CN105850983B - 一种冻存液及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冻存液及其用途，本发明的冻存液含有体积百分含量为5％‑25％的甘油，2％‑10％的二甲基亚砜，45％‑65％的S Buffer，余量为去离子水。本发明的冻存液在甘油和S Buffer体系中首次加入一定浓度配比的二甲基亚砜，在保存秀丽隐杆线虫时，线虫的存活率和反复冻融后的复苏率显著提高，极高的复苏率有效地保证了后续实验研究的进行，同时能够反复冻存使用的线虫在一定程度上降低了线虫培养保存的成本，极大地提高了冻存线虫的利用率；本发明的冻存液保存秀丽隐杆线虫，方法简单，效果显著，无需液氮，节约了成本。

Description

一种冻存液及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于保存秀丽隐杆线虫的冻存液。
背景技术
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为生命科学研究的经典模式生物，近年来一直活跃于生命科学研究的各个领域，其属于线形动物门、小杆亚纲、小杆目、小杆总科。雌雄同体虫可产卵约300个，卵孵出幼虫，经4次蜕皮发育为成虫，该成虫只有959个体细胞，而雄虫有1031个体细胞。秀丽隐杆线虫基因组测序也于2002年10月完成，准确率达99％，剩下1％的缺口。由于秀丽隐杆线虫基因组序列高达40％与人类同源，为科学家研究基因组的功能提供了一个强有力的工具。
秀丽隐杆线虫在生命科学领域扮演着重要的角色，但是目前有关秀丽隐杆线虫的培养和保存方面的报道并不多。国内外文献报道的冻存方法效果普遍不佳或比较繁琐，或需要液氮保存，费用昂贵；实际生产中常用的冻存液为浓度10％-30％的甘油，配方单一且不确定，线虫复苏效率较低，不可反复冻存使用等缺陷，给生产和实验研究带来诸多影响和不确定性。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种冻存液。
本发明采用的技术方案：一种冻存液，其特征在于，含有体积百分含量为5％-25％的甘油，2％-10％的二甲基亚砜，45％-65％的S Buffer，余量为去离子水。
优选的是，所述的冻存液含有体积百分含量为15％的甘油，8％的二甲基亚砜，55％的S Buffer。
一种冻存液的用途，其特征在于，所述冻存液用于保存秀丽隐杆线虫，所述冻存液含有体积百分含量为5％-25％的甘油，2％-10％的二甲基亚砜，45％-65％的S Buffer，余量为去离子水。
优选的是，所述冻存液含有体积百分含量为15％的甘油，8％的二甲基亚砜，55％的S Buffer。
其中，所述冻存液保存秀丽隐杆线虫的温度为-80℃。
一种秀丽隐杆线虫的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，在培养有秀丽隐杆线虫的培养基上，切取多个等份，分别接种于相同等份的NGM培养基上，虫体面朝下；
S2，将S1获得的虫体置于生化培养箱中培养；
S3，用M9Buffer洗下S2培养后的虫体，静置；
S4，将S3洗下的虫体置于冻存液中保存，所述冻存液含有体积百分含量为5％-25％的甘油，2％-10％的二甲基亚砜，45％-65％的S Buffer，余量为去离子水。
其中，所述S1中切取的份数为四等份，分别接种于4份NGM培养基上。
其中，所述S2中的培养温度为20℃，培养时间为96h。
其中，所述S4中的保存温度为-80℃。
其中，所述S4中的冻存液含有体积百分含量为15％的甘油，8％的二甲基亚砜，55％的S Buffer。
本发明实现的有益效果是，本发明的冻存液在甘油和S Buffer体系中加入二甲基亚砜，在保存秀丽隐杆线虫时，线虫的存活率和反复冻融后的复苏率显著提高，尤其在甘油体积百分含量为15％，二甲基亚砜的体积百分含量为8％，S Buffer的体积百分含量为55％时，其存活率达到94.86％，复苏率达到43.85％，极高的复苏率有效地保证了后续实验研究的进行，同时能够反复冻存使用的线虫在一定程度上降低了线虫培养保存的成本，极大地提高了冻存线虫的利用率；本发明的冻存液保存秀丽隐杆线虫，方法简单，无需液氮，节约了成本。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为秀丽隐杆线虫在A4B4C3与A3B4C3两种不同配比保存下的复苏结果比较图；
图2为秀丽隐杆线虫在A3B4C3冻存液与现有冻存液保存下的存活结果比较图；
图3为秀丽隐杆线虫在A3B4C3冻存液与现有冻存液保存下的复苏结果比较图。
具体实施方式
1.虫种和菌株
N2野生型秀丽隐杆线虫(C.elegans，N2)和OP50尿嘧啶突变型大肠杆菌，均由陕西师范大学孙燕副教授惠赠。
2.试剂
NGM培养基:每份培养基含有NaCl 0.3g，蛋白胨0.25g，1mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH＝6.0)2.5mL，胆固醇乙醇溶液(5mg/mL)0.1mL，1mol/L MgSO40.1mL，1mol/LCaCl20.1mL。
NGM培养基的制备方法:取NaCl 0.3g，蛋白胨0.25g，1mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH＝6.0)2.5mL，加水定容至100mL，高压灭菌后，待培养液降温至60℃时，加入胆固醇乙醇溶液(5mg/mL)0.1mL，1mol/L MgSO40.1mL，1mol/L CaCl20.1mL，快速混匀，于4℃下保存。
LB培养液:2单位质量的胰蛋白胨，1单位质量的酵母提取物和2单位质量的NaCl构成的溶液，溶液pH为7.4。
S Buffer：6.45×10-3mol/L的K2HPO4，4.355×10-2mol/L的KH2PO4，0.1mol/L的NaCl构成的溶液。
M9Buffer：0.042mol/L的Na2HPO4，0.022mol/L的KH2PO4，0.085mol/L的NaCl，0.01mol/L的MgSO4构成的溶液。
本文献中所提到的NGM培养基，LB培养液，S Buffer和M9Buffer皆为上述的NGM培养基，LB培养液，S Buffer和M9Buffer。
3.实施例
甘油体积百分含量分别为5％、10％、15％、20％，25％；二甲基亚砜体积百分含量分别为2％、4％、6％、8％，10％；S Buffer体积百分含量分别为45％，50％，55％，60％，65％，设计试验方案如表1、表2所示。
表1：因素位级
表2L25(53)正交试验方案
冻存实验：在培养至第96h的含秀丽隐杆线虫的NGM培养基上，用手术刀切取四等份胶块，分别接种于4份NGM培养基上，虫体面朝下，置于20℃生化培养箱中培养96h后，用1mL M9Buffer从NGM培养基洗下虫体，静置；用表2所示不同配比的冻存液分别保存虫体，每种冻存液各保存3份，于-80℃条件下保存；统一保存3个月后，38℃水浴快速解冻，静置20min，吸取全部沉淀部分，接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基中，分别计算虫体存活率，结果如表3。
表3不同配比下的冻存液保存虫体的存活率比较
由表3可知，A3B4C3冻存液为最优组合。即甘油15％、二甲基亚砜8％、S Buffer55％。由R值可以看出，RA>RB>RC，甘油和二甲基亚砜浓度对秀丽隐杆线虫存活率影响较大。
由于试验设计的组合并没有出现理论得出的A3B4C3的冻存液配方组合，因此将其与试验中线虫存活率最高的8号组合进行三重复比较试验，结果如图1，从图1中可知A3B4C3组合的线虫存活率较高，并具有统计差异(“***”代表P<0.001)；最终确定最优的冻存液组合：甘油15％、二甲基亚砜8％、S Buffer 55％。
在确定最优冻存液组合的前提下，在培养至第96h的含秀丽隐杆线虫的NGM培养基上，用手术刀切取四等份胶块，分别接种于4份NGM培养基上，虫体面朝下，置于20℃生化培养箱中培养96h后，用1mL M9Buffer从NGM培养基洗下虫体，分别使用最优配比冻存液、WormBook经典冻存液(15％甘油+85％S Buffer)、30％甘油+70％S Buffer、50mL/L甘油+LB培养液于-80℃条件下保存虫体，每种冻存液各保存3份。统一保存3个月后，38℃水浴快速解冻，静置20min后，吸取全部沉淀部分，接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基中，分别计算虫体存活率并进行比较。
如图2，甘油15％+二甲基亚砜8％+55％S Buffer(A)保存的秀丽隐杆线虫冻存后复苏率达到94.86％；30％甘油+70％S Buffer(B)保存的秀丽隐杆线虫冻存后复苏率为64.66％，15％甘油+85％S Buffer(C)保存的秀丽隐杆线虫冻存后复苏率达到55.63％；50mL/L甘油+LB培养液(D)保存的秀丽隐杆线虫冻存后复苏率达到70.16％，研究中发现A保存的线虫存活率最高，较其他三组具有极显著差异。
在确定最优冻存液配方的前提下，在培养至第96h的含秀丽隐杆线虫的NGM平板上，用手术刀切取四等份胶块，分别接种于4份NGM培养基上，虫体面朝下，置于20℃生化培养箱中培养96h后，用1mL M9Buffer从NGM培养基洗下虫体，分别使用最优配比冻存液、WormBook经典冻存液(15％甘油+85％S Buffer)、30％甘油+70％S Buffer、50mL/L甘油+LB培养液于-80℃条件下保存虫体，每种冻存液各保存3份。统一保存3个月后，38℃水浴快速解冻，再次放入-80℃冰箱，一周后取出，38℃水浴快速解冻，吸取全部沉淀部分，接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基中，分别计算虫体存活率并进行比较。
如图3，甘油15％+二甲基亚砜8％+55％S Buffer(A)保存的秀丽隐杆线虫反复冻存后复苏率达到43.85％；30％甘油+70％S Buffer(B)保存的秀丽隐杆线虫反复冻存后复苏率为6.32％；15％甘油+85％S Buffer(C)保存的秀丽隐杆线虫反复冻存后复苏率达到6.96％；50mL/L甘油+LB培养液(D)保存的秀丽隐杆线虫反复冻存后复苏率达到4.16％，研究中发现A保存的线虫复苏率最高，较其他三组具有极显著差异，B，C和D保存的线虫在反复冻融后复苏率过低，已难以进行后续实验研究。
本发明还进行了主体间效应检测分析，分析结果如表4。从表4中可知，冻存液中加入的二甲基亚砜对线虫复苏率的影响具有显著差异，也从统计学角度更加精准地解释了冻存体系中增加一定浓度的二甲基亚砜后提高秀丽隐杆线虫存活率的原因。
表4主体间效应的检验

Claims (3)

1.一种冻存液，其特征在于，所述冻存液含有体积百分含量为15％的甘油，8％的二甲基亚砜，55％的S Buffer；余量为去离子水。
2.一种冻存液的用途，其特征在于，所述冻存液用于保存秀丽隐杆线虫，所述冻存液含有体积百分含量为15％的甘油，8％的二甲基亚砜，55％的S Buffer；余量为去离子水；
所述冻存液保存秀丽隐杆线虫的温度为-80℃。
3.一种秀丽隐杆线虫的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，在培养有秀丽隐杆线虫的培养基上，切取多个等份，分别接种于相同等份的NGM培养基上，虫体面朝下；
S2，将S1获得的虫体置于生化培养箱中培养；
S3，洗下S2培养后的虫体，静置；
S4，将S3洗下的虫体置于冻存液中保存，所述冻存液含有体积百分含量为15％的甘油，8％的二甲基亚砜，55％的S Buffer；余量为去离子水；
所述S1中切取的份数为四等份，分别接种于4份NGM培养基上；
所述S2中的培养温度为20℃，培养时间为96h；
所述S4中的保存温度为-80℃。
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