CN103864910B

CN103864910B - 一种新型特异结合lps的贝类模式识别受体lrrp

Info

Publication number: CN103864910B
Application number: CN201410075253.5A
Authority: CN
Inventors: 张扬; 张跃环; 李军; 喻子牛
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2014-03-03
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-03-03
Also published as: CN103864910A

Abstract

本发明公开了一种新型特异结合LPS的贝类模式识别受体LRRP。贝类模式识别受体LRRP，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明首次从太平洋牡蛎中分离出富含亮氨酸重复蛋白（Leucine-rich？repeat？protein,LRRP），可以特异的识别LPS，从而激发后续的免疫反应的新型贝类模式识别受体LRRP。本发明中的LRRP在贝类免疫识别中发挥中重要的作用，监控体内的革兰氏阴性菌的侵入状况，为贝类的抗病育种提供了重要的理论与实践依据。

Description

一种新型特异结合LPS的贝类模式识别受体LRRP

技术领域：

本发明属于贝类免疫识别和免疫防御的分子机理领域，具体涉及一种新型特异结合LPS的贝类模式识别受体LRRP。

背景技术：

贝类在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，是世界上最重要经济类群之一，并具有巨大的发展潜力。太平洋牡蛎（Crassostreagigas），是软体动物门，双壳纲，珍珠贝目，牡蛎科动物，是一种重要的海洋生物资源，为全球性分布种类。然而，良种匮乏导致牡蛎免疫能力低下，疾病爆发，甚至出现大规模死亡，是制约产业发展的主要瓶颈。

在贝类免疫反应中，病原微生物的保守结构比如脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）等，可以作为模式识别分子（pattern-recognitionmolecule，PRM）被宿主所识别，继而激发宿主的免疫防御反应。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新型贝类模式识别受体LRRP。

本发明的新型贝类模式识别受体LRRP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明还提供了一种编码上述新型贝类模式识别受体LRRP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种含有新型贝类模式识别受体LRRP的基因的原核表达载体。

所述的原核表达载体可以为表达载体pGEX-4T-1。

一种含有含有新型贝类模式识别受体LRRP的基因的原核表达载体的细菌。

所述的细菌可以为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了新型贝类模式识别受体LRRP在制备特异识别脂多糖的药物中的应用。

本发明首次从太平洋牡蛎中分离出富含亮氨酸重复蛋白（Leucine-richrepeatprotein,LRRP），可以特异的识别LPS，从而激发后续的免疫反应的新型贝类模式识别受体LRRP。本发明中的LRRP在贝类免疫识别中发挥中重要的作用，监控体内的革兰氏阴性菌的侵入状况，为贝类的抗病育种提供了重要的理论与实践依据。

附图说明：

图1.表达和纯化的贝类模式识别受体LRRP重组蛋白

M：蛋白Marker；Lane1：重组表达蛋白GST-LRRP（贝类模式识别受体LRRP重组蛋白）；Lane2：纯化后的GST-LRRP（贝类模式识别受体LRRP重组蛋白），箭头指示重组表达的目的蛋白GST-LRRP；

图2.ELISA分析重组蛋白对多种PRMs的结合能力，表明贝类模式识别受体LRRP可以特异的识别LPS。

注：OD，光密度值；LPS，脂多糖；PGN，肽聚糖；Glucan，葡聚糖；LTA，脂磷壁酸；Laminarin，昆布多糖。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、RNA提取

总RNA的提取使用Trizol(Invitorgen)提取，具体步骤如下：（1）取50mg太平洋牡蛎组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有1mlTrizol的离心管中，吹打、混匀；（2）加入200μL氯仿，剧烈震荡40s，室温放置5min；（3）4℃，12,000×g离心10min，吸取上清转移至新管；（4）加入0.5ml的异丙醇，混匀，-80℃沉淀过夜；（5）4℃，12,000×g离心10min，弃上清；（6）75%乙醇wash两次沉淀；（7）弃上清，加入100μLDEPC水溶解RNA。

2.cDNA文库构建和cDNA全长的获得

1）全长cDNA文库构建使用SMARTcDNAlibraryconstructionKit（Clontech），具体步骤如下：（1）利用步骤1的RNA，使用MMLV合成cDNA第一条链；（2）使用LDPCR扩增cDNA；（3）蛋白酶K消化并纯化cDNA产物；（4）Sfil消化，使用ChromaSpin400进行产物大小分离；（5）连接cDNA至λTripEx2载体，经λ噬菌体包装后，转化至宿主细胞中；（6）检测cDNA文库滴度。

2）从牡蛎转录组获得LRRP的EST序列；（3）根据EST序列，设计用于RACE扩增的引物（FirstPCR引物：

LRRPF1:5’-AGTAAATGTGCCGTGTGTGGGGAGT-3’;

LRRPR1:5’-GACCTCCTCTTCTTGTACTGAATGGAC-3’;

NestPCR引物:

LRRPF2:5’-TGCGGGCTTTACTCTGTTCTTATCG-3’;

LRRPR2:5’-GTAATGCACAGATTTCCACGGGTAG-3’），并进行3’RACE和5’RACE反应；（4）再克隆至pGEM-TEasy载体（promega)，进行测序；（5）拼接RACE和EST序列，获取全长cDNA序列，该全长cDNA序列含有一个开放阅读框，该开放阅读框的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，含有1059个碱基，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，含有352个氨基酸，命名为贝类模式识别受体LRRP的基因。

3.原核表达载体构建

（1）设计一对涵盖贝类模式识别受体LRRPORF的引物（LRRPF3:5’-CGGGATCCATGGCGGACACTATGCTTGTTCG-3’;LRRPR3:5’-GCCTCGAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTCGA-3’），引物的两端分别加入BamH-I和Xho-I位点和保护碱基；（2）使用这对引物进行PCR扩增（总PCR反应体系为50μl，其中包括H₂O38.5μL,10×buffer（含Mg^2＋）5μL，dNTP（10mM/L）1μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板cDNA1μL，ExTaq酶0.5μL；反应条件为：94℃2min，（94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec）35个循环，72℃10min）；（3）PCR产物和pGEX-4T-1载体分别使用BamH-I和Xho-I进行双酶切，并回收纯化酶切产物；（4）连接酶切后的PCR片段和pGEX-4T-1载体；（5）将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，测序验证载体正确无误，测序结果表明，如SEQIDNO.1所示的序列（贝类模式识别受体LRRP的基因）插入了pGEX-4T-1载体中，进行后续试验，由此得到含有贝类模式识别受体LRRP的基因的pGEX-4T-1载体。

4.重组蛋白的原核表达和纯化

（1）提取步骤3的大肠杆菌DH5α中的含有贝类模式识别受体LRRP的基因的pGEX-4T-1载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)；（2）挑选单克隆并培养至OD=0.6,加入IPTG至终浓度为0.1mM,22℃，180rmp的条件下诱导表达；（3）4h后收集菌液，4℃，12,000×g离心10min；（4）加入Lysozyme至终浓度2mg/ml，然后超声破碎；（5）使用GlutathioneSepharose4B(GEHealthcare)纯化重组蛋白，在12%SDS-PAGE胶分析纯化产物，其蛋白电泳图如图1所示，图1是表达和纯化的贝类模式识别受体LRRP重组蛋白，M：蛋白Marker；Lane1：重组表达蛋白GST-LRRP（贝类模式识别受体LRRP）；Lane2：纯化后的GST-LRRP；箭头指示重组表达的目的蛋白GST-LRRP。由此得到纯化的贝类模式识别受体GST-LRRP重组蛋白。

5.ELISA

（1）将LPS、PGN、LTA、GLucan、Laminarin等多种PRMs分别溶解在双蒸水（40mg/ml）中；（2）分别吸取50μl至96-孔板（Costar），室温放置，直至蒸干；（3）60℃，半小时，固定PRMs；（4）加入200μl含有BSA的TrisBuffer，37℃，2h；（4）弃上清，TrisBufferwash4次，每次2min；（5）加入含有纯化好的贝类模式识别受体GST-LRRP重组蛋白，室温孵育3h；（6）弃上清，TrisBufferwash4次，每次2min；（7）加入mouseanti-GSTantibody(Abmat,1:5000)，孵育2h；（8）弃上清，TrisBufferwash4次，每次2min；（9）加入HRP偶联的goatanti-mouseIgG(Abmat,1:3000)，孵育2h；（10）加入HRP底物TMB(Tiangen)进行显色，450nm光吸收测量结果。结果如图2所示，图2是ELISA分析贝类模式识别受体GST-LRRP重组蛋白对多种PRMs的结合能力，结果表明贝类模式识别受体LRRP可以特异的识别LPS。注：OD，光密度值；LPS，脂多糖；PGN，肽聚糖；Glucan，葡聚糖；LTA，脂磷壁酸；Laminarin，昆布多糖。

Claims

1.一种新型贝类模式识别受体LRRP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的新型贝类模式识别受体LRRP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.一种含有权利要求2所述的新型贝类模式识别受体LRRP的基因的原核表达载体。

4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为表达载体pGEX-4T-1。

5.一种含有权利要求3所述原核表达载体的细菌。

6.根据权利要求5所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述的新型贝类模式识别受体LRRP在制备特异识别脂多糖的药物中的应用。