量：调节初始含水量为55％，含种子液；

初始pH值：自然pH值；

初始温度：自然温度；

接种量：沤堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基的7％；

翻堆：将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到65℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8～12天，每隔54小时翻堆一次，使堆体温度保持在30℃；

通气量：通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度≥35℃，通入0.45MPa的高压空气，通气量为每8小时通气每次16min；堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.45MPa的高压空气，通气量为每30小时通气6分钟；

培养时间：8天。

(4)堆制产品干燥、粉化、计量、包装

堆体干燥温度为45℃，至堆体含水量为8％，将堆料粉碎，过2mm筛，即为半成品，其有效活菌数为8.1亿/g，纤维素酶活为450.8U/g，蛋白质酶活为90.2U/g，水份为10.5％，pH为6，细度80％；利用包装设备进行计量、封包，即制成有机物料腐熟剂。

实施例3。

一种有机物料腐熟剂的制备方法，它包括以下步骤。

(1)菌种选育

A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌组成一组菌种组合；

A2、菌种生物安全性鉴定：根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株。

(2)种子液制备

B1、斜面培养

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

枯草芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

地衣芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

康氏木霉菌斜面培养基-草粉70g/L，硫酸铵30g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1.8g/L，氯化钙0.2g/L，调节pH为6.5，加入琼脂15g/L，85℃加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌；

黄孢原毛平革菌斜面培养基-麦麸130g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖13g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌；

嗜热侧孢霉菌斜面培养基-去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸18min，用四层纱布过滤，加蔗糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用8ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于五种斜面培养基中，培养条件，具体为：

枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，培养时间为36h；

地衣芽孢杆菌的培养温度为37℃，培养时间为36h；

康氏木霉菌的培养温度为28℃，培养时间为84h；

黄孢原毛平革菌的培养温度为40℃，培养时间为80h；

嗜热侧孢霉菌的培养温度为45℃，培养时间为80h；

B2、种子液制备

B21、一级种子液制备：将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成五种均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为110亿cfu/ml，真菌的活菌数为2亿cfu/ml；分别储存于无菌钢制容器中，备用；

B22、二级种子液制备：

枯草芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸165份、谷壳50份、玉米粉40份、豆粕25份、蔗糖12份、磷酸二氢钾1份、七水硫酸镁1份、硫酸锰0.08份、石灰粉5份、水300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种3天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为110亿cfu/ml的液体种子液，备用；

地衣芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕18份、玉米粉50份、麦麸230份、酵母粉5份、磷酸二氢钾1份、七水硫酸镁1.2份、硫酸锰0.12份、碳酸钙15份、石灰粉6份、水300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为110亿cfu/ml的液体种子液，备用；

康氏木霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳110份、麦麸70份、硫酸铵5份、磷酸氢二钾1.8份、七水硫酸镁04份、无水氯化钙0.35份，水220份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为2亿cfu/ml的液体种子液，备用；

黄孢原毛平革菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑270份、谷壳500份、麦麸160份、硫酸铵16份、磷酸氢二钾8份、七水硫酸镁0.8份、无水氯化钙0.9份、水240份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为2亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜热侧孢霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳170份、麦麸30份、硫酸铵4份、磷酸氢二钾1.6份、七水硫酸镁0.17份、无水氯化钙0.2份、水220份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为2亿cfu/ml的液体种子液，备用。

B23、沤堆发酵种子液制备

将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成沤堆发酵种子液，沤堆发酵种子液中活菌总数为10亿/ml；

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的二级种子液按照2.5∶2∶1.5∶2∶2的重量比配制沤堆发酵种子液；

(3)堆沤发酵

C1、堆沤发酵培养基

包括以下重量百分比的原料：木屑34％、稻草粉16％、谷壳20％、麸皮24％、蔗糖0.8％、硫酸铵4.5％、磷酸氢二钾0.5％、七水硫酸镁0.2％，自然pH值，水料重量比为3∶1：

C2、堆沤方法及初始培养条件

将上述堆沤发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的沤堆发酵种子液喷洒到堆料表面；沤堆发酵种子液与堆沤发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵；

C3、设置初始发酵条件

含水量：调节初始含水量为60％，含种子液；

初始pH值：自然pH值；

初始温度：自然温度；

接种量：沤堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基的8％；

翻堆：将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到70℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8～12天，每隔60小时翻堆一次；使堆体温度保持在40℃；

通气量：通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度≥35℃，通入0.5MPa的高压空气，通气量为每10小时通气每次13min；堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.5MPa的高压空气，通气量为每36小时通气8分钟；

培养时间：10天。

(4)堆制产品干燥、粉化、计量、包装

堆体干燥温度为50℃，至堆体含水量为7％，将堆料粉碎，过2mm筛，其有效活菌数为13.8亿/g，纤维素酶活为805.1U/g，蛋白质酶活为145.6U/g，水份为21.5％，pH为7，细度70～100％；利用包装设备进行计量、封包，即制成有机物料腐熟剂。

实施例4。

一种有机物料腐熟剂的制备方法，它包括以下步骤。

(1)菌种选育

A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌组成一组菌种组合；

A2、菌种生物安全性鉴定：根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株。

(2)种子液制备

B1、斜面培养

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

枯草芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

地衣芽孢杆菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

康氏木霉菌斜面培养基-草粉80g/L，硫酸铵35g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁2g/L，氯化钙0.3g/L，调节pH为7，加入琼脂15g/L，100℃加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌；

黄孢原毛平革菌斜面培养基-麦麸140g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖15g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌；

嗜热侧孢霉菌斜面培养基-去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸20min，用四层纱布过滤，加蔗糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用10ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于五种斜面培养基中，培养条件，具体为：

枯草芽孢杆菌的培养温度为40℃，培养时间为24h；

地衣芽孢杆菌的培养温度为40℃，培养时间为24h；

康氏木霉菌的培养温度为32℃，培养时间为72h；

黄孢原毛平革菌的培养温度为42℃，培养时间为72h；

嗜热侧孢霉菌的培养温度为50℃，培养时间为72h；

B2、种子液制备

B21、一级种子液制备：将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成五种均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为120亿cfu/ml，真菌的活菌数为3亿cfu/ml；分别储存于无菌钢制容器中，备用；

B22、二级种子液制备：

枯草芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸170份、谷壳60份、玉米粉50份、豆粕30份、蔗糖3份、磷酸二氢钾1.5份、七水硫酸镁1.5份、硫酸锰0.1份、石灰粉6份、水300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种3天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

地衣芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕20份、玉米粉55份、麦麸240份、酵母粉6份、磷酸二氢钾1.5份、七水硫酸镁1.5份、硫酸锰0.15份、碳酸钙16份、石灰粉6份、水300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

康氏木霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳120份、麦麸80份、硫酸铵6份、磷酸氢二钾2份、七水硫酸镁0.5份、无水氯化钙0.5份，水230份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为3亿cfu/ml的液体种子液，备用；

黄孢原毛平革菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑300份、谷壳600份、麦麸200份、硫酸铵20份、磷酸氢二钾10份、七水硫酸镁1份、无水氯化钙1份、水250份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为3亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜热侧孢霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳180份、麦麸40份、硫酸铵5份、磷酸氢二钾2份、七水硫酸镁0.2份、无水氯化钙0.3份、水240份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为3亿cfu/ml的液体种子液，备用。

B23、沤堆发酵种子液制备

将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成沤堆发酵种子液，沤堆发酵种子液中活菌总数为12亿/ml；

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的二级种子液按照1∶1∶1∶1∶1的重量比配制沤堆发酵种子液；

(3)堆沤发酵

C1、堆沤发酵培养基

包括以下重量百分比的原料：木屑35％、稻草粉12％、谷壳24％、麸皮23％、蔗糖0.7％、硫酸铵4.5％、磷酸氢二钾0.5％、七水硫酸镁0.3％，自然pH值，水料重量比为4∶1：

C2、堆沤方法及初始培养条件

将上述堆沤发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的沤堆发酵种子液喷洒到堆料表面；沤堆发酵种子液与堆沤发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵；

C3、设置初始发酵条件

含水量：调节初始含水量为60％，含种子液；

初始pH值：自然pH值；

初始温度：自然温度；

接种量：沤堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基的10％；

翻堆：将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到80℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8～12天，每隔72小时翻堆一次，使堆体温度保持在45℃；

通气量：通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度≥35℃，通入0.6MPa的高压空气，通气量为每12小时通气每次10min；堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.6MPa的高压空气，通气量为每36小时通气5分钟；

培养时间：12天。

(4)堆制产品干燥、粉化、计量、包装

堆体干燥温度为60℃，至堆体含水量为6％，将堆料粉碎，过2mm筛，即为半成品，其有效活菌数为22.8亿/g，纤维素酶活为950.8U/g，蛋白质酶活为195.4U/g，水份为30％，pH为7.5，细度100％；利用包装设备进行计量、封包，即制成有机物料腐熟剂。

实施例5。

本实施例与实施例1的不同之处在于：A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、热纤维梭菌、嗜热侧孢霉菌组成一组菌种组合；

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

热纤维梭菌斜面培养基-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用5ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件，具体为：

热纤维梭菌的培养温度为35℃，培养时间为42h。

B22、二级种子液制备：

热纤维梭菌二级种子液制备：豆粕15份、玉米粉40份、麦麸200份、酵母粉5份、磷酸二氢钾1份、七水硫酸镁0.5份、硫酸锰0.1份、碳酸钙12份、石灰粉5份、水300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，装入密封袋，厌氧发酵；接种2天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为13亿cfu/ml的液体种子液，备用；

B23、沤堆发酵种子液制备

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、热纤维梭菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的二级种子液按照均等重量比均匀混合配制沤堆发酵种子液。

本实施例的其余部分与实施例1相同，这里不再赘述。

本实施例制得的有机物料腐熟剂，执行标准为《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)，其中有效活菌数为4.31亿/g、纤维素酶活为36.7U/g、pH值为6.2、细度为100％、蛋白质酶活为42.0U/g、水分3.6％，上述所有理化指标均能满足或者优于相关条款。

实施例6。

本实施例与实施例1的不同之处在于：A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌组成一组菌种组合；

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

侧孢芽孢杆菌-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用5ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件，具体为：

侧孢芽孢杆菌的培养温度为30℃，培养时间为48h；

B22、二级种子液制备：

侧孢芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸500份、玉米粉100份、豆粕60份、蔗糖5份、谷壳粉50份、磷酸氢二钾5份、七水硫酸镁3份、石灰30份，水800份。分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将侧孢芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80亿cfu/ml的液体种子液，备用；

B23、沤堆发酵种子液制备

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌和侧孢芽孢杆菌六种菌的二级种子液按照均等重量比均匀混合配制沤堆发酵种子液。

本实施例的其余部分与实施例2相同，这里不再赘述。

本实施例制得的有机物料腐熟剂，执行标准为《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)，其中有效活菌数为3.3亿/g、纤维素酶活为678.4U/g、pH值为5.8、细度为100％、蛋白质酶活为125.1U/g、水分3.5％，上述所有理化指标均能满足或者优于相关条款。

实施例7。

本实施例与实施例1的不同之处在于：A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、热纤维梭菌、侧孢芽孢杆菌组成一组菌种组合；

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

热纤维梭菌：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

侧孢芽孢杆菌-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用5ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件，具体为：

热纤维梭菌的培养温度为37℃，培养时间为24h；

侧孢芽孢杆菌的培养温度为35℃，培养时间为36h；

B22、二级种子液制备：

热纤维梭菌：豆粕18份、玉米粉50份、麦麸220份、酵母粉4份、磷酸二氢钾0.5份、七水硫酸镁0.5份、硫酸锰0.05份、碳酸钙12份、石灰粉6份、水300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，装入密封袋，厌氧发酵；接种2天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为10亿cfu/ml的液体种子液，备用；

侧孢芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸600份、玉米粉200份、豆粕100份、蔗糖10份、谷壳粉80份、磷酸氢二钾10份、七水硫酸镁5份、石灰50份，水1000份。分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将侧孢芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

B23、沤堆发酵种子液制备

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、热纤维梭菌、侧孢芽孢杆菌七种菌的二级种子液按照均等重量比均匀混合配制沤堆发酵种子液。

本实施例的其余部分与实施例3相同，这里不再赘述。

本实施例制得的有机物料腐熟剂，执行标准为《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)，其中有效活菌数为1.93亿/g、纤维素酶活为49.7U/g、pH值为6.4、细度为100％、蛋白质酶活为49.7U/g、水分3.8％。活菌数低于条款要求，其他理化指标均能满足或者优于相关条款。

实施例8。

本实施例与实施例1的不同之处在于：A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、嗜冷芽孢八叠球菌、热纤维梭菌、侧孢芽孢杆菌组成一组菌种组合；

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

嗜冷芽孢八叠球菌-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

热纤维梭菌：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

侧孢芽孢杆菌-牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

B12、斜面培养条件

将上述试管斜面培养的各个菌种分别用5ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件，具体为：

侧孢芽孢杆菌的培养温度为28℃，培养时间为24h；

嗜冷芽孢八叠球菌的培养温度为28℃，培养时间为24h；

热纤维梭菌的培养温度为35℃，培养时间为48h。

B22、二级种子液制备：

侧孢芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸500份、玉米粉150份、豆粕80份、蔗糖6份、谷壳粉60份、磷酸氢二钾6份、七水硫酸镁2份、石灰35份，水900份。分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将侧孢芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为100亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜冷芽孢八叠球菌：麸皮700份、谷壳100份、玉米粉50份、豆粕50份、硫酸镁1.0份、硫酸锰0.5份，石灰40份，水1000份。分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将嗜冷芽孢八叠球菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为110亿cfu/ml的液体种子液，备用；

热纤维梭菌：豆粕20份、玉米粉50份、麦麸200份、酵母粉4份、磷酸二氢钾1.5份、七水硫酸镁0.5份、硫酸锰0.05份、碳酸钙12份、石灰粉5份、水295份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述热纤维梭菌：一级种子液进行接种，装入密封袋，厌氧发酵；接种3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为16亿cfu/ml的液体种子液，备用；

B23、沤堆发酵种子液制备

将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、嗜冷芽孢八叠球菌、热纤维梭菌、侧孢芽孢杆菌八种菌的二级种子液按照均等重量比均匀混合配制沤堆发酵种子液。

本实施例的其余部分与实施例4相同，这里不再赘述。

本实施例制得的有机物料腐熟剂，执行标准为《有机物料腐熟剂》(NY609～2002)，其中有效活菌数为3.98亿/g、纤维素酶活为403.0U/g、pH值为5.9、细度为100％、蛋白质酶活为16.1U/g、水分3.4％。上述所有理化指标均能满足或者优于相关条款。

应用例1。

1.1水稻秸秆施用本发明有机物料腐熟剂小区试验总结

2010年11月10日～2010年11月30日于广东省韶关市新丰县农科所试验基地，对本发明的有机物料腐熟剂的腐熟效果进行测定。其中，土质为沙壤土，秸秆为金稻优368水稻秸秆。在水稻收割后，每小区筑田基，稻秆平铺于小区表面，浸有少量水，试验全程保持田间湿润。秸秆的颜色变化用目测法，腐熟度用拉力法测定。试验设置如下表1-1所示：

表1-1试验设置

1.2结果与分析

表1-2施用本发明有机物料腐熟剂后秸秆的变化情况

注：表中大写字母表示在0.01水平差异显著，小写字母表示在0.05水平差异显著(DMRT法)

秸秆颜色变化的变化时一个重要的评价指标，腐熟程度越高，颜色越深。随着试验时间的变化，各处理的拉力值菌逐渐下降。由表1-2看以看出，不同处理的颜色变化程度不一，其中处理一的的色差最明显，由初始青黄色变化为灰褐色；处理二次之，由初始青黄色变化为为褐色；处理三属于自然条件下腐熟，色差变化不明显。拉力的变化基本上与颜色的变化一致，拉力越小、腐熟度越高，是由于在腐熟过程中，微生物分解了秸秆中的的木质纤维素，降低了秸秆的致密程度，导致秸秆拉力下降。由表1-2看以看出，随着试验时间的变化，各处理的拉力值菌逐渐下降。试验初始值拉力均为6050g，随腐熟时间的变化，秸秆拉力值均有下降。在第20天时，处理一中秸秆拉力分别比处理二和对照处理降低了1080g和2930g，存在极显著差异。结果表明，施用本发明有机物料腐熟剂能加快水稻秸秆的腐熟。

1.3结论

施用本发明有机物料腐熟剂能加快水稻秸秆的腐熟，在施用后的第15天左右秸秆达到较好的腐熟效果。

应用例2。

2.12012年有机物料腐熟剂品种筛选试验总结

2012年5月10日～2012年8月17日于黑龙江农科院土壤肥料与资源环境研究所框载场进行，探索本发明有机物料腐熟剂在哈尔滨黑土上对玉米秸秆的腐熟效果进行评价。每个框的面积为2×2＝4m²。

试验设置两个处理，对照处理1：玉米秸秆不加腐熟剂；本发明处理2：玉米秸秆加本发明腐熟剂。选去粗细与长度的接近的玉米秸秆，将其切成约2cm小段，按照腐熟剂3kg/亩计算单位网袋面积的使用量。每个平行取40.00g烘干秸秆，0.38g腐熟剂，调节含水量为60％左右，将其充分混合。

2012年5月10日将处理后的尼龙袋埋入5～10cm土层。每个处理21次重复，分别在第10天、20天、30天、45天、60天、80天100天取样，每次随机取三个重复。采用烘干法测定秸秆失重率。

2.2结果分析

表2-1各时期秸秆残留量

由表2-1可以看出，玉米秸秆的腐熟随着时间的延伸其分解量增大。在整个分解期内呈现出前期分解快、后期分解慢的趋势。玉米秸秆还田初期至取样末期，施用有机物料腐熟剂处理的秸秆残留量均低于对照处理。由表2-2看以看出，秸秆还田10～30天期间，施用秸秆腐熟分解效率明显。在玉米还田20天时，施用有机物料腐熟剂处理的秸秆分解率为26.1％，较对照处理在1％和5％水平上有显著差异。

表2-2各时期秸秆生物量分解率方差表

注：大写字母表示在0.01水平差异显著，小写字母表示在0.05水平差异显著(DMRT法)

2.3结论

施用本发明有机物料腐熟剂能加速玉米秸秆腐熟，20天内分解效率最高。

应用例3。

3.1有机物料腐熟剂在水稻上的应用及其试验总结

2012年9月2日～2012年12月25日于海南省文昌市镇头苑蓝田村设置试验验证本发明有机物料腐熟剂在水稻秸秆直接还田模式中的腐熟效果及其对下季水稻种植的肥效验证的评价使用效果。

试验土壤属于潴育型水稻田，有机质2.15％、全氮(％)0.108、全磷(％)0.084、全钾(％)0.042、碱解氮38.5mg/kg、速效磷56.2mg/kg、速效钾20.2mg/kg。Ph值为5.54。供试有机物料腐熟剂为东莞市本发明有机物料腐熟剂，登记证号：微生物肥(2010)临字(1525)号。

试验设置为三个处理，每小区30平方米，处理随机排列，三次重复。试验处理如下所示：

对照处理1：无秸秆还田的常规肥料

对照处理2：常规肥料+秸秆还田(250kg/亩)

本发明处理3：常规肥料+秸秆还田(250kg/亩)+本发明有机物料腐熟剂

本季前茬作物为早稻，当季作物为玩稻天优2168。9月18日施底肥(磷肥15kg/亩，16～16～16国产复合肥10kg/亩。在小区盖水稻秸秆、撒腐熟剂(2kg/亩)、尿素(5kg/亩)，犁地。9月30日插秧，10月10日施分蘖肥(尿素6kg/亩)，11月2日施穗肥(16～16～16国产复合肥7.5kg)，12月25日收获、测产。

3.2结果分析

表3-1秸秆腐熟效果评价

由表3-1可以看出，对照处理2腐熟较慢，7天后在形态上才开始发生变化，15天后秸秆颜色黑黄、质地软、草臭味，仍未腐熟。处理3比处理2腐熟较快，2天后秸秆颜色开始变淡、10天后基本腐熟，15天后已经充分腐熟。在同等条件下，添加本发明有机物料腐熟剂比不添加腐熟剂的秸秆腐熟至少快5天。

表3-2产量与经济指标分析

注：水稻谷按照3.0kg/元。大写字母表示在0.01水平差异显著，小写字母表示在0.05水平差异显著(DMRT法)。

由表3-2可以看出，本发明有机物料腐熟剂处理比对照处理1和对照处理2的亩平均产量分别增加为33kg和9kg，产值增加99元和27元，处理间差异极显著。

3.3结论

在本实验条件下，本发明有机物料腐熟剂对秸秆直接还田有明显的加速腐熟分解作用，显著增加水稻产量和经济收入。

应用例4。

4.1水稻秸秆施用有机物料腐熟剂田间试验报告

2011年7月22日～2011年11月1日在广西钦州北区平吉镇古隆村进行田间试验验证本发明有机物料腐熟剂的应用效果。设置试验面积为724平方米，供试土壤为沙泥田，前作为水稻。

试验设置三个处理，每个处理三次重复，小区面积为30.6平方米，随机区组排列，试验设计如下：

对照处理一：常规施肥

对照处理二：常规施肥+秸秆还田(350kg/亩)

本发明处理三：常规施肥+秸秆还田(350kg/亩)+2kg/亩的本发明有机物料腐熟剂。

试验于2011年7月22日整地铺草、施基肥及试验处理，2011年7月23日插秧，2011年11月1日收获测产，单打称湿谷折晒干率。记录各时期的秸秆腐熟及水稻生物量的变化情况。

4.2结果分析

表4-1秸秆的性状描述

注：本发明处理三在第三天开始出现冒气泡现象，对照处理二在第五天开始冒气泡

由表4-1可以看出，本发明处理三比对照处理二颜色深黑、质地更软、腐臭气味更强烈，腐烂时间缩短3～4天。

表4-2不同处理对水稻的农艺性状

由表4-2可以看出，本发明处理三的千粒重分别对对照处理一和对照处理二增加了0.2g和0.3g，株高增加0.2cm和～0.3cm。

表4-3各处理验收产量统计表

对产量进行方差分析，结果如表4-4所示：

表4-4方差分析表

由表4-4得出，F值检验处理间差异达到显著水平(F＝6.61小于F0.05)。

表4-5产量与产值比较表

注：水稻价为2.4元/kg、腐熟剂按20元/亩计算。

由表4-5可以看出，施用本发明有机物料腐熟剂可达到增产、增收的效果，平均亩产量为485.1kg，亩增产14.5kg，增产率为3.1％，亩纯收入14.80元。

4.3结论

施用本发明有机物料腐熟剂能提早3～4天腐熟水稻秸秆，有一定的增产增值效果。

应用例5。

5.12012年有机物料腐熟剂筛选田间试验报告

2012年11月2日于四川省广汉市中江县仓山镇设置试验，对市场上17种有机物料腐熟剂的腐熟效果和增产效果进行筛选，编号分别为1号～17号，其中本发明有机物料腐熟剂为第17号测试样品。

油菜试验设3个处理，每个处理三次重复，完全随机排列，小区面积为32平方米。油菜采用育苗移栽，移栽密度为6000株/亩，施基肥。油菜成活后的第8天进行秸秆还田及撒播腐熟剂，保证秸秆重量基本一致，含水量为50～70％。每个重复的相同措施都保证在同一天内完成，小区设计内容如下：

处理一：对照设置，常规施肥，无秸秆还田

处理二：不腐熟剂秸秆还田，常规施肥+秸秆还田

处理三：常规施肥+秸秆还田+17号有机物料腐熟剂

在油菜生长期前后，多点取样测定土壤理化性状、秸秆腐熟程度记载与测定、油菜测产及其经济性状描述。

5.2结果分析

(1)土壤肥力变化

表5-1不同处理对土壤理化性质的影响

由表5-1可以看出，在稻田进行秸秆还田后，土壤容重和pH值有所下降，土壤有机质、全氮、全磷、速效磷、全钾、速效钾等养分含量均有所增加。处理二较处理一有机质平均增加0.89g/kg，全氮增加1.13g/kg。秸秆还田基础上施用17号有机物料腐熟剂。有机质较处理一和处理二分部增加2.22g/kg和1.33g/kg，增幅为6.68％和3.90％，全氮较处理一和处理二分部增加0.20g/kg和0.05g/kg。增幅为10.00％和2.33％。结果表明，借个还田基础上，使用17号有机物料腐熟剂，能够增强土壤保肥保水能力，并提高土壤非礼，增强微生物活力。

(2)对秸秆腐熟速度和程度的影响

表5-2各处理秸秆拉力比较(N)

由表5-2看出，随着水稻秸秆的腐解，水稻秸秆拉力值逐渐下降。处理二不施腐熟剂时，油菜收获时水稻秸秆的拉力值降低幅度为31.99％。较对照二，处理三能加速水稻秸秆的腐解，在油菜收获是，其拉力值为43.34，低于对照处理二17.84，降低；拉力值为38.86。田间观察结果于此结果相符合，其颜色更深、气味更加腐烂且有明显的菌丝出现。说明施用17号本发明有机物料腐熟剂能加速水稻秸秆腐熟。

(3)生物学性状

表5-3不同处理时间的油菜生物量

注：多重比较采用Duncan法，表中不同字母表是相互之间有差异。下同。

由表5-3看以看出，随着处理时间的延伸，各处理生物量逐渐增加，不同处理阶段，各处理间油菜生物量菌表现为处理三>处理二>处理一。至油菜收获时，处理二较处理一增加49.00g，增幅33.04％，处理三较处理二、处理一分别增加43.93％和91.48％，能够显著增加油菜生物量。

(4)对油菜农艺性状及其产量的影响

表5-4不同处理对油菜农艺性状及其产量的表现

注：表中小写字母表示在0.05水平差异显著(DMRT法)

由表5-4可以看出，较对照处理一，处理二和处理三均能在一定程度上增加油菜产量。仅秸秆还田条件下，较处理一可提高单株有效角果总数3.61％、每角荚粒数5.68％、千粒重1.33％，荚粒数和千粒重之间无显著性差异，产量较处理一增加3.81％。秸秆还田条件下，使用17号腐熟剂，较处理一可提高单株有效角果总数8.05％、每角荚粒数6.44％、千粒重2.40％，荚粒数和千粒重之间存在显著性差异。较处理二，分别增加4.29％、0.72％、1.05％，各处理间存在显著差异。在处理三条件下，油菜亩产182.81kg，较处理二和处理一分别增产6.63％和10.69，增产效果显著。

5.3结论

在中江县气候条件下，施肥水平等其他农事活动相同时，施用本发明有机物料腐熟剂能够加快秸秆的腐熟，提高秸秆腐解率，增强土壤肥力水平，对油菜的种植有增产增收作用。

本发明通过对有机物料腐熟剂的制备方法及田间效果进行描述，探讨了本专利有机物料腐熟剂的制备工艺和应用效果，得出了一种生产工艺简洁、完善、能耗低、无污染的有机物料腐熟剂的制备方法。

在此工艺基础之上，制备出了一种能显著缩短秸秆的腐解时间、提高土壤肥力、增产增收的安全的、高效的有机物料腐熟剂，是我国农业秸秆还田模式中的重要举措，为我国农业可持续发展做出重要的探索。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（1）菌种选育

A1、选菌种：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、热纤维梭菌和嗜冷芽孢八叠球菌中的五种或五种以上的菌种组成一组菌种组合；

A2、菌种生物安全性鉴定：根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株；

（2）种子液制备

B1、斜面培养

B11、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备

B12、斜面培养条件

将上述斜面培养的各个菌种分别用5～10ml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件为：培养温度为25～50℃，培养时间为24～96h；

B2、种子液制备

B21、一级种子液制备：将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为10～120亿cfu/ml，真菌的活菌数为0.5～3亿cfu/ml；分别储存于无菌钢制容器中，备用；

B22、二级种子液制备：将B21步骤得到的一级种子液分别接种于经121℃灭菌120min的专用固体培养基中进行单个菌种发酵，接种2-7天后采用平板计数法测定活菌数并用无菌水调节目标菌种的活菌数，制备成菌种单一的均匀菌悬液；制得二级种子液，备用；

B23、沤堆发酵种子液制备

将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成沤堆发酵种子液，沤堆发酵种子液中活菌总数为5-20亿/ml；具体地各菌种组合及其沤堆发酵种子液的配比为：

菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、黄孢原毛平革菌；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的沤堆发酵种子液的重量比的比例为2.0～2.5：2.0～2.5：1.0～2.0：2.0～3.0：2.0～3.0；

菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、黄孢原毛平革菌和侧孢芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、黄孢原毛平革菌和侧孢芽孢杆菌六种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液；

菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌七种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液；

菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌、嗜冷芽孢八叠球菌；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌和嗜冷芽孢八叠球菌七种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液；

菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌和嗜冷芽孢八叠球菌；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌和嗜冷芽孢八叠球菌八种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液；

（3）堆沤发酵

C1、堆沤发酵培养基

包括以下重量百分比的原料：木屑30～35%、稻草粉10～20%、谷壳15～25%、麸皮20～25%、蔗糖0.5～1%、硫酸铵3～5%、磷酸氢二钾0.3～0.5%、七水硫酸镁0.1～0.3%，自然pH值，水料重量比为1：1～4:1；

C2、堆沤方法及初始培养条件

将上述堆沤发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的沤堆发酵种子液喷洒到堆料表面；沤堆发酵种子液与堆沤发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵；

（4）堆制产品干燥、粉化、计量、包装

堆体干燥温度为40～60℃，至堆体含水量为6～10%，将堆料粉碎，过2mm筛，检测后备用，其有效活菌数为2.3～23亿/g，纤维素酶活为300～1000U/g，蛋白质酶活为35～200U/g，水份为2～30%，pH为5.5～7.5，细度70～100%；利用包装设备进行计量、封包，即制成的有机物料腐熟剂。

2.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B12、培养条件，具体为：

枯草芽孢杆菌的培养温度为30～40℃，培养时间为24～48h；

地衣芽孢杆菌的培养温度为30～40℃，培养时间为24～48h；

康氏木霉菌的培养温度为25～32℃，培养时间为72～96h；

黄孢原毛平革菌的培养温度为35～42℃，培养时间为72～96h；

嗜热侧孢霉菌的培养温度为38～50℃，培养时间为72～96h；

侧孢芽孢杆菌的培养温度为28～35℃，培养时间为24～48h；

嗜冷芽孢八叠球菌的培养温度为20～30℃，培养时间为24～48h；

热纤维梭菌的培养温度为30～37℃，培养时间为24～48h。

3.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉和热纤维梭菌；

所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉和热纤维梭菌五种菌按照均等重量比配制沤堆发酵种子液。

4.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A1、选菌种：菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌；

所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的沤堆发酵种子液的重量比的比例为2：2.5：1：2.5：2。

5.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B11中，菌种组合中各个菌种的斜面培养基配方及制备方法为：

枯草芽孢杆菌斜面培养基—牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

地衣芽孢杆菌斜面培养基—牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

康氏木霉菌斜面培养基—草粉60～80g/L，硫酸铵25～35g/L，磷酸二氢钾4～8g/L，硫酸镁1～2g/L，氯化钙0.1～0.3g/L，调节pH为6～7，加入琼脂15g/L，60～100℃加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌；

黄孢原毛平革菌斜面培养基—麦麸120～140g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖10～15g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌；

嗜热侧孢霉菌斜面培养基—去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸15～20min，用四层纱布过滤，加蔗糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L，灭菌；

侧孢芽孢杆菌斜面培养基—牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

嗜冷芽孢八叠球菌斜面培养基—牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌；

热纤维梭菌斜面培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌。

6.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B22、二级种子液制备中，

枯草芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸150～170份、谷壳40～60份、玉米粉30～50份、豆粕20～30份、蔗糖1～3份、磷酸二氢钾0.5～1.5份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.01～0.1份、石灰粉4～6份、水290～300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

地衣芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕15～20份、玉米粉40～55份、麦麸200～240份、酵母粉4～6份、磷酸二氢钾0.5～1.5份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.05～0.15份、碳酸钙12～16份、石灰粉5～6份、水295～300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

康氏木霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳100～120份、麦麸60～80份、硫酸铵4～6份、磷酸氢二钾1～2份、七水硫酸镁0.1～0.5份、无水氯化钙0.1～0.5份，水200～230份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5～6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5～3亿cfu/ml的液体种子液，备用；

黄孢原毛平革菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：木屑200～300份、谷壳400～600份、麦麸100～200份、硫酸铵10～20份、磷酸氢二钾5～10份、七水硫酸镁0.5～1份、无水氯化钙0.5～1份、水200～250份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5～6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为05～3亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜热侧孢霉菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：谷壳150～180份、麦麸20～40份、硫酸铵3～5份、磷酸氢二钾1～2份、七水硫酸镁0.1～0.2份、无水氯化钙0.1～0.3份、水200～240份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5～6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5～3亿cfu/ml的液体种子液，备用；

侧孢芽孢杆菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麦麸400～600份、玉米粉100~200份、豆粕60~100份、蔗糖5~10份、谷壳粉50~80份、磷酸氢二钾3~10份、七水硫酸镁1~5份、石灰30~50份，水800~1000份，分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将侧孢芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

嗜冷芽孢八叠球菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：麸皮700~800份、谷壳50~100份、玉米粉10~50份、豆粕10~50份、硫酸镁0.5~1.0份、硫酸锰0.1~0.5份，石灰40~60份，水1000~1100份，分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将嗜冷芽孢八叠球菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80～120亿cfu/ml的液体种子液，备用；

热纤维梭菌二级种子液制备：固体发酵培养基包括以下重量份的原料：豆粕15～20份、玉米粉40～55份、麦麸200～240份、酵母粉4～6份、磷酸二氢钾0.5～1.5份、七水硫酸镁0.5～1.5份、硫酸锰0.05～0.15份、碳酸钙12～16份、石灰粉5～6份、水295～300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述热纤维梭菌一级种子液进行接种，装入密封袋，厌氧发酵；接种2～3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为1～20亿cfu/ml的液体种子液，备用。

7.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于：所述堆沤发酵中步骤C2之后，还包括有步骤C3、设置初始发酵条件：

含水量：调节初始含水量为50～60%，含种子液；

初始pH值：自然pH值；

初始温度：自然温度；

接种量：沤堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基总重量的5-10%；

翻堆：将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到60～80℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8～12天，每隔48～72小时翻堆一次，使堆体温度保持在25～50℃；

通气量：通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度≥35℃，通入0.4～0.6MPa的高压空气，通气量为每6～12小时通气每次10～20min；堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.4～0.6MPa的高压空气，通气量为每24～36小时通气5～10分钟；

培养时间：7～12天。