CN103852432A

CN103852432A - 一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚a的方法

Info

Publication number: CN103852432A
Application number: CN201410111567.6A
Authority: CN
Inventors: 梁晓声; 熊海容; 王海英; 郭小华; 汪文俊
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2014-03-24
Filing date: 2014-03-24
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2034-03-24
Also published as: CN103852432B

Abstract

本发明公开了一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，该方法中双酚A在过氧化物酶或过氧化物模拟酶，与H₂O₂作用下发生聚集，形成双酚A聚合物，对巯基苯酚修饰纳米金表面的酚羟基与双酚A聚合物中的酚羟基邻位形成共价键而使对巯基苯酚修饰纳米金发生聚集，聚集后对巯基苯酚修饰纳米金的表面状态改变，表面状态的改变其等离子共振吸收，表现为520nm处吸收变小，720nm处吸收迅速变大，以已知浓度的双酚A溶液为标准品，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶为检测物，建立双酚A的标准曲线，通过双酚A的标准曲线可以准确测量实际双酚A样品的浓度。该方法能对双酚A进行半定量和定量分析，成本低，且具有检出通量高、检测范围广、准确和速度快的优点。

Description

一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法

技术领域

本发明涉及一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，属于食品和日常用品安全检测技术领域。

背景技术

双酚A（Bisphenol A，缩写为BPA），一种有机化合物，具有两个酚官能团。在工业上双酚A被用来合成聚碳酸酯（PC）和环氧树脂等材料，60年代以来就被用于制造塑料（奶）瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料（奶粉）罐内侧涂层。后来，人们发现BPA能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康。癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。2012年9月24日，美国华盛顿州立大学等机构刊登其研究，公布其在猕猴进行的实验结果，证实双酚A会影响猕猴雌性后代的生殖系统，导致卵子染色体异常（Hunt,Patricia A.et.al.PNAS.2012,109(43)17525-17530）。虽然目前各国已先后禁止了双酚A在婴儿奶瓶中的应用，但是在日常成人饮水杯，热敏纸，食品包装材料等领域仍有着广泛的应用。由于双酚A的大量使用，环境中双酚A也普遍存在，如自然水体，雨水等都能检出不同浓度的双酚A。

目前国内仅出台了聚合物材料中双酚A检出的国家标准，国标采用高效液相色谱来实现双酚A的检出，检出灵敏可靠，然而检出前处理步骤麻烦，依赖大型仪器，检测通量不高。对于双酚A这样普遍存在的环境污染物而言，快速高通量筛查技术可与高效液相色谱技术形成互补，实现大规模检测和样品筛查。快速检测技术是检测领域的一块很有竞争力的方向，快速检测技术具有检测方法简单易行，检测时间短，不需要大型仪器，甚至无需依赖仪器。尽管快速检测由于灵敏度和特异性方面的限制，不能作为判定样品安全性的最终依据；但作为发现问题的第一步，它具有不可替代的作用。事实上，一些突发食源性事件的现场调查也往往以快速检测作为筛查的第一步。目前双酚A快速检测技术还处于初步发展阶段，比较常用的有抗体标记纳米金试纸条法，利用纳米金标记抗体识别双酚A，抗体双酚A复合物被捕获后形成红色条带实现检测。该方法只能提供有或无的结果，而且检测使用抗体成本较高，无法真正用于大规模筛查。因此，开发一种具有定量能力、成本低廉且检测通量高的双酚A检测方法十分必要。

发明内容

本发明提供了一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，该方法能对双酚A进行半定量和定量分析，成本低，且具有检出通量高、检测范围广、准确和速度快的优点。

实现本发明目的所采用的技术方案为：

一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，将对巯基苯酚溶液加入到纳米金溶液中，避光孵育至得到对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，以已知浓度的双酚A溶液为标准品，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶为检测物，在过氧化物酶或过氧化物模拟酶，与H₂O₂共同存在的条件下，对巯基苯酚修饰纳米金发生聚集，检测含不同已知浓度的双酚A溶液的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在720nm和520nm处的光密度，以720nm和520nm处光密度的比值为纵坐标，以2为底双酚A浓度的对数为横坐标，根据检测的数据绘图，拟合后得到双酚A的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y=kx+b，以实际双酚A样品为被检测物，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶为检测物，在过氧化物酶或过氧化物模拟酶，与H₂O₂共同存在的条件下，对巯基苯酚修饰纳米金发生聚集，检测含实际双酚A样品的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在720nm和520nm处的光密度，将720nm和520nm处光密度的比值代入标准曲线的函数关系式的y值中，计算出x值，再根据x值计算出实际双酚A样品的浓度。

所述的对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，包括如下步骤：

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

①按摩尔比对巯基苯酚﹕纳米金=0.1﹕1～100﹕1，将浓度为1～20nM的纳米金溶液加入对巯基苯酚溶液中至对巯基苯酚溶液的终浓度为0.1nM～2μM，混合均匀后，避光孵育至得到对巯基苯酚修饰纳米金溶胶；

2）建立双酚A的标准工作曲线：

①在酶标仪微孔板的7个以上的孔中分别加入7组以上的相同体积、不同已知浓度的标准双酚A溶液，再分别加入催化量的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，过量的H₂O₂溶液和过量的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为7个以上的实验组，其中7个以上的实验组中加入的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，H₂O₂溶液和对巯基苯酚修饰纳米金溶胶完全相同，在另一个微孔板的一个孔中，加入与各实验组中双酚A溶液等体积的水，再加入与各实验组相同的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，H₂O₂溶液和对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为阴性对照组，10～42℃孵育至实验组与阴性对照组相比有色差后，检测各实验组中含已知浓度的双酚A的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度；

②以720nm和520nm处光密度的比值为纵坐标，以2为底双酚A浓度的对数为横坐标，根据各实验组检测的数据绘图，拟合后得到双酚A的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y=kx+b；

3）实际双酚A样品浓度的测定：

①在酶标仪微孔板的一个孔中先加入与步骤2）中各实验组中双酚A溶液等体积的实际双酚A样品，再加入与步骤2）中各实验组相同的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，H₂O₂溶液和对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，10～42℃孵育至出现色差后，检测含实际双酚A样品的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在720nm和520nm处的光密度，将720nm和520nm处光密度的比值代入标准曲线的函数关系式的y值中，计算出x值，再根据x值计算出实际双酚A样品的浓度。

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为5-50nm。

所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶，过氧化物模拟酶为氯化血红素。

所述辣根过氧化物酶或过氧化物模拟酶的终浓度为0.2nM-2μM。

所述H₂O₂溶液的终浓度为0.00006%-0.6%，该浓度为体积百分比浓度。

在上述技术方案中，过氧化物酶或过氧化物模拟酶是催化剂，用来催化双酚A聚合，只需要使用催化量的即能达到目的，H₂O₂是氧化剂，用来氧化双酚A聚合，H₂O₂一定要确保过量，确保加入的标准双酚A能完全被氧化聚合，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶是检测物，与双酚A聚合物发生共聚合作用，为了使加入的标准双酚A被完全检测出来，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的量与双酚A聚合物的量相比要确保过量。在实际操作过程中，绘制双酚A的标准曲线时，由于双酚A的量是已知的，H₂O₂的量是可以根据双酚A的量来确定的，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的量与双酚A聚合物的量相比应确保是过量的，同时还应确保对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对双酚A的响应灵敏度在数量级上保持稳定并且在520nm和720nm处光密度之比值的变化幅度不超过10%。

由上述技术方案可知，该方法中双酚A在过氧化物酶或过氧化物模拟酶，与H₂O₂作用下发生聚集，形成双酚A聚合物，对巯基苯酚修饰纳米金表面的酚羟基与双酚A聚合物中的酚羟基邻位形成共价键而使对巯基苯酚修饰纳米金发生聚集，聚集后对巯基苯酚修饰纳米金的表面状态改变，表面状态的改变其等离子共振吸收，表现为520nm处吸收变小，720nm处吸收迅速变大。以已知浓度的双酚A溶液为标准品，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶为检测物，建立双酚A的标准曲线,通过双酚A的标准曲线可以准确测量实际双酚A样品的浓度，即对双酚A样品进行定量分析，不仅仅是简单的定性分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：

1）该方法中用对巯基苯酚修饰纳米金溶胶作为检测物，而制备对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的方法简单，所使用的试剂均为常用试剂，价格低廉，因而用对巯基苯酚修饰纳米金溶胶作为检测物使该方法检测的成本低。

2）该方法通过建立标准曲线对双酚A进行定量分析，标准曲线的线性范围为0.5～32mg/L，当双酚A的浓度在此线性范围内时，采用该方法进行检测，检测结果十分准确、可靠，当不在此范围内，稍有偏差，可进行半定量分析，而且操作简单，快速，灵敏度高，检出限低，。

3）该方法检测时所使用的试剂均为普通试剂，所使用的测量仪器为酶标仪，酶标仪为常用仪器，因此，该方法的检测成本低。

4）该方法可同时进行大量的双酚A样品分析，检出通量高。

5）该方法制备对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的方法简单，可在检测检测现场随时制备，不需要事先制备存放，而且对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对含有金属离子的双酚A样品，特别是含有鉄系离子的双酚A样品可以进行准确地测量，不会因为金属离子的存在对检测造成干扰，检测范围广。

附图说明

图1为对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的透射电镜（TEM）图。

图2为对巯基苯酚修饰纳米金溶胶与双酚A反应的透射电镜（TEM）图。

图3为实施例2制备的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶检测双酚A的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

将1mL20μM对巯基苯酚溶液加入到100mL10nM纳米金粒径为13nm的纳米金溶液中，混合均匀后，锡箔包被慢摇2小时，即得对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，用透射电镜图观察对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的透射电镜图如图1所示，由图1可知纳米金修饰后没有发生聚集，可以作为检测物使用；

2）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对双酚A时的响应：

在40μL30mg/L双酚A溶液中加入5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL体积百分浓度为0.3%的H₂O₂溶液，200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，用透射电镜图观察双酚A与对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的反应，双酚A与对巯基苯酚修饰纳米金溶胶反应的透射电镜图如图2所示，由图2可知，双酚A在辣根过氧化物酶和H₂O₂共同存在的作用下，与对巯基苯酚修饰纳米金发生了相互作用，使得对巯基苯酚修饰纳米发生了聚集，对巯基苯酚修饰纳米对双酚A具有信号响应。

实施例2

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

将1mL20μM对巯基苯酚溶液加入到100mL10nM纳米金粒径为13nm的纳米金溶液中，混合均匀后，锡箔包被慢摇2小时，即得对巯基苯酚修饰纳米金溶胶；

2）建立双酚A的标准曲线：

①在酶标仪微孔板的7个孔中分别加入40μL3.125mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L双酚A溶液，再分别加入5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL体积百分比浓度为0.3%H₂O₂溶液和200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为7个实验组，在另一个微孔板的一个孔中，加入40μL水，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL体积百分比浓度为0.3%H₂O₂溶液和200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为阴性对照组，37℃孵育至各实验组与阴性对照组相比有明显色差后，检测各实验组中含已知浓度的双酚A的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度；

②不同已知浓度的标准双酚A溶液的检测结果如图2所示，以720nm和520nm处光密度的比值为纵坐标，以2为底双酚A浓度的对数为横坐标，根据各实验组测得的数据绘图，拟合后得到双酚A的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系为：y=0.0784x+0.22，R²=0.9921，其中，y为对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度的比值，x为以2为底双酚A浓度的对数，0.0784为标准曲线的斜率，0.22为标准曲线与y轴的截距，双酚A浓度的线性范围为0.5～32mg/L，线性良好，可用于双酚A的定量分析，结果准确、可靠。

3）实际样品的测试

1○在酶标仪微孔板的一个孔中先加入40μL实际双酚A样品，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL体积百分比浓度为0.3%H₂O₂溶液和200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，检测含实际双酚A样品的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在720nm和520nm处的光密度，将720nm和520nm处光密度的比值代入标准曲线的函数关系式的y值中，计算出x值，x值即为实际双酚A样品的浓度。

实施例3

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

将4组1mL0.05μM、1μM、10μM、100μM对巯基苯酚溶液分别加入到4组100mL1nM、5nM、10nM和20nM纳米金粒径为13nm的纳米金溶液中，搅拌均匀后，锡箔包被慢摇2小时，即得4组对巯基苯酚修饰纳米金溶胶；

2）按对巯基苯酚与纳米金的不同摩尔比制备的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对双酚A的响应：

在酶标仪微孔板的4个孔中分别加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL体积百分浓度为0.3%的H₂O₂溶液，再分别加入200μL步骤1）中制备的4组对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为4个实验组，在另一个微孔板的一个孔中，加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL体积百分比浓度为0.3%的H2O2溶液，再加入200μL水，作为空白对照组，37℃孵育5～30分钟，检测各实验组中对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度；

检测的结果显示，按对巯基苯酚与纳米金的不同摩尔比制备的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对双酚A均有良好响应，且720nm与520nm处光密度的比值远大于空白对照组。实施例4

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

2）不同浓度的辣根过氧化物酶溶液对双酚A的响应：

在酶标仪微孔板的5个孔中分别加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL体积百分浓度0.3%H₂O₂溶液，然后分别加入5μL0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM辣根过氧化物酶溶液，再分别加入200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为5个实验组，在另一个微孔板的一个孔中，加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL体积百分比浓度0.3%H₂O₂溶液，5μL水和200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为空白对照组，37℃孵育2-180分，辣根过氧化物酶加入的则量多孵育时间短，加入的量少则孵育时间长，检测各实验组中对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度；

检测的结果显示，不同浓度的辣根过氧化物酶溶液对双酚A均有良好的响应，且720nm与520nm处光密度的比值远大于空白对照组。

实施例5

将4组1mL20μM对巯基苯酚溶液分别加入到100mL5nM纳米金粒径分别为5nm、13nm、30nm、50nm的纳米金溶液中，混合均匀后，得到4组对巯基苯酚修饰纳米金溶胶；

2）不同粒径的纳米金溶液制备的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对双酚A的响应：

在酶标仪微孔板的4个孔中分别加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL体积百分浓度0.3%H₂O₂溶液，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，再分别加入200μL步骤1）中制备的四组对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为四个实验组，在另一个微孔板的一个孔中，加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL体积百分浓度0.3%H₂O₂溶液，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液和200μL水作为空白对照组，10℃孵育5～30分钟，检测各实验组中对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度；

检测的结果显示，不同粒径的纳米金溶液制备的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶对双酚A均有良好的响应，且720nm与520nm处光密度的比值远大于空白对照组。

实施例6

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

2）不同浓度的H₂O₂溶液对双酚A的响应：

在酶标仪微孔板的5个孔中分别加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，然后分别加入5μL体积百分浓度0.003%、0.03%、0.3%、3%、30%H₂O₂溶液，再分别加入200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为5个实验组，在另一个微孔板的一个孔中，加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL3μM辣根过氧化物酶溶液，5μL水和200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为空白对照组，37℃孵育2～180分，检测各实验组中对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度，H₂O₂加入的量多则孵育时间短，H₂O₂加入的量少则孵育时间长；

检测的结果显示，不同浓度的H₂O₂溶液对双酚A均有良好的响应，且720nm与520nm处光密度的比值远大于空白对照组。

实施例7

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

2）不同浓度的氯化血红素溶液对双酚A的响应：

在酶标仪微孔板的5个孔中分别加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL体积百分浓度0.3%H₂O₂溶液，然后分别加入5μL0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM氯化血红素溶液，再分别加入200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为5个实验组，在另一个微孔板的一个孔中，加入40μL200mg/L双酚A溶液，5μL体积百分浓度0.3%H₂O₂溶液，5μL水和200μL对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为空白对照组，42℃孵育至实验组与空白对照组相比有明显色差后，检测各实验组中对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度，

检测的结果显示，不同浓度的氯化血红素溶液对双酚A均有良好的响应，且720nm与520nm处光密度的比值远大于空白对照组。

Claims

1.一种对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，其特征在于：将对巯基苯酚溶液加入到纳米金溶液中，避光反应至得到对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，以已知浓度的双酚A溶液为标准品，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶为检测物，在过氧化物酶或过氧化物模拟酶，与H₂O₂共同存在的条件下，对巯基苯酚修饰纳米金发生聚集，检测含不同已知浓度的双酚A溶液的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在720nm和520nm处的光密度，以720nm和520nm处光密度的比值为纵坐标，以2为底双酚A浓度的对数为横坐标，根据检测的数据绘图，拟合后得到双酚A的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y=kx+b，以实际双酚A样品为被检测物，对巯基苯酚修饰纳米金溶胶为检测物，在过氧化物酶或过氧化物模拟酶，与H₂O₂共同存在的条件下，对巯基苯酚修饰纳米金发生聚集，检测含实际双酚A样品的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在720nm和520nm处的光密度，将720nm和520nm处光密度的比值代入标准曲线的函数关系式的y值中，计算出x值，再根据x值计算出实际双酚A样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）对巯基苯酚修饰纳米金溶胶的制备：

①按摩尔比对巯基苯酚﹕纳米金=0.1﹕1～100﹕1，将对巯基苯酚溶液加入浓度为1～20nM的纳米金溶液中至对巯基苯酚溶液的终浓度为0.1nM～2μM，混合均匀后，避光反应至得到对巯基苯酚修饰纳米金溶胶；

2）建立双酚A的标准工作曲线：

①在酶标仪微孔板的7个以上的孔中分别加入7组以上的相同体积、不同已知浓度的标准双酚A溶液，再分别加入催化量的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，过量的H₂O₂溶液和过量的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为7个以上的实验组，其中7个以上的实验组中加入的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，H₂O₂溶液和对巯基苯酚修饰纳米金溶胶完全相同，在另一个微孔板的一个孔中，加入与各实验组中双酚A溶液等体积的水，再加入与各实验组相同的过氧化物酶溶液或过氧化物模拟酶溶液，H₂O₂溶液和对巯基苯酚修饰纳米金溶胶，作为阴性对照组，10～42℃孵育至各实验组与阴性对照组相比有色差后，检测各实验组中含已知浓度的双酚A的对巯基苯酚修饰纳米金溶胶在波长为520nm和720nm处的光密度；

3）实际双酚A样品浓度的测定：

3.根据权利要求2所述对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，其特征在于：

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为5-50nm。

4.根据权利要求2所述对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，其特征在于：

5.根据权利要求5所述对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，其特征在于：

所述辣根过氧化物酶或过氧化物模拟酶的终浓度为0.2nM-2μM。

6.根据权利要求2所述对巯基苯酚修饰纳米金检测双酚A的方法，其特征在于：

所述H2O2溶液的终浓度为0.00006%-0.6%，该浓度为体积百分比浓度。