CN103891710B - 一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用 - Google Patents

一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用 Download PDF

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Abstract

一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用，本发明涉及冻存液及其制备方法及该冻存液的应用。本发明要解决常规线虫甘油冻存液无法冷冻保种Oscheius tipulae线虫的问题。冻存液由琼脂胶、四氢呋喃和缓冲液组成；制备方法：一、制备缓冲液；二、制备琼脂胶；三、制备冻存液；该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。本发明冻存的Oscheius tipulae线虫解冻复苏后正常生长繁殖，保证了对野外捕获的Oscheius tipulae线虫进行室内培养的可持续性。本发明用于Oscheius tipulae线虫的冻存。

Description

一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用
技术领域
本发明涉及冻存液及其制备方法及该冻存液的应用。
背景技术
Oscheius tipulae为小杆科线虫，与秀丽隐杆线虫C.elegans具有相近的生态位和相似的生活型。发明人在野外捕获了Oscheius tipulae并在室内培养成功。大多数线虫在以甘油为主要成分的冻存液中，于-80℃可长期保存，在室温下复苏后可正常生长繁殖。但Oscheius tipulae在甘油冻存液中无法复苏，进一步研究发现甘油对Oscheius tipulae具有致命毒性。因此常规的甘油冻存液对Oscheius tipulae的长期保存不适用。
发明内容
本发明要解决常规线虫甘油冻存液无法冷冻保种Oscheius tipulae线虫的问题，而提供一种Oscheius tipulae线虫冻存液及其制备方法及该冻存液的应用。
一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由5%～15%的琼脂胶、10%～20%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成；
其中缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
所述琼脂胶的制备方法如下：
a、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
b、将琼脂加入步骤a制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为（0.02g～0.03g）∶10mL。
一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法，具体按以下步骤进行：
一、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶；
三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其中，按体积百分含量琼脂胶为5%～15%、四氢呋喃为10%～20%、余量为缓冲液。
上述冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
本发明制备出一种不含甘油的适用于Oscheius tipulae长期保持的冻存液，保证了Oscheius tipulae室内研究的可持续进行。
本发明的有益效果是：本发明解决了常规线虫甘油冻存液无法冷冻保种Oscheius tipulae线虫的问题。利用本发明的线虫冻存液可长期保种Oscheius tipulae线虫。本发明冻存的Oscheius tipulae线虫解冻复苏后正常生长繁殖，保证了对野外捕获的Oscheius tipulae线虫进行室内培养的可持续性。
本发明用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由5%～15%的琼脂胶、10%～20%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成；
其中缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
所述琼脂胶的制备方法如下：
a、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
b、将琼脂加入步骤a制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为（0.02g～0.03g）∶10mL。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由8%～11%的琼脂胶、12%～18%的四氢呋喃和余量为缓冲液 组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由6%的琼脂胶、11%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由13%的琼脂胶、19%的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法，具体按以下步骤进行：
一、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶；
三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其中，按体积百分含量琼脂胶为5%～15%、四氢呋喃为10%～20%、余量为缓冲液。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤二中琼脂与缓冲液的质量体积比为（0.02g～0.03g）∶10mL。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤三中按体积百分含量琼脂胶为10%。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式八：具体实施方式一所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是：该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存，具体操作如下：
A、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
B、取各发育阶段的Oscheius tipulae幼虫、成虫及虫卵，用步骤A制备的缓冲液清洗干净，然后放入具体实施方式一所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液中，再放入温度为-73℃～-80℃的冰箱中，完成Oscheius tipulae线虫的冻存。其它与具体实施方式八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八不同的是：步骤二中冰箱温度为-78℃。其它与具体实施方式八相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一： 
本实施例一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法，具体按以下步骤进行：
一、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.005g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
二、将琼脂加入步骤一制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为0.03g∶10mL；
三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其中，按体积百分含量琼脂胶为15%、四氢呋喃为20%、余量为缓冲液。
该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存，具体操作如下：
A、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.005g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
B、取各发育阶段的Oscheius tipulae幼虫、成虫及虫卵，用步骤A制备的缓冲液清洗干净，然后放入本实施例所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液中，再放入温度为-80℃的冰箱中，完成Oscheius tipulae线虫的冻存。
本实施例冻存的Oscheius tipulae线虫解冻复苏后正常生长繁殖，保证了对野外捕获的Oscheius tipulae线虫进行室内培养的可持续性。

Claims (9)

1.一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheius tipulae线虫冻存液按体积百分含量由5％～15％的琼脂胶、10％～20％的四氢呋喃和余量为缓冲液组成；
其中缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
所述琼脂胶的制备方法如下：
a、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
b、将琼脂加入步骤a制备的缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶，其中，琼脂与缓冲液的质量体积比为(0.02g～0.03g)∶10mL。
2.根据权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheiustipulae线虫冻存液按体积百分含量由8％～11％的琼脂胶、12％～18％的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。
3.根据权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheiustipulae线虫冻存液按体积百分含量由6％的琼脂胶、11％的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。
4.根据权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其特征在于一种Oscheiustipulae线虫冻存液按体积百分含量由13％的琼脂胶、19％的四氢呋喃和余量为缓冲液组成。
5.如权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法，其特征在于具体按以下步骤进行：
一、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
二、将琼脂加入步骤一制备的部分缓冲液中，封口膜密封后放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，再室温冷却凝固得琼脂胶；
三、将步骤二得到的琼脂胶研碎，再加入步骤一制备的剩余缓冲液，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，得到一种Oscheius tipulae线虫冻存液，其中，按体积百分含量琼脂胶为5％～15％、四氢呋喃为10％～20％、余量为缓冲液。
6.根据权利要求5所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的制备方法，其特征在于步骤三中按体积百分含量琼脂胶为10％。
7.如权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的应用，其特征在于该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存。
8.根据权利要求7所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的应用，其特征在于该冻存液用于Oscheius tipulae线虫的冻存，具体操作如下：
A、将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl和MgSO4加入蒸馏水中，配制成缓冲液，再放入高压蒸汽灭菌锅中，控制温度为120℃，灭菌20min，其中，缓冲液中KH2PO4的浓度为0.003g/mL、Na2HPO4的浓度为0.006g/mL、NaCl的浓度为0.004g/mL～0.006g/mL、MgSO4的浓度为0.001g/mL；
B、取各发育阶段的Oscheius tipulae幼虫、成虫及虫卵，用步骤A制备的缓冲液清洗干净，然后放入权利要求1所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液中，再放入温度为-73℃～-80℃的冰箱中，完成Oscheius tipulae线虫的冻存。
9.根据权利要求8所述的一种Oscheius tipulae线虫冻存液的应用，其特征在于步骤B中冰箱温度为-78℃。
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