CN103865915B - 一种氧化亚铁硫杆菌固定化载体及其固定化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化亚铁硫杆菌固定化载体及其固定化方法和应用。所述载体为纱布,其固定化方法包括将纱布剪成边长0.9~1.1cm的碎片,用蒸馏水洗净碎片后烘干,填充到反应器中,进行直接紫外线灭菌;再加入9K培养基,并接入氧化亚铁硫杆菌Z1菌液;采用吸附法,将接种过的反应器于30℃恒温条件下操作,同时对反应器中的溶液进行曝气,氧化亚铁硫杆菌Z1大量生长并吸附在纱布表面;待反应器成功运行48h后,去除培养基,得到固定氧化亚铁硫杆菌的纱布载体。同时,本发明公开了其在生物氧化中的应用。本发明所提出的氧化亚铁硫杆菌固定化方法及其应用具有成本低、操作简单、无二次污染、利用大规模应用及生物氧化速率快等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物固定领域,具体涉及一种氧化亚铁硫杆菌固定化载体及其固定化方法和应用。
背景技术
氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans简称A.f)是由Temple、Colmer等于20世纪50年代初发现并命名的。该菌系短杆状,嗜酸性化能自养菌,专性好氧,最佳生长pH值为2~2.5,最佳生长温度28~35,由于它能以氧化Fe2+、元素S和金属硫化物等来获得生命过程中所需的能量,并以O2作为最终电子受体,所以广泛应用于生物冶金、生物脱硫和含硫废水的处理等领域。但是,该菌存在生长缓慢,代谢周期长,细胞得率低等缺陷,使其工业化应用大大受到了限制。为实现快速、连续反应,并增强反应的稳定性,细菌的固定化很重要。大多数生物反应器如生物滤池、生物滴滤池等是以在载体表面形成的生物膜作为工作介质的,因此固定化载体的选择及载体挂膜是大规模应用A.f菌的重要环节之一。
在最近几年,细胞固定化技术发展迅速并成功应用到实际工程领域。具体到固定化氧化亚铁硫杆菌,不同的固定化方法和载体已经被广泛研究。例如,像利用吸附进行固定化的材料有交换离子树脂、沙粒、活性炭、壳聚糖粉末、玻璃粉、贫矿石和镍合金纤维等;而利用包埋法进行固定化的材料有聚乙烯醇凝胶、海藻酸钙、聚亚安酯泡沫、琼脂、卡拉胶和珍珠岩等。比较以上两种固定化方法,吸附法有着表面积小和生物膜容易脱落等局限。同样,包埋法有着氧扩散慢、机械强度和耐受性较弱等缺点,而且大部分高分子聚合物对细菌有着一定的毒性。另外,目前研究的关于氧化亚铁硫杆菌固定化方法中最高序批式氧化亚铁速率仅仅为0.5g/(L·h)。低氧化亚铁速率限制了A.f菌的实际工程应用。
发明内容
本发明克服了上述缺陷,提供一种氧化亚铁硫杆菌固定化载体及其固定化方法和应用。该方法便捷操作,实现了氧化亚铁硫杆菌的连续化生产,以及可以用来研究氧化亚铁固定化的生物氧化效果,为其他微生物固定化的规模化和规范化应用提供依据。
本发明中所使用的氧化亚铁硫杆菌Z1为中国专利CN201310100105.X中记载的氧化亚铁硫杆菌Z1,所述氧化亚铁硫杆菌Z1是从广东云浮某硫铁矿山的酸性废水中分离纯化所得,该菌株是氧化亚铁硫杆菌Z1(AcidithiobacillusferrooxidansstrainZ1),由中国典型培养物保藏中心保藏,简称CCTCC,保藏号为CCTCCNO:M2013102,保藏日期为2013年3月25日,保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该菌在TSMI固体培养基上呈现单菌落。菌落为圆形、中部突起、红棕色。光学显微镜下观察该菌的形态为杆状,宽度和长度分别约为0.53μm和2.2μm,具有运动性,生长对数期为18~30h。生物学特征为:革兰氏染色阴性,专性好氧,嗜酸性。
本发明采用网状结构的纱布作为固定化载体材料同时结合相应的反应器保护细胞不受外界不利条件(如酸、碱、有害离子等)的影响,也不影响传质、营养物质的供给和产物的导出,同时保持菌种高活性,且可反复利用。
本发明中氧化亚铁在固定化过程中利用生物氧化来获得生长所需要的能量,从而实现在菌种持续生长的过程中亚铁离子的生物氧化。
一种氧化亚铁硫杆菌固定化载体,所述载体为纱布,其经线密度和纬线密度分别为11根/厘米和9根/厘米。
本发明所提供的氧化亚铁硫杆菌固定化载体的固定化方法,具体包括下述步骤:
(1)将纱布剪成边长为0.9~1.1cm的碎片,用蒸馏水洗净碎片后烘干备用;所述纱布的经线密度和纬线密度分别为11根/厘米和9根/厘米;
(2)将步骤(1)中所述纱布填充到反应器中,进行直接紫外线灭菌;
(3)向反应器内加入400~500mL的9K培养基,并按9%~11%的接种量接入45~55mL的氧化亚铁硫杆菌Z1菌液,所述9K培养基的配比为:(NH4)2SO43g/L,KCl0.1g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,Ca(NO3)20.01g/L,FeSO4·7H2O44.3g/L,pH值为2;
(4)采用吸附法,将接种过的反应器于30℃恒温条件下进行操作,同时对反应器中的溶液进行曝气,曝气量为0.5~2L/min,氧化亚铁硫杆菌Z1大量生长并吸附在纱布表面;
(5)待反应器成功运行48h后,去除培养基,得到固定氧化亚铁硫杆菌的纱布载体。
优选地,步骤(2)中的所述反应器为自制的实验装置系统,采用耐酸有机玻璃制成,反应器呈圆柱体,直径5cm,高30cm,有效体积500mL,设有曝气装置,底部设有排水口。
优选地,步骤(2)中的所述纱布投加质量为10~30g。
优选地,步骤(3)中的所述氧化亚铁硫杆菌Z1由中国典型培养物保藏中心保藏,简称CCTCC,保藏号为CCTCCM2013102,保藏日期为2013年3月25日。
优选地,步骤(3)中的所述氧化亚铁硫杆菌Z1是从广东云浮某硫铁矿山的酸性废水中分离纯化所得,接种菌液菌浓度为1.7×107个/mL。
优选地,步骤(5)中的所述去除培养基的方式为重力脱水,即为打开反应器排水口直至无水滴流出。
本发明还提供了一种上述的固定氧化亚铁硫杆菌的纱布载体在生物氧化中的应用。
上述应用具体操作步骤为:将所述的固定化氧化亚铁硫杆菌的纱布继续放入反应器中,再加入400~500mL的9K培养基,在曝气量为0.5~2L/min,恒温30℃的条件下启动反应器。
对于上述应用的长期效果,可以按以上步骤进行:待反应器运行24h后,去除培养基,重新投加400~500mL9K培养基,以相同的条件继续运行反应器。如此反复操作。
本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果:
(1)纱布为一种新型的固定化氧化亚铁硫杆菌载体,采用吸附法成功固定化氧化亚铁硫杆菌,该方法具有操作条件温和,成本低,效果好,无二次污染等优点,具有良好的实际工程应用前景和商业前景;
(2)通过稳定、连续的处理方式,固定化的氧化亚铁硫杆菌成功应用到生物氧化过程中,这种方式的优势在于,能够保证氧化亚铁硫杆菌足够的数量和活性,解决了目前氧化亚铁硫杆菌生物氧化速率低下的技术问题。
(3)在曝气量1L/min、恒温30℃下,反应器中纱布固定化氧化亚铁硫杆菌的平均亚铁氧化速率和最快亚铁氧化速率分别达到0.55g/(Lh)和0.92g/(Lh)。
附图说明
图1为实施例1中反应器的示意图,其中1为生物反应器,2为溶液储罐,3为储水池,4为空气泵,5为恒温水浴锅,6为气体流量计,7为阀门。
图2为实施例1中投加不同载体的溶液中pH值与时间的变化曲线图。
图3为实施例1中投加不同载体的亚铁离子浓度与时间的变化曲线图。
图4为实施例1中投加不同载体的总铁浓度与时间的变化曲线图。
图5为实施例2中两种不同脱水方式处理后溶液中亚铁离子浓度的的变化曲线图。
图6表示实施例3中不同批次下反应器内溶液的亚铁氧化率的对比图。
图7a~图7c表示实施例3中固定化前的纱布载体的SEM图,其中图7a为100倍,图7b为5000倍,图7c为30000倍。
图8a~图8c表示实施例3中固定化后的纱布载体的SEM图,其中图8a为100倍,图8b为5000倍,图8c为30000倍。
图9a~图9c表示实施例3中一次生物氧化后的纱布载体的SEM图,其中图9a为100倍,图9b为5000倍,图9c为30000倍。
图10a~图10c表示实施例3中十次生物氧化后的纱布载体的SEM图,其中图10a为100倍,图10b为5000倍,图10c为30000倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述,但本发明的实施方式不限于此,对于未特别注明的工艺参数,可参照常规技术进行。
实施例1
不同载体对氧化亚铁硫杆菌的影响:
将15g不同载体:纱布、活性炭、沸石分别投加到三个相同的反应器(图1)内,反应器内已经添加450mL9K培养基同50mL活化好的氧化亚铁硫杆菌Z1的菌液,在恒温30℃和曝气量1L/min的条件下启动反应器,同时设置一组空白组(不添加载体,其他条件一致),通过观察反应器内溶液的颜色变化和测量溶液pH值、亚铁离子同总铁浓度、载体上的单位生物量等指标来比较不同载体对氧化亚铁硫杆菌的影响。
结果如图2、图3、图4和表1所示,从图2、图3和图4中可以看出投加不同载体的溶液中pH值、亚铁离子浓度和总铁浓度的变化趋势比较接近,图2中pH值都是先经历一段缓慢上升的过程后快速的下降;图3中亚铁离子浓度在开始阶段缓慢下降,24h后快速降低直至浓度接近于零;图4中总铁浓度变化趋势同亚铁离子浓度的相近,先经历一段缓慢下降后快速降低。具体比较不同载体的情况,以纱布作为载体的溶液亚铁氧化速率最快,其亚铁离子氧化率在48h时就接近达到100%。从表1中可以看出,在48h后沸石、活性炭、纱布三种载体都有很高的生物量,分别为6.0482nmolP/g,3.8753nmolP/g和7.8063nmolP/g,此外,只有纱布载体的溶液比较清澈。
本实例说明沸石、活性炭和纱布都能作为氧化亚铁硫杆菌Z1的固定化载体,但是其中以纱布的效果最好,其在固定化菌种Z1的过程中达到最多的单位生物量和最快的亚铁氧化速率。
表1实施例1中投加不同载体的溶液中颜色和单位生物量的情况
实施例2
纱布固定化氧化亚铁硫杆菌的生物活性
准备两份纱布固定氧化亚铁硫杆菌,具体固定化方法如实施例1所述,当48h固定化完成后,将样品收集并进行如下处理:一份样品进行离心脱水(4000r/min速率下离心10min),另一份样品进行重力脱水(移至漏斗中直至没有水滴流出)。处理完的样品再投加到两个已添加500mL9K培养基的反应器内,在1L/min曝气量和30℃恒温下启动反应器。间隔一段时间测量溶液中亚铁离子浓度,观察纱布固定化氧化亚铁硫杆菌的生物活性。
由图5可知,重力脱水和离心脱水处理的溶液起始亚铁离子浓度分别为6.76和7.66g/L。随着反应器的运行,两种脱水方式下的溶液亚铁离子浓度都快速下降,经过一段时间的反应,重力脱水处理的溶液在12h时达到97.04%的氧化速率,离心脱水处理的在16h时达到98.56%的氧化速率。说明重力脱水处理的纱布固定化氧化亚铁硫杆菌具有更高的生物活性。同时经过计算,重力脱水的溶液的平均亚铁氧化速率和最快亚铁氧化速率分别达到0.55g/(Lh)和0.92g/(Lh),远远高于目前文献报道中最快的亚铁氧化速率0.5gFe2+/(Lh);而离心脱水的溶液的最快亚铁氧化速率仅仅为0.59g/(Lh)。
本实施例说明纱布固定化氧化亚铁硫杆菌具有极佳的生物活性,不同的脱水方式会影响到氧化亚铁硫杆菌的生物活性,在重力脱水的处理下,纱布固定化氧化亚铁硫杆菌具有最佳的生物活性,平均亚铁氧化速率和最快亚铁氧化速率分别达到0.55g/(Lh)和0.92g/(Lh)。
实施例3
纱布固定化氧化亚铁硫杆菌长期性能
将已固定氧化亚铁硫杆菌的纱布载体投加到已添加500mL9K培养基的反应器中,在1L/min曝气量和30℃恒温下启动反应器。每隔24h更换一次培养基。在每次更换培养基前测量亚铁氧化率。同时,对实施例3中不同时期的纱布载体(固定化前,固定化后、长期运行后)进行SEM分析。
结果如图6和图7a~图10c所示。可以看出,在不同的批次中亚铁氧化率都保持在一个很高的水平(97.83%以上)。SEM分析结果表明,纱布由一簇簇纤维团构成,呈网状结构。单个纤维表面光滑,表面积大,在固定化前呈圆柱形(参见图7a~图7c);在不同时期,纱布都维持很好的网状结构;随着运行时间的推移,纱布载体上附着的物质越来越多,在高倍镜下可以看出,这些物质主要是氧化亚铁硫杆菌和反应生成的沉淀(参见图8a~图10c)。
本实施例说明固定化氧化亚铁硫杆菌纱布在长期操作下依旧具有很高的生物活性,纱布可以作为氧化亚铁硫杆菌固定化的载体,能较好地保持稳定性和固定化效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种氧化亚铁硫杆菌固定化载体对氧化亚铁硫杆菌进行固定化的方法,其特征在于,所述载体为纱布,其经线密度和纬线密度分别为11根/厘米和9根/厘米;包括如下步骤:
(1)将纱布剪成边长为0.9~1.1cm的碎片,用蒸馏水洗净碎片后烘干备用;
(2)将步骤(1)中所述纱布填充到反应器中,直接进行紫外线灭菌;
(3)向反应器内加入400~500mL的9K培养基,并按9%~11%的接种量接入45~55mL的氧化亚铁硫杆菌Z1菌液,所述9K培养基的配比为:(NH4)2SO43g/L,KCl0.1g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,Ca(NO3)20.01g/L,FeSO4·7H2O44.3g/L,pH值为2;
(4)采用吸附法,将接种过的反应器于30℃恒温条件下进行操作,同时对反应器中的溶液进行曝气,曝气量为0.5~2L/min,氧化亚铁硫杆菌Z1大量生长并吸附在纱布表面;
(5)待反应器成功运行48h后,去除培养基,得到固定氧化亚铁硫杆菌的纱布载体;
步骤(3)中的所述氧化亚铁硫杆菌Z1由中国典型培养物保藏中心保藏,简称CCTCC,保藏号为CCTCCNO:M2013102,保藏日期为2013年3月25日;
步骤(5)中的所述去除培养基的方式为重力脱水,即为打开反应器排水口直至无水滴流出。
2.根据权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌固定化载体对氧化亚铁硫杆菌进行固定化的方法,其特征在于,步骤(2)中的所述反应器采用耐酸有机玻璃制成,反应器呈圆柱体,直径5cm,高30cm,有效体积500mL,设有曝气装置,底部设有排水口。
3.根据权利要求1所述氧化亚铁硫杆菌固定化载体对氧化亚铁硫杆菌进行固定化的方法,其特征在于,步骤(2)中的所述纱布投加质量为10~30g。
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