CN103882073B

CN103882073B - 一种大环内酯类化合物的制备方法与作为海洋防污剂的应用

Info

Publication number: CN103882073B
Application number: CN201410102957.7A
Authority: CN
Inventors: 王长云; 邵长伦; 刘庆艾; 王开玲
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: CN103882073A

Abstract

一种大环内酯类化合物的制备方法与作为海洋防污剂的应用，制备时先在菌种培养基中对真菌Cochliobolus lunatus(TA26‑46)进行菌种培养，再在发酵培养基中对上述真菌进行发酵培养；将所得发酵物以甲醇浸泡，减压浓缩后得甲醇粗提物；将甲醇粗提物悬浮于水中，经乙酸乙酯萃取减压浓缩后得乙酸乙酯相浸膏；对乙酸乙酯相浸膏进行色谱分离，得到上述十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物。本发明提供一种海洋生物防污剂，其特征在于以本发明的十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物或其盐作为有效成分，用于防治藤壶附着引起的海洋生物污损。

Description

一种大环内酯类化合物的制备方法与作为海洋防污剂的应用

技术领域

本发明涉及一种十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物的制备方法与作为海洋防污剂的应用。

背景技术

海洋生物污损是指海洋污损生物如藤壶、贻贝、苔藓虫等的幼虫在船体、鱼箱、油井等海洋设施或其它海洋生物表面附着生长而形成群落，从而对被附着物造成巨大损害，如加速金属腐蚀、降低海洋设施性能、影响水产养殖业产量和质量等。仅以美国海军军舰为例，每年在这方面的经济损失在18到26亿美元之间，而美国海军军舰数量仅占全球船舶数量的0.5％，因此海洋生物污损是极其严重的自然危害。在海洋污损生物中，藤壶是分布最广、危害最大的一类。自2008年全球禁止了有毒防污剂有机锡的使用后，寻找安全高效的海洋防污剂成为国际上急需解决的课题。海洋高盐、高压、低温、寡营养、低光照等特殊环境使海洋微生物能够产生大量结构新颖、活性独特的次级代谢产物，其中有些化合物具有防污损活性；且海洋微生物可以大规模发酵，不受资源限制，为寻找潜在的海洋防污剂提供了重要来源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物的制备方法与作为海洋防污剂的应用，它能满足现有技术的上述需求。菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年01月09日；保藏编号：CGMCC8698；分类命名：Cochliobolus lunatus。

一种式I结构的十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物或其盐：

式I中R₁、R₄、R₆、R₇为H，R₂、R₃为OH，R₅为羰基，R₆、R₇间为反式双键；或R₁、R₂、R₄、R₆、R₇为H，R₃为OH，R₅为α-OH，R₆、R₇间为反式双键；或R₁、R₄、R₆、R₇为H，R₂、R₃为OH，R₅为羰基，R₆、R₇间为顺式双键。

式I化合物选自下列化合物：

本发明提供一种式I化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：先在菌种培养基中对真菌C.lunatus(TA26-46)进行菌种培养，再在发酵培养基中对上述真菌进行发酵培养；将所得发酵物以甲醇浸泡2-6次，减压浓缩后得甲醇粗提物；将甲醇粗提物悬浮于水中，经乙酸乙酯萃取减压浓缩后得乙酸乙酯相浸膏；对乙酸乙酯相浸膏进行色谱分离，得到式I化合物。其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水，发酵培养基中含有大米、粗海盐、蛋白胨、水；所述的色谱分离为正相硅胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

上述制备方法中菌种培养基优选含有葡萄糖0.1％-5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.01％-2％、蛋白胨0.01％-2％、琼脂0.1％-3.0％、粗海盐0.05％-5％，其余为水，培养温度优选为5-45℃，培养时间优选为3-15天；发酵培养基优选大米固体培养基，每1000mL的锥形瓶中，加入大米50-200g、粗海盐0.1-5 g、蛋白胨0.1-2g、水50-200mL，培养温度优选为5-45℃，培养时间优选为 7-40天；所述的正相硅胶柱色谱分离中采用的固定相优选为200-300目硅胶，流动相优选为0-100％(体积百分比)的乙酸乙酯-石油醚以及0-100％(体积百分比)的甲醇-乙酸乙酯混合溶剂；高效液相色谱分离中采用的色谱柱优选为ODS C18柱(Kromasil，7μm，150×7.8mm)，流动相优选为45％-65％(体积百分比) 的甲醇-水混合溶剂。

本发明提供一种海洋生物防污剂，其特征在于以式I化合物或其盐作为有效成分，用于防治藤壶附着引起的海洋生物污损。

本发明的式I化合物或其盐对藤壶幼虫附着具有强抑制作用，而对其毒性较小，可用于开发环境友好型天然海洋生物防污剂，并且原料可以通过真菌发酵进行大规模生产，不受资源限制，因此应用前景广阔。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

(1)海洋真菌C.lunatus(TA26-46)菌种的培养

真菌C.lunatus(TA26-46)的菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.2％、琼脂1.0％、粗海盐3％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在28℃下培养5天。

(2)海洋真菌C.lunatus(TA26-46)的发酵

真菌C.lunatus(TA26-46)的发酵培养所用的发酵培养基为大米固体培养基，每1000mL的锥形瓶中，加入大米100g、粗海盐3g、蛋白胨0.6g、水 100mL。真菌菌株于28℃培养28天。

(3)本发明式I化合物的分离提取

取步骤(2)所得发酵物以甲醇浸泡3次，减压浓缩后得甲醇提取物，将甲醇提取物悬浮于500mL水中，用乙酸乙酯1500mL萃取3次，减压浓缩得乙酸乙酯相浸膏；先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200-300目硅胶，流动相：0-100％(体积百分比)的乙酸乙酯-石油醚以及0-100％(体积百分比)的甲醇-乙酸乙酯混合溶剂，然后进行高效液相色谱分离，固定相：ODS C18柱 (Kromasil，7μm，150×7.8mm)，流动相：45％-65％(体积百分比)的甲醇-水混合溶剂，分离得到3个白色无定型粉末(化合物1-3)，即为式I化合物。

所得式I化合物的结构确证数据：

(7′E)-6′-oxozeaenol(1)白色无定型粉末；[α]²⁵ _D -50(c0.20，MeOH)；CD(0.83mM，MeOH)λ_max(Δε)235(+12.61)，273(-6.34)， 316(-1.07)，350(+0.04)nm；¹H NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ10.36(1H，s， 2-OH)，6.81(1H，ddd，J=15.7，8.7，6.2Hz，H-8′)，6.49(1H，d，J=15.7Hz，H-7′)， 6.45(1H，d，J=2.3Hz，H-5)，6.32(1H，d，J＝2.3Hz，H-3)，6.27(1H，d，J＝15.7 Hz，H-1′)，6.17(1H，ddd，J=15.7，10.4，3.1Hz，H-2′)，5.17(1H，d，J=5.1Hz， 5′-OH)，5.13(1H，m，H-10′)，4.99(1H，d，J=5.7Hz，4′-OH)，4.32(1H，dd，J=5.1，4.0Hz，H-5′)，4.02(1H，m，H-4′)，3.74(3H，s，4-OCH₃)，2.58(1H，ddd，J=14.4， 6.2，2.8Hz，Ha-9′)，2.44(1H，ddd，J=14.4，8.7，6.6Hz，Hb-9′)，2.36(1H，m， Ha-3′)，2.15(1H，m，Hb-3′)，1.35(3H，d，J=6.0Hz，H-11′)；¹³C NMR(DMSO-d₆， 125MHz)δ200.7(C，C-6′)，168.2(C，C-12′)，161.3(C，C-4)，157.8(C，C-2)， 142.4(CH，C-8′)，138.3(C，C-6)，130.5(CH，C-2′)，130.3(CH，C-7′)，128.6(CH， C-1′)，111.6(C，C-1)，102.6(CH，C-5)，100.1(CH，C-3)，78.2(CH，C-5′)，71.9 (CH，C-4′)，70.2(CH，C-10′)，55.3(CH₃，4-0CH₃)，37.9(CH₂，C-9′)，36.0(CH₂， C-3′)，20.1(CH₃，C-11′)；ESIMSm／z385.1[M+Na]⁺，747.2[2M+Na]⁺.

Deoxy-aigialomycin C(2)白色无定型粉末；¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ11.80(1H，s，2-OH)，7.08(1H，d，J＝16.0Hz，H-1′)， 6.51(1H，d，J=2.4Hz，H-5)，6.36(1H，d，J=2.4Hz，H-3)，6.11(1H，dt，J=16.0， 5.1Hz，H-2′)，5.90(1H，m，H-8′)，5.53(1H，m，H-7′)，5.50(1H，m，H-10′)，3.84 (1H，t，J＝8.5Hz，H-6′)，3.80(3H，s，4-OCH3)，3.49(1H，t，J=7.8Hz，H-5′)，2.53 (H，m，H-9′a)，2.45-2.30(3H，m，H-3′／9′b)，2.04(1H，t，J＝12.4Hz，H-4′)，1.58 (1H，m，H-4′)，1.37(3H，d，J=6.5Hz，H-11′)；¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ 171.1(C，C-12′)，165.1(C，C-2)，163.8(C，C-4)，142.6(C，C-6)，134.1(CH，C-7′)， 132.2(CH，C-2′)，129.8(CH，C-1′)，128.5(CH，C-8′)，106.6(CH，C-5)，104.0(C， C-1)，99.8(CH，C-3)，72.9(CH，C-5′)，71.4(CH，C-10′)，55.3(CH₃，4-OCH₃)，37.3 (CH₂，C-9′)，30.7(CH₂，C-4′)，27.0(CH2，C-3′)，18.5(CH₃，C-11′)；ESIMSm／z 349.2[M+H]⁺，371.1[M+Na]⁺，719.4[2M+Na]⁺。

LL-Z1640-2(3)白色无定型粉末；CD(2.21mM， MeOH)λ_max(Δε)216(+12.62)，247(+7.22)，272(-13.60)，343(+0.71)nm；¹H NMR(CDCl₃，600MHz)δ：12.14(1H，s，2-OH)，6.87(1H，dd，J=15.3，1.1Hz， H-1′)，6.40(1H，d，J=2.5Hz，H-5)，6.38(1H，d，J＝2.5Hz，H-3)，6.33(1H，dd，J =11.4，2.6Hz，H-7′)，6.21(1H，td，J=11.4，2.6Hz，H-8′)，5.98(1H，ddd，J=15.3， 10.7，4.1Hz，H-2′)，5.24(1H，dqd，J=12.1，6.0，2.2Hz，H-10′)，4.52(1H，brs，H-5′)，3.99(1H，dt，J=5.1，2.5Hz，H-4′)，3.80(3H，s，4-OCH₃)，3.57(1H，dt，J= 17.2，11.3Hz，Ha-9′)，2.51(1H，ddd，J=17.2，5.2，2.6Hz，Hb-9′)，2.21(1H，m， Ha-3′)，2.12(1H，m，Hb-3′)，1.47(3H，d，J=6.0Hz，H-11′)；ESIMS m／z385.1[M +Na]⁺。

实施例2

(1)海洋真菌C.lunatus(TA26-46)菌种的培养

菌种培养基含有葡萄糖0.1％-5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.01％-2％、蛋白胨0.01％-2％、琼脂0.1％-3.0％、粗海盐0.05％-5％，其余为水，培养温度为5-45℃，培养时间为3-15天。

(2)海洋真菌C.lunatus(TA26-46)的发酵

发酵培养基为大米固体培养基，每1000mL的锥形瓶中，加入大米50-200 g、粗海盐0.1-5g、蛋白胨0.1-2g、水50-200mL，培养温度为5-45℃，培养时间为7-40天。

(3)本发明式I化合物的分离提取

取步骤(2)所得发酵物以甲醇浸泡2-6次，减压浓缩后得甲醇提取物，将甲醇提取物悬浮于200-1000mL水中，用乙酸乙酯600-3000mL萃取2-6 次，减压浓缩得乙酸乙酯相浸膏；先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200-300 目硅胶，流动相：0-100％(体积百分比)的乙酸乙酯-石油醚以及0-100％(体积百分比)的甲醇-乙酸乙酯混合溶剂，然后进行高效液相色谱分离，固定相：ODS C18柱(Kromasil，7μm，150×7.8mm)，流动相：45％-65％(体积百分比)的甲醇-水混合溶剂，分离得到3个白色无定型粉末(化合物1-3)，即为式I化合物。其中式I化合物的结构确证数据与实施例1中相应数据一致。

实施例1-2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、高效液相色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。

实施例3

在菌种培养基中对海洋真菌C.lunatus(TA26-46)进行菌种培养，再在发酵培养基中对上述海洋真菌进行发酵培养，将所得发酵物以甲醇浸泡，减压浓缩后得甲醇提取物，将甲醇提取物悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得乙酸乙酯相浸膏；将乙酸乙酯相浸膏进行色谱分离后得到3个白色无定型粉末 (化合物1-3)，即为式I化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致。其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水，所述发酵培养基中含有大米、粗海盐、蛋白胨、水；所述的色谱分离为正相硅胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

为了探索更广泛的适用于制备本发明式I化合物的方法，本实施例中菌种培养基、发酵培养基中各成分的添加，均按本领域中常规比例添加或按任意比例添加，色谱分离时所用硅胶的规格、色谱柱的型号及洗脱溶剂的选择，均为本领域的常规选择。实验结果表明，上述常规选择的制备方法，均能得到发明的3个白色无定型粉末，即式I化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致，仅仅存在个别化合物在纯度及收率方面的微小差异。

实施例1-3的结果表明，按照本领域常规的菌种培养、发酵条件，常规的正相硅胶柱色谱分离、高效液相色谱分离的条件对海洋真菌C.lunatus (TA26-46)进行菌种培养、发酵、分离纯化，均能得到本发明式I结构的化合物。本发明式I化合物的制备方法，优选实施例1-2中记载的方法。

实施例4

本发明的式I化合物对藤壶Balanus amphitrite幼虫附着抑制活性试验按照如下文献方法测试：Thiyagarajan V.；Harder T.；Qiu J.W.；Qian P.Y.Mar Biol (Berl)2003，143，543-554。通过抑制藤壶B.amphitrite幼虫附着活性测试，发现本发明的化合物1-3具有较强的抑制藤壶幼虫附着活性，且对其毒性较小。其中，半数有效浓度(EC₅₀)分别为18.1、22.5、1.82μg／mL，其半数致死浓度(LC₅₀)均大于50μg／mL，表明对藤壶幼虫附着的抑制活性高，而对藤壶幼虫的毒性低，具有高效低毒的特点。

本发明提供一种海洋生物防污剂，其特征在于以式I十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物或其盐作为有效成分，用于防治藤壶附着引起的海洋生物污损，且原料可以通过真菌发酵进行大规模生产，不受资源限制，因此应用前景广阔。

Claims

1.一种式I结构的十四元二羟基苯甲酸大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：先在菌种培养基中对真菌Cochliobolus lunatus TA26-46进行菌种培养，再在发酵培养基中对上述真菌进行发酵培养；将所得发酵物以甲醇浸泡2-6次，减压浓缩后得甲醇粗提物；将甲醇粗提物悬浮于水中，经乙酸乙酯萃取减压浓缩后得乙酸乙酯相浸膏；对乙酸乙酯相浸膏进行色谱分离，得到式I化合物；

其中式I化合物结构为：R₁、R₄、R₆、R₇为H，R₂、R₃为OH，R₅为羰基，R₆、R₇间为反式双键；或R₁、R₂、R₄、R₆、R₇为H，R₃为OH，R₅为α-OH，R₆、R₇间为反式双键；其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水；所述的发酵培养基中含有大米、粗海盐、蛋白胨、水；所述的色谱分离为正相硅胶柱色谱分离和高效液相色谱分离；所述真菌Cochliobolus lunatus TA26-46的保藏编号为CGMCC8698。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的菌种培养基含有葡萄糖0.1％-5.0％、酵母膏0.01％-2％、蛋白胨0.01％-2％、琼脂0.1％-3.0％、粗海盐0.05％-5％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比；培养温度为5-45℃，培养时间为3-15天。

3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基为大米固体培养基，每1000mL的锥形瓶中，加入大米50-200g、粗海盐0.1-5g、蛋白胨0.1-2g、水50-200mL，培养温度为5-45℃，培养时间为7-40天。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的正相硅胶柱色谱分离中采用的固定相为200～300目硅胶，流动相为0-100％的乙酸乙酯-石油醚以及0-100％的甲醇-乙酸乙酯混合溶剂；所述的高效液相色谱分离中采用的色谱柱为ODS C18柱Kromasil，7μm，150×7.8mm，流动相为45％-65％的甲醇-水混合溶剂；上述混合溶剂百分比均为体积百分比。