CN103841979A

CN103841979A - 作为改善非抗凝血的硫酸多糖的口服制剂的添加剂的吸收促进剂

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Publication number: CN103841979A
Application number: CN201280035040.9A
Authority: CN
Inventors: 彼得·图雷切克; 苏珊娜·韦德
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-07-18
Also published as: EP2734213A2; AU2012284048A1; JP2014520889A; CN103841979B; NZ618786A; AU2012284048B2; WO2013012954A2; EP3417865A1; US20130035288A1; EP2734213B1; ES2676885T3; US8846620B2; DK2734213T3; JP6157464B2; CA2838793C; CA2838793A1; EP2734213A4; WO2013012954A3

Abstract

本发明的方面包括用于增强受试者的血液凝固的方法。在实施根据某些实施方式的方法中，以足以增强受试者的血液凝固的方式，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂将一定量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)经口施用至受试者。还描述了用于实施本发明的方法的组合物和试剂盒。

Description

作为改善非抗凝血的硫酸多糖的口服制剂的添加剂的吸收促进剂

相关定义

在描述本发明中，将采用以下术语，并且意图如下所指出的进行定义。

必须注意的是，如本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容中另有明确指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如体积一种“NASP”可以根据需要包括两种以上NASP的混合物。

如本文中使用的，“NASP”是指在本文中所述的各种凝结测定的任一种中表现出非-抗凝和抗凝血活性的硫酸多糖(SP)。NASP可以是天然硫酸多糖，如从生物来源或合成硫酸多糖提取的那些，其中硫酸多糖是部分或全部通过合成方法(例如，化学合成)产生的。活性的一个量度是比较通过NASP证实的凝结时间与通过肝素显示的抗凝血活性。例如，通过采用本文中提供的方法和组合物，关注的NASP在稀促凝血酶时间(dPT)或活化部分凝血活酶时间(aPTT)凝结测定中表现出抗凝血活性，其不多于三分之一，如少于十分之一，未分级肝素(MW范围为8,000至30,000；平均18,000道尔顿)的摩尔抗凝血活性。同样，关注的NASP显示相比于肝素的2-倍或更低的抗凝血活性，如相比于肝素的5-倍或更低的抗凝血活性，如相比于肝素的10-倍或更低的抗凝剂激活，如相比于肝素的25-倍或更低的抗凝血活性，如相比于肝素的50-倍或更低的抗凝血活性，包括相比于肝素的100-倍或更低的抗凝血活性，通过采用本文中提供的方法和组合物。

关注的NASP的分子量范围可以为10道尔顿至1,000,000道尔顿，如例如，100道尔顿至900,000道尔顿，如500道尔顿至500,000道尔顿，如1000道尔顿至250,000道尔顿、包括5000道尔顿至150,000道尔顿。NASP的平均分子量范围为约10道尔顿至约500,000道尔顿，如约100道尔顿至约300,000道尔顿，如1000道尔顿至250,000道尔顿，包括1000道尔顿至150,000道尔顿。

在一些情况下，关注的NASP可以包括，但不限于N-乙酰基-肝素(NAH)，N-乙酰基-脱-O-硫酸化-肝素(NA-脱-o-SH)，脱-N-硫酸化-肝素(De-NSH)，脱-N-硫酸化-乙酰化-肝素(De-NSAH)，高碘酸盐氧化的肝素(POH)，化学硫酸化的昆布多糖(CSL)，化学硫酸化的海藻酸(CSAA)，化学硫酸化的果胶(CSP)，硫酸葡聚糖(DXS)，肝素衍生的寡糖(HDO)，多硫酸戊聚糖酯(PPS)，硫酸麦芽五糖，硫酸β环糊精，硫酸6-羧基艾考糊精及其衍生物。在某些情况下，NASP是岩藻依聚糖。例如，岩藻依聚糖可以是岩藻依聚糖5307002，水疱墨角藻，最大MW峰值126.7kD；岩藻依聚糖VG49，水疱墨角藻，较低MW的5307002的水解样品，最大MW峰值22.5kD；岩藻依聚糖VG57，裙带菜，高电荷(高硫酸化，去乙酰化的)；岩藻依聚糖GFS(5508005)，裙带菜，去热原的；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01091)，水疱墨角藻，去热原的，最大MW峰值125kD；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01092)，水疱墨角藻，去热原的，最大MW峰值260kD；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01093)，水疱墨角藻，水解去热原的，最大MW峰值36kD；边花昆布(Ecklonia radiata)提取物；

Ecklonia maxima提取物；

巨藻(Macrocystis pyrifera)提取物；

免疫试验岩藻依聚糖混合物；及其组合。

联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂的NASP可以用在本发明的方法中用于改善止血，治疗出血障碍，如与缺乏凝固因子相关的那些或用于反转抗凝剂的作用，尤其是当需要或期望通过胃肠系统的吸收时。NASP促进凝结和减少出血的能力可以使用各种体外凝结测定(例如，TFPI-dPT，凝血酶产生和凝血弹性描记术(TEG)测定)和体内出血模型(例如在血友病小鼠或狗中的剪尾，横切，全血凝结时间或外皮出血时间确定)来确定。参见，例如，PDR Staff.Physicians'Desk Reference.2004，Anderson等(1976)Thromb.Res.9:575-580；Nordfang等(1991)Thromb Haemost.66:464-467；Welsch等(1991)ThrombosisResearch64:213-222；Broze等(2001)Thromb Haemost85:747-748；Scallan等(2003)Blood.102:2031-2037；Pijnappels等(1986)Thromb.Haemost.55:70-73；和Giles et al.(1982)血液60:727-730，以及本文中的实施例。

“促凝血剂”一起常规含义在本文中用来指能够引发或加速凝块形成的任何因子或试剂。本发明的促凝血剂包括但不限于内在或外在凝血途径的任何活化剂，如选自由以下组成的组中的凝血因子：因子Xa，因子IXa，因子XIa，因子XIIa，和VIIIa，前激肽释放酶，高分子量激肽原，组织因子，因子VIIa，和因子Va，以及促进凝血的其他试剂，包括激肽释放酶，APTT引发剂(即，含有磷脂和接触活化剂的试剂)，拉塞尔蝰蛇毒(Russel's viper venom)(RVV时间),和促凝血酶原激酶(用于dPT)。在一些实施方式中，接触活化剂可以用作促凝血试剂。例如，接触活化剂可以包括微粉化二氧化硅离子，鞣花酸，硫苷脂，高岭土等。促凝血剂可以来自粗天然提取物，血液或血浆样品，分离的或基本上纯化的，合成的或重组的。促凝血剂可以包括天然存在的凝结因子或其保持生物学活性(即，促进凝血)的片段，变体或共价修饰衍生物。

如本文使用的，术语“多糖”是指含有两种以上共价连接的糖残基的聚合物。糖残基可以例如通过糖苷、酯、酰胺或肟连接部分连接。多糖的平均分子量可以广泛变化，如例如范围为100至1,000,000道尔顿以上，如100至500,000道尔顿以上，如1000至250,000道尔顿以上，如1000至100,000道尔顿以上，如10,000至50,000道尔顿以上。多糖可以是直链(即线性)的或支链的，或者可以含有直链和直链部分的离散区域。多糖还可以是通过降解(例如水解)较大多糖产生的多糖的片段。降解可以通过任何方便的方案实现，包括用酸、碱、热、氧化剂或酶处理多糖以生成成段的多糖。多糖可以被化学地改变并且可以被修饰，包括但不限于，硫酸化，多硫酸化（polysulfation），酯化和甲基化。

如本文所述的，分子量可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另有指明，本文中对分子量的所有提及是指重均分子量。分子量确定（数均和重均）可以使用例如，凝胶渗透色谱或其他液相色谱技术测量。

术语“来源于”在本文中用来鉴别分子的原始来源但不意味着限制制备该分子的方法，其可以例如通过化学合成或重组方法制备。

术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白(mutein)”是指保持在治疗出血障碍中的所需活性如凝结活性的参比分子的生物学活性衍生物。在提及多肽(例如凝结因子)中的术语“变体”和“类似物”是指具有天然多肽序列和结构的化合物，其中相对于天然分子具有一个或多个氨基酸插入、替代(通常在性质上是保守的)和/或缺失，只要所述修饰不破坏生物学活性，并且其与以下定义的参比分子是“基本上同源的”。这样的类似物的氨基酸序列与参比序列具有高度的序列同源性，例如当两个序列进行比对时，氨基酸序列同源性为50%以上，如60%以上，如70%以上，如80%以上，如90%以上，如95%以上，包括99%以上。在一些情况下，类似物将包括相同数量的氨基酸但将包括替代。术语“突变蛋白”还包括这样的多肽，其具有一个或多个氨基酸-样分子，包括但不限于化合物仅含有氨基和/或亚氨基分子，含有一个或多个氨基酸类似物的多肽(包括，例如，合成的非天然存在的氨基酸等)，具有取代的键，以及本领域中已知的其他修饰的多肽，天然存在的和非-天然存在的(例如，合成的)，环化的，支化分子等。术语还包括包含一个或多个N-取代的甘氨酸残基的分子(“类肽(peptoid)”)和其他合成氨基酸或肽。(参见，例如，美国专利No.5,831,005；5,877,278；和5,977,301；Nguyen等，Chem Biol.(2000)7:463-473；以及Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:9367–9371对于类肽的描述)。在本发明的实施方式中，类似物和突变蛋白至少具有与天然分子相同的凝结活性。

如上讨论的，类似物可以包括保守性的替代，即，在侧链中涉及的氨基酸家族中发生的那些替代。具体地，氨基酸通常分成四个家族：(1)酸性的--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性的--赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性的--丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；和(4)不带电荷极性的--甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸在一些情况下归类为芳族氨基酸。例如，亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸,天冬氨酸用谷氨酸,苏氨酸用丝氨酸的分离的替代物,或氨基酸用结构相关的氨基酸的类似保守替代，将对生物学活性不具有主要影响。例如，关注的多肽可以包括多至约5-10保守或非-保守氨基酸替代,或甚至多至约15-25保守或非-保守氨基酸替代,或5-25的任何整数，只要分子的所需的功能保持完整。

“衍生物”是指关注的参比分子或其类似物的任何合适的修饰，如硫酸化、乙酰基化、糖基化、磷酸化、聚合物缀合(如利用聚乙二醇),或添加外来部分，只要保持参比分子的所需生物学活性(例如，凝结活性，抑制TFPI活性)。例如，多糖可以用一个或多个有机或无机基团衍生化。实例包括但不限于至少一个羟基被另一个部分(例如硫酸酯、羧基、磷酸酯、氨基、腈、卤代、甲硅烷基、酰胺基、酰基、脂肪族、芳族或糖基团)取代的多糖，或其中环氧已被硫、氮、亚甲基等替代的情况下，多糖可以化学地改变，例如以改善促凝血功能。这样的修饰可以包括但不限于硫酸化、多硫酸化、酯化和甲基化。

“片段”是指含有完整全长序列和结构的一部分的分子。在一些情况下，多糖的片段可以通过降解(例如，水解)较大的多糖产生。本发明的多肽的活性片段可以包括全长多糖的约2-20糖单元，如全长分子的约5-10糖单元，并且包括2糖单元和全长分子之间的任何整数，只要该片段保持生物学活性，如例如，凝结活性或抑制TFPI活性的能力。多肽的片段可以包括天然多肽的C-末端缺失、N-末端缺失或内部确实。在一些实施方式中，特定蛋白的活性片段可以包括全长分子的约5-10连续氨基酸残基或更多，如全长分子的约15-25连续氨基酸残基或更多，如全长分子的约20-50连续氨基酸残基或更多，并且包括5个氨基酸和全长序列之间的任何整数，只要所讨论的片段保持生物学活性，如例如，凝结活性。

“基本上纯化的”是指物质(例如，非-抗凝剂硫酸多糖)的分离使得所述物质包括其所在的样品的大部分。例如，基本上上纯化的样品含有50%以上的关注物质，如60%以上的关注物质，如75%以上的关注物质，如90%以上的关注物质，如95%以上的关注物质，包括99%以上的关注物质。任何方便的方案可以用于纯化关注的多糖，多核苷酸和多肽并且包括但不限于超滤，选择性沉积，结晶，离子交换色谱，亲和色谱和根据密度的沉淀。

当提及多糖或多肽时，“分离的”是指所指定的分子从在自然中发现该分子的整个有机体分开和分离或以基本上没有同样类型的其他生物学大分子存在。

“同源性”是指两个多肽部分之间的同一性百分比。如本文中提及的，当序列展现出约50%以上序列同一性，如60%以上序列同一性，如75%以上序列同一性，如85%以上序列同一性，如90%以上序列同一性，如95%以上序列同一性，包括99%以上序列同一性时，两个多肽序列彼此是“基本上同源的”。在一些实施方式中，基本同源性的多肽包括具有与规定序列完全同一性的序列。

“同一性”是指两个高分子序列的精确亚基对亚基对应性。例如，同一的多肽是与另一个多肽具有精确的氨基酸-对-氨基酸对应性的多肽或者同一的多核苷酸是具有与另一个多核苷酸的精确核苷酸-对-核苷酸的核苷酸。同一性百分比可以通过直接比较两个分子(参比序列和与该参比序列具有未知的%同一性的序列)之间的序列信息，通过比对序列、计算两个比对序列之间的精确的匹配数、除以参比序列的长度和用100乘以该结果而确定。可以采用任何方便的方案来确定两个高分子序列之间的同一性百分比，如例如，ALIGN，Dayhoff，M.O.in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O.Dayhoff ed.，5Suppl.3:353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC，其修改了Smith和Waterman Advances in Appl.Math.2:482-489，1981用于肽分析的局部同源性算法。

“受试者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人和其他灵长类，包括非人灵长类，如黑猩猩和其他猴物种；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家养、野生和游戏禽类如小鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽类、鸭类、鹅类等。该术语不表示特定年龄。因此成年和新生个体都是关注的。

术语“患者”一起常规含义使用以指正遭受或易于感染可以通过施用本发明的NASP被预防或治疗的病症的活有机体，并且包括人和非人动物。

“生物学样品”是指分离自受试者的组织或流体的样品，包括但不限于，例如，血液，血浆，血清，粪便物，尿液，骨髓，胆汁，脊髓液，淋巴液，皮肤的样品，皮肤的外部分泌物，呼吸，肠的，和泌尿生殖道，眼泪，唾液，乳汁，血液细胞，器官，活检组织和体外细胞培养物组分的进一步样品包括但不限于由细胞和组织在培养基中生长产生的调节介质，例如重组细胞和细胞组分。

“治疗有效剂量或量”是指当如本文所述施用时，产生大致所需治疗响应，如例如减少的出血或更短凝结时间的量。

“出血障碍”是指与过度出血相关的任何障碍，如先天凝血障碍，后天凝血障碍，施用抗凝血剂,或创伤诱发的出血病症。如以下所述的，出血障碍可以包括，但不限于，血友病A，血友病B，冯维勒布兰德病，特发性血小板减少，缺乏一种或多种接触因子，如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，和高分子量激肽原(HMWK)，缺乏一种或多种与临床大量出血相关的因子，如因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II(低凝血酶原血症)，和冯维勒布兰德因子，维生素K缺乏，纤维蛋白原障碍，包括脱纤维蛋白原血，低纤维蛋白原血，和异常纤维蛋白原血症,α₂-抗纤维蛋白溶酶缺乏，和过度出血如由肝病，肾病，血小板减少，血小板功能障碍，血肿，内出血，关节积血，手术，创伤，体温过低，行经，和怀孕引起的。

具体实施方式

本发明的方面包括用于增强受试者的血液凝固的方法。在实施根据某些实施方式的方法中，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，一定量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)以足以增强受试者的血液凝固的方式经口施用至受试者。还描述了用于实施本发明的方法的组合物和试剂盒。

在更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文中描述的特定实施方式，因为这样的实施方式可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且术语不用于限制。本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有如由本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确指出，至下限单位的十分之一，该范围上下限之间的插入值和在所述范围中的任何其他陈述或插入的值被涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可以独立地包括在该较小范围内并且也涵盖在本发明中，经过在所述范围内的任何具体地排除限制。在所述范围包括所述界限之一或两个的情况下，排除那些包括界限的任一个或二者的范围也包括在本发明中。某些范围以前面用术语“约“的数值提供在本文中。术语“约”在本文中用来对在其前面的精确数值以及接近或近似之前有该术语的数值的数值提供文字支持。在确定数值是否接近或近似具体陈述的数值的数值中，该接近或近似的未陈述数值可以是这样的数值，在提供其的上下文中，其提供该具体陈述数值的实质性等同。在本说明书中引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用在如同各个单个出版物、专利或专利申请被具体和个别地指明通过引用结合的相同程度结合于本文。此外，每个所述出版物、专利或专利申请通过引用结合于本文以结合所引述出版物公开和描述主题。任何出版物的引述用于其申请日之前的公开内容并且不应解释为承认本文所描述的发明借助于之前的发明不先于这样的出版物。而且，提供的出版物的日期可能不同于实际公开日，这可能需要独立地确认。

注意到，权利要求可以撰写为排除任何任选的要素。同样，这种陈述意图用作用于使用这样的排除术语如“单独地”、“唯一地”等结合权利要素的引述或使用“负面”限制的引用基础。如对本领域技术人员在阅读本公开内容后显而易见的，本文描述和举例说明的单个实施方式各自具有离散的组分和特征，其可以容易地从其他若干实施方式任一个的特征分离或组合而没有背离本发明的范围或精神。任何陈述的方法可以以所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等价的任何方法和材料也可以在本发明的实践或测试中使用，但现在描述代表性示例性方法和材料。

在进一步描述主题发明中，通过联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂经口施用NASP的用于增强受试者的血液凝固的首先更详细地进行描述。接下来，还描述用于实施主题发明的方法的组合物和试剂盒。

用于增强受试者的血液凝固的方法

如以上所概述的，本发明的方面包括用于增强血液凝固的方法，通过联合胃肠上皮渗透促进剂向受试者经口施用具有一定量的NASP的组合物。术语“增强血液凝固”以其常用含义用来指加速受试者的血液凝固的启动(即，减少永不凝固开始的时间量)以及血液凝固的总体速率(即，减少用于血液凝固完成的时间量)。在一些实施方式中，本发明的方法加速血液凝固的启动。例如，与合适对照相比，本发明的方法可以将用于血液开始凝固所需的时间量减少5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，如95%以上。在其他实施方式中，本发明的方法增大血液凝固的速率。例如，与合适对照相比，本发明的方法可以将血液凝固的速率增大2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如100%以上，如200%以上，包括500%以上。

在本公开内容的实施方式中，联合肠道上皮屏障渗透促进剂，促凝血量的NASP经口施用。根据受试者的生理学，如本文中使用的，短语“胃肠上皮”是指消化道如胃和肠道(例如，十二指肠，空肠，回场)的上皮组织，并且可以还包括参与身体的胃肠道功能的其他结构，包括食道、直肠和肛门的下部。胃肠渗透促进剂是指当经口施用时，增大由胃肠系统吸收的NASP的量的化合物。此外，胃肠渗透促进剂还可以加速通过胃肠上皮的NASP吸收的启动(即，减少用于吸收开始的时间量)以及加速跨国受试者的胃肠上皮的NASP的总体转运速率(即，减少由胃肠系统的NASP吸收完成的时间量)。

在一些实施方式中，肠道上皮屏障渗透促进剂增大由胃肠系统吸收的NASP的量。例如，与合适对照相比，肠道上皮屏障渗透促进剂可以将由胃肠系统吸收的NASP的量增加5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，如95%以上。在其他实施方式中，肠道上皮屏障渗透促进剂加速通过胃肠上皮的NASP的启动。例如，与合适对照相比，本发明的胃肠上皮屏障渗透促进剂可以将启动NASP的吸收所需的时间量减少5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，如95%以上。在另外的其他实施方式中，本发明的肠道上皮屏障渗透促进剂增大由胃肠系统的NASP的吸收速率。例如，与合适对照相比，肠道上皮屏障渗透促进剂可以将NASP吸收的速率增大2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如100%以上，如200%以上，包括500%以上。在一些情况下，本发明的胃肠上皮屏障渗透促进剂可以增大如通过如以下更详细描述的Caco-2细胞模型确定的NASP的吸收速率。例如，与合适对照相比，本发明的肠道上皮屏障渗透促进剂可以将如通过Caco-2细胞模型确定的吸收增大2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如100%以上，如200%以上，包括500%以上。

在本发明的实施方式中，肠道上皮屏障渗透促进剂可以变化，这取决于特定的血液凝固障碍、受试者的生理学和通过胃肠系统的吸收所需的增强。在一些实施方式中，肠道上皮屏障渗透促进剂是紧密连接调节剂。术语“紧密连接”以其常用含义用来指其中相邻细胞结合在一起的紧密相关细胞区域。同样，在某些实施方式中，本发明的方法包括联合调节NASP通过胃肠上皮的紧密连接的渗透的化合物，经口施用具有促凝血量的NASP的组合物。“调节”是指改变或增大NASP通过胃肠上皮的紧密连接的渗透。同样，紧密连接调节剂改变或增大NASP通过胃肠系统的吸收。在本发明的实施方式中，紧密连接调节剂可以包括，但不限于酶，胆酸，多糖，脂肪酸及其盐及其任意组合。

在一些情况下，紧密连接调节剂是多糖。例如，多糖紧密连接调节剂可以是脱乙酰壳多糖。如本文使用的，脱乙酰壳多糖是指通过壳多糖的N-脱乙酰化制备的2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-β-D-吡喃葡萄糖的线性共聚物。多糖紧密连接调节剂还可以包括脱乙酰壳多糖的衍生物如N-烷基脱乙酰壳多糖，乙酰化脱乙酰壳多糖，硫醇化脱乙酰壳多糖，磷酸脱乙酰壳多糖，脱乙酰壳多糖环糊精，N-(氨基烷基)脱乙酰壳多糖，琥珀酰脱乙酰壳多糖和辛酰基脱乙酰壳多糖等。

在其他情况下，紧密连接调节剂是胆酸。术语“胆酸”以其常用含义用来指在哺乳动物的胆汁中发现的甾体酸及其盐。合适的胆酸可以包括，但不限于,胆酸(胆酸盐)，脱氧胆酸(脱氧胆酸盐)，鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸盐)，熊脱氧胆酸(熊脱氧胆酸盐)，甘氨胆酸(甘氨胆酸盐)，牛磺胆酸(牛磺酸盐)和石胆酸(石胆酸盐)等。

在其他情况下，紧密连接调节剂是酶。例如，酶紧密连接调节剂可以是蛋白酶，如菠萝蛋白酶或菠萝蛋白酶的酶片段。如本文使用的，菠萝蛋白酶是指通常衍生自菠萝(Ananas comosus)的果实、茎干和叶子的一组酶并且还可以包括要素如半胱氨酸蛋白酶，淀粉酶，酸性磷酸酶，过氧化物酶和纤维素酶。

在另外的其他情况下，紧密连接调节剂是脂肪酸及其脂肪酸盐。本发明的脂肪酸紧密连接调节剂可以变化，并且可以包括中链脂肪酸中的任一种或组合，如例如C8(辛酸盐)，C10(癸酸盐)和C12(月桂酸盐)脂肪酸及其脂肪酸盐。在某些情况下，例如，脂肪酸紧密连接调节剂是癸酸钠。

联合NASP施用的胃肠道上皮屏障渗透促进剂的浓度可以根据所需的效果变化。取决于肠道上皮屏障渗透促进剂，所述浓度可以为组合物的总质量的0.01%以上，如0.1%以上，如1%以上，如2%以上，如5%以上，如10%以上，如15%以上，如20%以上，如25%以上并且包括组合物的总质量的50%以上。在其他实施方式中，联合NASP施用的胃肠道上皮屏障渗透促进剂的浓度为0.01mg/mL以上，如0.05mg/mL以上，如0.1mg/mL以上，如1mg/mL以上并且包括5mg/mL以上。在另外的其他实施方式中，联合NASP施用的胃肠道上皮屏障渗透促进剂的浓度0.1mM以上，如0.5mM以上，如1mM以上，如5mM以上，如10mM以上，如25mM以上并且包括50mM以上。在某些实施方式中，两种以上肠道上皮屏障渗透促进剂同时采用。例如，两种以上紧密连接调节剂可以联合NASP采用，如三种以上紧密连接调节剂，包括四种以上紧密连接调节剂。可以采用紧密连接调节剂的任意组合，如例如，多糖和蛋白酶，脂肪酸和多糖,多糖和胆酸,多糖,脂肪酸和胆酸，在其他组合物中，两种不同的多糖或两种不同的胆酸。在采用一种以上的胃肠道上皮屏障渗透促进剂的情况下，各种胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量百分比可以变化，范围为组合物的总质量的1%以上，如2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上并且包括组合物的总质量的50%以上。例如，在采用两种肠道上皮屏障渗透促进剂的情况下，第一种胃肠道上皮屏障渗透促进剂和第二种胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比可以变化，范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，t第一种胃肠道上皮屏障渗透促进剂和第二种胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在一些实施方式中，第二种胃肠道上皮屏障渗透促进剂与第一种胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，第二种胃肠道上皮屏障渗透促进剂与第一种胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在某些情况下，胃肠上皮屏障渗透促进剂包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶。在采用脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的情况下，脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的质量比可以变化，范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000.在一些实施方式中，菠萝蛋白酶与脱乙酰壳多糖的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，菠萝蛋白酶与脱乙酰壳多糖的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。

在采用脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合的情况下，在某些实施方式中，脱乙酰壳多糖的浓度可以变化，范围为约0.1%至约5%，如约0.15%至约4.5%，如0.2%至约4%，如约0.25%至约3.5%，如0.3%至约3%，如0.5%至约2.5%，包括约0.5%至1.5%。同样，在采用脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合的情况下，在某些实施方式中，菠萝蛋白酶的浓度可以变化，范围为约0.01mg/mL至约1.0mg/mL，如约0.2mg/mL至约0.9mg/mL，如0.25mg/mL至约0.75mg/mL，如约0.3mg/mL至约0.6mg/mL，包括约0.4mg/mL至约0.5mg/mL。同样，在这些实施方式中，方法包括联合脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶二者施用NASP。例如，NASP可以是天然或合成NASP，如上述的那些，包括N-乙酰基-肝素(NAH)，N-乙酰基-脱-O-硫酸化-肝素(NA-脱-o-SH)，脱-N-硫酸化-肝素(De-NSH)，脱-N-硫酸化-乙酰化-肝素(De-NSAH)，高碘酸盐氧化的肝素(POH)，化学硫酸化的昆布多糖(CSL)，化学硫酸化的海藻酸(CSAA)，化学硫酸化的果胶(CSP)，硫酸葡聚糖(DXS)，肝素衍生的寡糖(HDO)，多硫酸戊聚糖酯(PPS)，硫酸麦芽五糖，硫酸β环糊精，硫酸6-羧基艾考糊精及其衍生物。例如，the NASP可以是岩藻依聚糖，如岩藻依聚糖5307002，水疱墨角藻，最大MW峰值126.7kD；岩藻依聚糖VG49，水疱墨角藻，较低MW的5307002的水解样品，最大MW峰值22.5kD；岩藻依聚糖VG57，裙带菜，高电荷(高硫酸化，去乙酰化的)；岩藻依聚糖GFS(5508005)，裙带菜，去热原的；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01091)，水疱墨角藻，去热原的，最大MW峰值125kD；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01092)，水疱墨角藻，去热原的，最大MW峰值260kD；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01093)，水疱墨角藻，水解去热原的，最大MW峰值36kD；

边花昆布提取物；

Ecklonia maxima提取物；

巨藻提取物；

免疫试验岩藻依聚糖掺混物；及其组合。如上解释的，在某些情况下，脱乙酰壳多糖的浓度的范围为约0.1%至约5%，如约3%并且菠萝蛋白酶的浓度的范围为0.1mg/mL至约1mg/mL，如约0.5mg/mL。

在采用两种或以上胃肠上皮屏障渗透促进剂的情况下，在一些实施方式中，所述组合是协同有效的胃肠上皮屏障渗透促进剂的组合。术语“系统有效”是指胃肠上皮屏障渗透促进剂的组合产生比通过单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果更大的效果(即，增强胃肠上皮屏障渗透)。例如，一种以上的胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合产生为通过单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果2倍以上的效果，如3-倍以上，如4-倍以上，如5-倍以上，如10-倍以上并且包括为通过单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果的25-倍以上。同样，在组合两种肠道上皮屏障渗透促进剂的情况下，本发明的协同有效组合产生为通过两种单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果2-倍以上的效果，如5-倍以上，如10-倍以上并且包括为通过两种单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果的25-倍以上的效果。同样，在组合三种肠道上皮屏障渗透促进剂的情况下，本发明的协同有效组合产生为通过三种单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果2-倍以上的效果，如5-倍以上，如10-倍以上并且包括为通过三种单个胃肠上皮屏障渗透促进剂的和实现的效果25-倍以上的效果。在某些实施方式中，本发明的协同有效组合包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合。在这些实施方式中，所述脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合对增强通过胃肠上皮屏障的渗透具有比通过脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶单个的和实现的效果更大的效果。例如，在一些情况下，所述脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合对通过胃肠上皮屏障的渗透比通过脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶单个的和实现的效果增强2-倍以上，如5-倍以上，如10-倍以上并且包括比通过脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶单个的和实现的效果增强25-倍以上。在某些情况下，协同有效组合包括浓度范围为0.1mg/mL至约0.5mg/mL，如0.15mg/mL至约0.4mg/mL，包括0.25mg/mL的菠萝蛋白酶和浓度范围为约1%至约5%w/v，如1.5%至约4.5%w/v，如2%至约4%w/v并且包括约3%w/v的脱乙酰壳多糖的组合。在某些实施方式中，菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的协同有效组合包括0.5mg/mL菠萝蛋白酶和3%w/v脱乙酰壳多糖的组合。在其他实施方式中，菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的协同有效组合包括0.25mg/mL菠萝蛋白酶和1.5%w/v脱乙酰壳多糖。在另外的其他实施方式中，菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的协同有效组合包括0.12mg/mL菠萝蛋白酶和0.75%w/v脱乙酰壳多糖。

在本发明的实施方式中，提供了通过联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂向受试者经口施用NASP的用于增强血液凝固的方法。“受试者”是指接受血液凝固促进剂的个人或有机体。同样，本发明的受试者可以包括但不限于人和其他灵长类，如黑猩猩和其他猿类以及猴物种；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家养、野生和游戏禽类如小鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽类、鸭类、鹅类等。

在一些实施方式中，所述主题方法可以用来治疗出血障碍，如慢性或急性出血障碍，由出血因子缺乏引起的先天凝血障碍，后天凝血障碍和使用抗凝血剂。例如，出血障碍可以包括，但不限于血友病A，血友病B，冯维勒布兰德病，特发性血小板减少，缺乏一种或多种接触因子，如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，和高分子量激肽原(HMWK),缺乏一种或多种与临床大量出血相关的因子，如因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II(低凝血酶原血症)，和冯维勒布兰德因子,维生素K缺乏，纤维蛋白原障碍，包括脱纤维蛋白原血，低纤维蛋白原血，和异常纤维蛋白原血症，α₂-抗纤维蛋白溶酶缺乏,过度出血如由肝病，肾病，血小板减少，血小板功能障碍，血肿，内出血，关节积血，手术，创伤，体温过低，行经，和怀孕引起的。

在其他实施方式中，所述主题方法可以用来增强血液凝固以反转受试者的抗凝剂的作用。例如，所述受试者可以已经用抗凝剂处理过，所述抗凝剂包括，但不限于，肝素,香豆素衍生物，如华法林(warfarin)或双香豆素(dicumarol)，TFPI，AT III，狼疮抗凝剂，线虫抗凝肽(NAPc2)，活性位点阻断因子VIIa(因子VIIai)，因子IXa抑制剂，因子Xa抑制剂，包括磺达肝素(fondaparinux)，艾卓肝素(idraparinux)，DX-9065a，和雷扎沙班(razaxaban)(DPC906),因子Va和VIIIa的抑制剂，包括活化蛋白C(APC)和可溶血栓调节蛋白，凝血酶抑制剂，包括水蛭素(hirudin)，比伐卢定（bivalirudin），阿加曲班(argatroban)，和希美加群(ximelagatran)。在某些实施方式中，受试者的抗凝剂可以是结合凝结因子的抗体，包括但不限于，结合因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子XI，因子XII，冯维勒布兰德因子，前激肽释放酶,或高分子量激肽原(HMWK)的抗体。

本发明的方面包括联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂向受试者经口施用具有促凝血量的NASP的组合物以增强血液凝固。如上所述，本发明的NASP可以是天然NASP或合成NASP。在一些实施方式中，NASP是天然NASP。“天然”是指NASP从天然存在的来源发现或来源于其，如来自动物或植物来源并且涵盖宽范围的亚类，包括肝素，糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，岩藻依聚糖，角叉菜胶，多硫酸戊聚糖(pentosan polysulfate)，硫酸皮肤素(dermatansulfate)和硫酸葡聚糖(dextran sulfate)。在一些实施方式中，天然NASP可以提取自生物学来源。“生物学来源”是指天然存在的有机体或有机体的部分。例如，关注的NASP可以提取自植物、动物、真菌或细菌。尤其是，关注的NASP可以提取自可食用的海藻、褐藻类，棘皮动物(echinoderm)(例如，海胆，海参)等。可以采用任何方便的方案用于从生物学来源提取NASP。例如，在其他程序之中，所述NASP可以通过酸碱提取、酶降解、选择性沉积、过滤提取自生物学来源。用于从生物学来源如可食用海藻和褐藻提取和分离MASP的方法详细描述在2010年2月25日提交的临时未决美国专利申请序列No.12/449,712，将其公开内容通过引用以其整体结合于此。

在某些实施方式中，本发明的天然NASP包括但不限于N-乙酰基-肝素(NAH)，N-乙酰基-脱-O-硫酸化-肝素(NA-脱-o-SH)，脱-N-硫酸化-肝素(De-NSH)，脱-N-硫酸化-乙酰化-肝素(De-NSAH)，高碘酸盐氧化的肝素(POH)，化学硫酸化的昆布多糖(CSL)，化学硫酸化的海藻酸(CSAA)，化学硫酸化的果胶(CSP)，硫酸葡聚糖(DXS)，肝素衍生的寡糖(HDO)，多硫酸戊聚糖酯(PPS)及其组合。在一些情况下，NASP可以是天然存在的NASP的低分子量片段。在其他情况下，天然NASP还可以包括天然存在的NASP的生物化学或化学衍生物。在某些情况下，天然NASP是岩藻依聚糖。如以下更详细描述的，岩藻依聚糖是天然存在的复合硫酸多糖化合物，其可以提取自某些可食用的海藻、褐藻和棘皮动物(例如，海胆，海参)。如本文使用的，术语“岩藻依聚糖”是指提取自低硫酸酯聚合物的生物学来源的不同部分的组而不是单个化学实体。在某些情况下，本发明的岩藻依聚糖包括但不限于岩藻依聚糖GFS5508005，裙带菜，去热原的；岩藻依聚糖GFS5508004，裙带菜；岩藻依聚糖GFS5508003，裙带菜；岩藻依聚糖5307002，水疱墨角藻，最大MW峰值126.7kD；岩藻依聚糖VG49，水疱墨角藻，较低MW的5307002的水解样品，最大MW峰值22.5kD；岩藻依聚糖5308004，水疱墨角藻；岩藻依聚糖5308005，水疱墨角藻；岩藻依聚糖L/FVF1091，水疱墨角藻；岩藻依聚糖VG201096A，水疱墨角藻；岩藻依聚糖VG201096B，水疱墨角藻；岩藻依聚糖VG57，裙带菜，高电荷(高硫酸化，去乙酰化的)；岩藻依聚糖VG50，泡叶藻(Ascophyllum nodosum)，最大MW峰值149.7kD；及其组合。

合适的NASP的实例更详细地描述在于2005年5月27日提交的美国专利申请序列No.11/140,504，现在的美国专利No.7,767,654，以及于2011年1月13日提交的美国专利申请序列No.13/006,396，将它们的公开内容以其整体通过引用结合于此。

在其他实施方式中，NASP是合成NASP。“合成是”是指硫酸多糖是由人工方法(例如，化学合成)制备的部分或全部。例如，合成NASP可以是硫酸低聚物，如硫酸寡糖或脂族硫酸酯。在某些情况下，合成NASP是硫酸戊糖，硫酸己糖或硫酸环糊精。例如，合成NASP可以包括，但不限于硫酸麦芽五糖，硫酸β环糊精，硫酸6-羧基艾考糊精及其衍生物。

其他合适的合成NASP的实例更详细地描述在于2012年1月30日提交的美国临时专利申请序列No.61/592,554和于2012年1月30日提交的美国临时专利申请序列No.61/592,549中，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。

取决于所期望的NASP的效果和潜力，可以一起采用一种或多种NASP。例如，可以一起采用两种以上的NASP，如三种以上的NASP并且包括四种以上的NASP。在采用一种以上NASP的情况下，所有的NASP可以是天然NASP，所有NASP可以是合成NASP或其任意组合。在采用一种以上NASP的情况下，组合物中各种NASP的质量百分比可以变化，范围为组合物的总质量的1%以上，如2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上包括为包括组合物的总质量的50%以上。

在本发明的实施方式中，NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比可以变化，范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，NASP与胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在一些实施方式中，胃肠道上皮屏障渗透促进剂与NASP的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，胃肠道上皮屏障渗透促进剂与NASP的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。

NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂可以以任何顺序施用至受试者。在一些情况下，在经口施用肠道上皮屏障渗透促进剂之前，经口施用NASP。在其他情况下，在经口施用肠道上皮屏障渗透促进剂之后，经口施用NASP。在另外的其他情况下，联合经口施用肠道上皮屏障渗透促进剂，经口施用NASP。如果同时提供NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂二者，各自可以提供在相同或不同组合物中。在NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂同时施用的情况下，在将组合物施用至受试者之前，NASP可以与胃肠道上皮屏障渗透促进剂、凝血因子混合。可以使用任何方便的混合物，如通过干摇动、溶液或混悬液混合、工业混合物方案等。因此，NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂可以通过并行治疗的方式提供给个体。“并行治疗”是指施用至受试者使得NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合的治疗效果在进行治疗的受试者中引起。类似地，一种或多种NASP和一种或多种肠道上皮屏障渗透促进剂可以以至少一个治疗剂量经口施用。

可以施用NASP和胃肠上皮屏障渗透促进剂的任何合适的组合。在某些实施方式中，方法包括施用天然NASP(如上所述)与一种或多种胃肠上皮屏障渗透促进剂。在这些实施方式中，方法可以包括施用天然NASP与癸酸钠，脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖中的一种或多种的组合。在某些实施方式中，方法包括施用天然NASP与癸酸钠。例如，一种或多种裙带菜U.p.5508005和水疱墨角藻F.v.L/FVF1091可以与癸酸钠一起施用。在其他实施方式中，方法包括施用天然NASP与脱氧胆酸盐。例如，裙带菜U.p.5508005、水疱墨角藻F.v.L/FVF1091、水疱墨角藻F.v.DS1001108、水疱墨角藻F.v.SK110144B中的一种或多种可以与脱氧胆酸盐一起施用。在另外的其他实施方式中，方法包括施用天然NASP与菠萝蛋白酶。例如，裙带菜U.p.5508005、水疱墨角藻F.v.L/FVF1091、水疱墨角藻F.v.DS1001108、水疱墨角藻F.v.SK110144B中的一种或多种可以与菠萝蛋白酶一起施用。在另外的其他实施方式中，方法包括施用天然NASP与脱乙酰壳多糖。例如，裙带菜U.p.5508005、水疱墨角藻F.v.L/FVF1091、水疱墨角藻F.v.DS1001108、水疱墨角藻F.v.SK110144B中的一种或多种可以联合脱乙酰壳多糖施用。在另外的其他实施方式中，方法包括施用天然NASP与菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖(如上所述)的组合。例如，裙带菜U.p.5508005，水疱墨角藻F.v.L/FVF1091，水疱墨角藻F.v.DS1001108，水疱墨角藻F.v.SK110144B中的一种或多种可以与菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合一起施用。

在某些实施方式中，方法包括施用合成NASP(如上所述)与一种或多种胃肠上皮屏障渗透促进剂。在这些实施方式中，方法可以包括施用合成NASP与癸酸钠，脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖中的一种或多种的组合。在某些实施方式中，方法包括施用合成NASP与癸酸钠。例如，硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种可以与癸酸钠一起施用。在其他实施方式中，方法包括施用合成NASP与脱氧胆酸盐。例如，24kD硫酸6-羧基艾考糊精、14kD6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种可以与脱氧胆酸盐一起施用。在另外的其他实施方式中，方法包括施用合成NASP与菠萝蛋白酶。例如，24kD硫酸6-羧基艾考糊精、14kD6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种可以与菠萝蛋白酶一起施用。在另外的其他实施方式中，方法包括施用合成NASP与脱乙酰壳多糖。例如，24kD硫酸6-羧基艾考糊精、14kD6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种可以联合脱乙酰壳多糖施用。在另外的其他实施方式中，方法包括施用合成NASP与萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖(如上所述)的组合。例如，24kD硫酸6-羧基艾考糊精、14kD6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种可以与菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合一起施用。

在某些实施方式中，本发明的方面包括增强受试者的血液凝固，其通过向受试者经口施用含有促凝血量的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂联合凝血因子的组合物。例如，联合一种或多种凝血因子，受试者可以经口施用促凝血量的含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物，所述凝血因子包括但不限于因子XI，因子XII，前激肽释放酶，高分子量激肽原(HMWK)，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子VIIa，和冯维勒布兰德因子，因子Xa，因子IXa，因子XIa，因子XIIa，和VIIIa，前激肽释放酶，和高分子量激肽原，组织因子，因子VIIa，因子Va和因子Xa。

在将含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物与凝血因子一起经口施用至受试者的情况下，含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物以凝血因子的质量比可以变化，范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000，或其范围。例如，含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物与凝血因子的范围的质量比可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在一些实施方式中，凝血因子与含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，凝血因子与含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。

凝血因子以及含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物可以以任何顺序施用至受试者。在一些情况下，含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物在施用凝血因子之前经口施用。在其他情况下，含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物结合凝血因子经口施用。在另外的其他情况下，含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物在施用凝血因子之后经口施用。在含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物结合凝血因子经口施用的情况下，含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物可以在将组合物经口施用至受试者之前与凝血因子混合。可以使用任何方便的混合方案，如通过干摇动、溶液或混悬液混合、工业混合方案等。

本发明的方面包括用于治疗出血障碍的方法和组合物，其通过联合肠道上皮屏障渗透促进剂经口施用促凝血量的NASP。如本文中公开的，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，NASP可以单独施用(即，作为单个试剂)，或联合其他止血剂。如期望的，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，促凝血量的NASP可以用于治疗已被诊断为具有出血障碍的受试者，包括先天凝血障碍，后天凝固障碍，施用抗凝血剂，和创伤诱发的出血性障碍。

在一些情况下，受试者可以被诊断为具有血液凝结障碍，其包括但不限于血友病A，血友病B，冯维勒布兰德病，特发性血小板减少，缺乏一种或多种接触因子，如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，和高分子量激肽原(HMWK),缺乏一种或多种与临床大量出血相关的因子，如因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II(低凝血酶原血症)，和冯维勒布兰德因子，维生素K缺乏，纤维蛋白原障碍，包括脱纤维蛋白原血，低纤维蛋白原血，和异常纤维蛋白原血症，α₂-抗纤维蛋白溶酶缺乏，和过度出血如肝病，肾病，血小板减少，血小板功能障碍，血肿，内出血，关节积血，手术，创伤，体温过低，行经和怀孕引起的。

在其他情况下，受试者可以被诊断为具有血液凝结障碍，其包括由血液因子缺乏引起的先天凝血障碍或后天凝血障碍。例如，血液因子缺乏可能由缺乏一种或多种因子引起，包括但不限于，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子XI，因子XII，因子XIII和冯维勒布兰德因子。

在另外的其他情况下，受试者可以被诊断为具有由于向受试者施用抗凝剂导致的血液凝结障碍。例如，抗凝剂可以包括但不限于，肝素,香豆素衍生物，如华法林或双香豆素，组织因子途径抑制剂(TFPI)，抗凝血酶III，狼疮抗凝剂，线虫抗凝肽(NAPc2)，活性位点阻断因子VIIa(因子VIIai)，因子IXa抑制剂，因子Xa抑制剂，包括磺达肝素，艾卓肝素，DX-9065a，和雷扎沙班(DPC906),因子Va和VIIIa的抑制剂，包括活化蛋白C(APC)和可溶血栓调节蛋白，凝血酶抑制剂，包括水蛭素，比伐卢定，阿加曲班和希美加群。在某些实施方式中，抗凝剂可以是结合凝结因子的抗体，包括但不限于，结合因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子XI，因子XII，冯维勒布兰德因子，前激肽释放酶或高分子量激肽原(HMWK)的抗体。

在另外的其他情况下，本发明的方法包括一种抑制受试者的TFPI活性的方法。例如，方法可以进一步包括联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，向受试者以足以抑制受试者的TFPI活性的方式经口施用一定量的NASP。在某些情况下，联合胃肠上皮屏障渗透促进剂，促凝血量的NASP与包括TFPI的生物学样品(例如，血液血浆)组合并测量所述生物学样品的TFPI活性。在其他情况下，方法包括将促凝血量的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂与生物学样品组合，将TFPI添加到该组合物中并测量该生物学样品的TFPI活性。在某些情况下，生物学样品是血浆样品，如例如，正常血液血浆或因子VIII-抑制的血液血浆。

在所述本发明的方法中，用于增强受试者的血液凝固的方案可以变化，如例如由受试者的年龄、体重、血液凝结障碍的严重度、总体健康，以及施用的NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂的具体组成和浓度。在本发明的实施方式中，在经口施用并通过胃肠系统吸收后在受试者中获得的NASP的浓度可以变化，在一些情况下，范围为0.01nM至500nM。关注的NASP促凝血剂处于其最佳浓度。“最佳浓度”是指其中NASP表现出最高量的促凝血活性的浓度。因为许多NASP在比最佳浓度显著更高的浓度下也显示抗凝血活性，本发明的NASP在其最佳浓度范围内显示非-抗凝行为。同样，取决于NASP的潜力以及所需效果，由本发明方法提供的NASP的最佳浓度的范围可以为0.01nM至500nM，如0.1nM至250nM，如0.1nM至100nM，如0.1nM至75nM，如0.1nM至50nM，如0.1nM至25nM，如0.1nM至10nM，并且包括0.1nM至1nM。如通过关注的NASP的校准自动化的血栓扫描法(CAT)测定确定的，最佳浓度和活性水平更详细地描述在于2005年5月27日提交的美国专利申请序列No.11/140,504，现在的美国专利No.7,767,654，以及于2011年1月13日提交的美国专利申请序列No.13/006,396中，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。同样，在经口施用和通过胃肠系统吸收后在受试者中实现的肠道上皮屏障渗透促进剂的浓度可以变化，在一些情况下，范围为0.01nM至500nM。例如，取决于NASP的固有吸收性以及所需的效果，通过本发明方法提供的肠道上皮屏障渗透促进剂的浓度的范围可以为0.01nM至500nM，如0.1nM至250nM，如0.1nM至100nM，如0.1nM至75nM，如0.1nM至50nM，如0.1nM至25nM，如0.1nM至10nM，并且包括0.1nM至1nM。

因此，联合肠道上皮屏障渗透促进剂，含有关注的NASP的组合物的口服剂量可以变化，范围为约0.01mg/kg至500mg/kg/天，如0.01mg/kg至400mg/kg/天，如0.01mg/kg至200mg/kg/天，如0.1mg/kg至100mg/kg/天，如0.01mg/kg至10mg/kg/天，如0.01mg/kg至2mg/kg/天，包括0.02mg/kg至2mg/kg/天。在其他实施方式中，所述口服剂量的范围可以为0.01至100mg/kg四次/天(QID)，如0.01至50mg/kg QID，如0.01mg/kg至10mg/kg QID，如0.01mg/kg至2mg/kg QID，如0.01至0.2mg/kg QID。在其他实施方式中，所述口服剂量的范围可以为0.01mg/kg至50mg/kg三次/天(TID)，如0.01mg/kg至10mg/kg TID，如0.01mg/kg至2mg/kg TID，并且包括为0.01mg/kg至0.2mg/kg TID。在另外的其他实施方式中，所述口服剂量的范围可以为0.01mg/kg至100mg/kg两次/天(BID)，如0.01mg/kg至10mg/kg BID，如0.01mg/kg至2mg/kg BID，包括0.01mg/kg至0.2mg/kgBID。施用的化合物的量取决于特定NASP的潜力和浓度、所需的幅度或促凝血效果、NASP的固有吸收性，以及所需的胃肠吸收增强。

如上讨论的，依赖于医师的判断和受试者的需要，根据给药安排，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，如由本发明方法提供的含有NASP的组合物可以联合其他NASP、肠道上皮屏障渗透促进剂或其他治疗剂，如止血剂、血液因子或其他药物经口施用。同样，给药安排可以包括，但不限于施用五次/天，四次/天，三次/天，两次/天，一次/天，三次/周，两次/周，一次/周，两次/月，一次/月,及其任意组合。

在一些实施方式中，出血障碍可以是在延长时期内需要多个剂量的所述主题方法和组合物的慢性病症(例如，先天或后天凝固因子缺乏)。替代地，在相对较短时期内，例如一至两周，以单个或多个剂量，本发明的方法和组合物可以施用以治疗急性病症(例如，由接受凝血替代疗法的受试者的手术或创伤,或因子抑制剂/自身免疫发作引起的出血)。

在所述本发明的实施方式中，将向受试者施用一个或多个治疗有效的治疗周期。“治疗有效的治疗周期”是指当施用时，关于治疗导致大致所需治疗响应的治疗周期。例如，一个或多个治疗有效的治疗周期将如通过血液凝结测定(例如，CAT，aPTT，以下详细描述的)确定的血液凝结速率增大1%以上，如5%以上，如10%以上，如15%以上，如20%以上，如30%以上，如40%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，如95%以上，包括将血液凝块形成速率增大99%以上。在其他情况下，一个或多个治疗有效的治疗周期可以将血液凝块形成速率增大1.5-倍以上，如2-倍以上，如5-倍以上，如10-倍以上，如50-倍以上，包括将血液凝块形成速率增大100-倍以上。在一些实施方式中，通过本发明方法治疗的受试者表现出积极的治疗响应。“积极的治疗响应”是指受试者表现出在出血障碍的一个或多个症状方面的改善。例如，对由本发明提供的方法表现出积极的治疗响应的受试者可以包括但不限于这样的响应如缩短的血液凝结时间、减少的出血、减少的对于因子替代疗法的需要或其组合。在某些实施方式中，施用多于一个的治疗有效的治疗周期。

如上综述的，在实施根据某些实施方式的方法中，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，将具有促凝血量的NASP的组合物施用至受试者以增强受试者的血液凝固。可以采用任何方便的施用模式，只要所述组合通过胃肠上皮吸收。同样，施用模式可以包括经口施用或通过经鼻胃管(例如，饲管或NG-管)。如以下更详细地讨论的，本发明的药物组合物可以为液体溶液或混悬液、糖浆、片剂、胶囊、粉剂、凝胶或其任意组合的形式。联合凝血因子，在具有促凝血量的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物经口施用的情况下，如以上详细讨论的，用于NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂组分的施用模式可以与用于凝血因子的相同或不同。例如，在一些情况下，具有促凝血量的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物可以经口施用，而凝血因子可以局部地施加(例如，作为霜剂)。在其他情况下，具有促凝血量的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物以及凝血因子二者经口施用。

在某些实施方式中，本发明的方法提供用于预防地经口施用具有促凝血量的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物，如例如在计划的手术之前。所述组合可以根据需要预防地施用，如在计划程序之前一小时以上，如计划程序之前的10小时，如在计划程序之前24小时，并且包括在计划程序之前一周。在一些情况下，在计划程序之前或期间施用的组合物可以是持续释放的制剂(例如，持续锭剂或片剂)，如以下更详细描述的。

在某些实施方式中，本发明的组合物在用于治疗相关或不相关病症的其他药剂之前、同时或之后经口施用。如果与其他药剂同时提供，本发明的组合物可以提供在相同或不同组合物中。因此关注的NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂药剂其他药剂可以通过并行治疗的方式以口服剂型提供给个体。例如，格局特定口服给药方案，并行治疗可以通过施用本发明的组合物和具有至少一种其他药剂，如止血剂或凝固因子(例如FVIII或FIX)的药物组合物实现，其组合地包含治疗有效剂量。类似地，联合一种或多种肠道上皮屏障渗透促进剂，一种或多种NASP以及治疗剂可以在至少一个治疗剂量中施用。单独的药物组合物的施用可以同时在不同时间(即，相继地，以任一顺序，在同一天或在不同天)进行，只要在进行治疗的受试者中引起这些物质的组合的治疗效果。

组合物

本发明的方面还包括用于增强受试者的血液凝固的口服组合物。在本发明的实施方式中，联合肠道上皮屏障渗透促进剂，组合物包括促凝血量的NASP。组合物还包括促凝血量的NASP与胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合和凝血因子。如以上详细描述的，肠道上皮屏障渗透促进剂包括当经口施用时增加由胃肠系统吸收的NASP的量的化合物。此外，胃肠渗透促进剂也可以加速通过胃肠上皮的NASP吸收的启动(即，减少用于吸收开始的时间量)以及加速越过受试者的胃肠上皮的NASP的总体运输速率(即，减少用于通过胃肠系统的NASP吸收完成的时间量)。

如上解释的，肠道上皮屏障渗透促进剂可以增加由胃肠系统吸收的NASP的量。例如，与合适对照相比，肠道上皮屏障渗透促进剂可以将由胃肠系统吸收的NASP的量增加5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，如95%以上。在其他实施方式中，本发明的口服组合物中的肠道上皮屏障渗透促进剂加速通过胃肠上皮的NASP吸收的启动。例如，与合适对照相比，本发明的胃肠上皮屏障渗透促进剂可以将启动NASP吸收所需的时间量减少5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，如95%以上。在另外的其他实施方式中，本发明的口服组合物中的肠道上皮屏障渗透促进剂增大NASP的吸收速率。例如，与合适对照相比，肠道上皮屏障渗透促进剂可以将NASP的吸收速率增大2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如100%以上，如200%以上，包括500%以上。

在某些情况下，本发明的口服组合物中的胃肠上皮屏障渗透促进剂可以增大如通过Caco-2细胞模型确定的NASP的吸收。例如，与合适对照相比，本发明的肠道上皮屏障渗透促进剂可以将如通过Caco-2细胞模型确定的吸收增大2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如100%以上，如200%以上，包括500%以上。

如以上详细讨论的，联合一种或多种肠道上皮屏障渗透促进剂，本发明的口服组合物包括一种或多种NASP。关注的组合物中的肠道上皮屏障渗透促进剂可以变化。在一些实施方式中，肠道上皮屏障渗透促进剂是紧密连接调节剂。例如，本发明的口服组合物中的紧密连接调节剂可以包括，但不限于酶，胆酸，多糖，脂肪酸及其盐及其任意组合。

在一些情况下，紧密连接调节剂是多糖。例如，多糖紧密连接调节剂，在某些情况下可以是脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多糖，如上讨论的，是指通过壳多糖的N-脱乙酰化制备的2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-β-D-吡喃葡萄糖的线性共聚物。多糖紧密连接调节剂还可以包括脱乙酰壳多糖的衍生物如N-烷基脱乙酰壳多糖，乙酰化脱乙酰壳多糖,硫醇化脱乙酰壳多糖，磷酸脱乙酰壳多糖，脱乙酰壳多糖环糊精，N-(氨基烷基)脱乙酰壳多糖，琥珀酰脱乙酰壳多糖和辛酰基脱乙酰壳多糖等。

在其他情况下，紧密连接调节剂是胆酸。合适的胆酸紧密连接调节剂可以包括但不限于胆酸(胆酸盐)，脱氧胆酸(脱氧胆酸盐)，鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸盐)，熊脱氧胆酸(熊脱氧胆酸盐)，甘氨胆酸(甘氨胆酸盐)，牛磺胆酸(牛磺胆酸盐)和石胆酸(石胆酸盐)等。

在其他情况下，紧密连接调节剂是酶。例如，在本发明的某些组合物中，酶紧密连接调节剂是蛋白酶，如菠萝蛋白酶。

在另外的其他情况下，紧密连接调节剂是脂肪酸及其脂肪酸盐。本发明的组合物中的脂肪酸紧密连接调节剂可以变化，并且可以包括中链脂肪酸，如例如C8(辛酸盐)，C10(癸酸盐)和C12(月桂酸盐)脂肪酸及其脂肪酸盐中的任一种和组合。在某些情况下，例如，脂肪酸紧密连接调节剂是癸酸钠。

在某些实施方式中，本发明的口服组合物包括两种以上肠道上皮屏障渗透促进剂。例如，组合物可以包括两种以上紧密连接调节剂，如三种以上紧密连接调节剂，包括四种以上紧密连接调节剂。组合物可以包括紧密连接调节剂的任意组合，如例如，在其他组合中，多糖和蛋白酶,脂肪酸和多糖,多糖和胆酸,多糖、脂肪酸和胆酸，两种不同的多糖或两种不同的胆酸。在其中组合物包括一种以上的肠道上皮屏障渗透促进剂的情况下，各种胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量百分比可以变化，范围为组合物的总质量的1%以上，如2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上并且包括组合物的总质量的50%以上。

在某些情况下，本发明的组合物包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶。在所述组合物包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合的情况下，脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的质量比可以变化，范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在一些实施方式中，菠萝蛋白酶与脱乙酰壳多糖的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，菠萝蛋白酶与脱乙酰壳多糖的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。

在本发明的组合物包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合的情况下，脱乙酰壳多糖的浓度也可以变化，范围为约0.1%至约5%，如约0.15%至约4.5%，如0.2%至约4%，如约0.25%至约3.5%，如0.3%至约3%，如0.5%至约2.5%，包括约0.5%至1.5%。同样，在采用脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合的情况下，在某些实施方式中，菠萝蛋白酶的浓度也可以变化，范围为约0.01mg/mL至约1.0mg/mL，如约0.2mg/mL至约0.9mg/mL，如0.25mg/mL至约0.75mg/mL，如约0.3mg/mL至约0.6mg/mL，包括约0.4mg/mL至约0.5mg/mL。在某些情况下，脱乙酰壳多糖的浓度为约3%并且菠萝蛋白酶的浓度为约0.5mg/mL。

如上所述，本发明的口服组合物的NASP是显示促凝血活性的硫酸多糖。NASP的非-抗凝性可以使用凝结测定，包括在因子VIII和/或因子IX缺乏血浆中的校准自动化的血栓记录法(CAT)，稀促凝血酶时间(dPT)或活化部分凝血活酶时间(aPTT)凝结测定确定。非抗凝血活性的一种测定是比较所讨论的NASP与已知的抗凝剂肝素。例如，NASP可以表现出三分之一或更低的，如十分之一或更低的未分级肝素(MW的范围为8,000至30,000；平均18,000道尔顿)的抗凝血活性(通过凝结时间的统计学显著性增加测量的)。因此，使用本文中详述的各种凝结测定中的任一种，NASP可以显示相比于肝素至少低两倍的抗凝血活性，如相比于肝素低二至五倍或更低的抗凝血活性，并且包括相比于肝素低2至10倍或更低的抗凝血活性。

在一些实施方式中，联合肠道上皮屏障渗透促进剂，本发明的口服组合物包括天然NASP。如上讨论的，天然NASP可以是从天然存在的来源发现或来源于其的NASP，如来自动物或植物来源并且可以涵盖宽范围的亚类，包括肝素的衍生物、糖胺聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜胶、多硫酸戊聚糖、硫酸皮肤素和硫酸葡聚糖。在一些实施方式中，本发明的天然NASP提取自生物学来源。“生物学来源”是指天然存在的有机体或有机体的部分。例如，关注的NASP可以提取自植物、动物、真菌或细菌。尤其是，关注的NASP可以提取自可食用海藻、褐藻、棘皮动物(例如，海胆，海参)等。例如，NASP可以通过酸碱提取、酶降解、选择性沉积、过滤程序等而提取自生物学来源。天然NASP如提取自生物学来源的那些，包括但不限于可食用海藻和褐藻，详细描述在于2010年2月25日提交的共同未决美国专利申请序列No.12/449,712中，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。

在某些实施方式中，本发明的天然NASP包括但不限于N-乙酰基-肝素(NAH)，N-乙酰基-脱-O-硫酸化-肝素(NA-脱-o-SH)，脱-N-硫酸化-肝素(De-NSH)，脱-N-硫酸化-乙酰化-肝素(De-NSAH)，高碘酸盐氧化的肝素(POH)，化学硫酸化的昆布多糖(CSL)，化学硫酸化的海藻酸(CSAA)，化学硫酸化的果胶(CSP)，硫酸葡聚糖(DXS)，肝素衍生的寡糖(HDO)，多硫酸戊聚糖酯(PPS)及其组合。在一些情况下，NASP可以是天然存在的NASP的低分子量片段。在其他情况下，天然NASP也可以包括天然存在的NASP的生物化学或化学衍生物。在某些情况下，天然NASP是岩藻依聚糖。如上所述，岩藻依聚糖是天然存在的复合硫酸多糖化合物，其可以提取自某些可食用海藻、褐藻和棘皮动物(例如，海胆，海参)。合适的NASP的实例还更详细地描述在于2005年5月27日提交的美国专利申请序列No.11/140,504，现在的美国专利No.7,767,654以及于2011年1月13日提交的美国专利申请序列No.13/006,396中，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。

关注的NASP的平均分子量的范围可以为约10道尔顿至约500,000道尔顿，如约100道尔顿至约300,000道尔顿，如1000道尔顿至250,000道尔顿，包括1000道尔顿至150,000道尔顿。NASP的分子量可以通过任何方便的方案确定，如例如，尤其是凝胶渗透色谱或高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)、毛细管电泳法、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、琼脂凝胶电泳。

在一些实施方式中，关注的NASP可以是具有不同分子量的硫酸多糖的异质混合物。例如，在一些情况下，5%以上的NASP组成的分子量的范围为10至30,000道尔顿，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，包括95%以上的NASP组成的分子量的范围为10至30,000道尔顿。在其他实施方式中，5%以上的NASP组成的分子量的范围为30,000道尔顿至75,000道尔顿，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，包括95%以上的NASP组成的分子量的范围为30,000至75,000道尔顿。在另外的其他实施方式中，5%以上的NASP组成的分子量大于75,000道尔顿，如10%以上，如25%以上，如50%以上，如75%以上，如90%以上，包括95%以上的NASP组成的分子量大于75,000道尔顿。

在某些实施方式中，低分子量NASP可以用于增强血液凝固，如通过本发明的方法和组合物提供的。“低分子量NASP”是指NASP的重均分子量的范围为约10至30,000道尔顿，如例如100至30,000道尔顿，如500至25,000道尔顿，如1000至15,000道尔顿并且包括5000至10,000道尔顿。低分子量NASP的实例可以包括，但不限于天然存在的或合成NASP，其分子量范围为10至30,000道尔顿，如5000至10,000道尔顿，通过酸或酶水解更大分子量NASP产生的较大分子量NASP的片段，或可以是来自分级NASP样品的分子量范围为10至30,000道尔顿，如5000至10,000道尔顿的分离级分。

在某些实施方式中，本发明的组合物包括胃肠上皮屏障渗透促进剂(例如，癸酸钠，脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶或脱乙酰壳多糖)和低分子量天然NASP。例如，联合胃肠上皮屏障渗透促进剂，关注的组合物可以包括分子量为20,000道尔顿以下的水疱墨角藻岩藻依聚糖。例如，联合脱氧胆酸盐、菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖中的一种或多种，关注的组合物可以包括水疱墨角藻F.v.DS1001108、水疱墨角藻F.v.SK110144B中的一种或多种。在另一个实例中，联合脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的混合物，关注的组合物可以包括水疱墨角藻F.v.DS1001108、水疱墨角藻F.v.SK110144B中的一种或多种。在某些其他实施方式中，本发明的组合物包括胃肠道上皮屏障渗透促进剂(例如，癸酸钠，脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶或脱乙酰壳多糖)和低分子量合成NASP。例如，联合肠道上皮屏障渗透促进剂，某些组合物可以包括分子量为25,000道尔顿以下的硫酸6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种。例如，联合脱氧胆酸盐、菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖中的一种或多种，关注的组合物可以包括24,000道尔顿硫酸6-羧基艾考糊精、14,000道尔顿硫酸6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种。在另一个实例中，联合脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的混合物，关注的组合物可以包括24,000道尔顿硫酸6-羧基艾考糊精、14,000道尔顿硫酸6-羧基艾考糊精、硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖中的一种或多种。

在一些实施方式中，NASP提取自生物学来源并且可以被分级以分离低分子量NASP(即，分子量范围为10-30,000道尔顿的NASP的级分)。可以使用任何方便的方案来对关注的NASP分级，包括但不限于尺寸排阻色谱法，凝胶渗透色谱法、毛细管电泳等。

在某些情况下，通过分级NASP样品获得的低分子量NASP可以用于增强血液凝固，如通过本发明的方法和组合物提供的。例如，提取自生物学来源的NASP可以被分级以分离分子量范围为10至30,000道尔顿，如10至5000道尔顿，如5000至10,000道尔顿，如10,000至15,000道尔顿，并且包括15,000至30,000道尔顿的NASP。在某些实施方式中，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，这些级分中的一种或多种可以经口施用用于增强受试者的血液凝固，如通过上述的方法。

在某些实施方式中，不同分子量级分可以通过酸水解或自由基解聚高分子量NASP制备。所得产物的分子量范围可以基于所采用的水解或解聚条件的严格性进行调整。然后级分可以使用离子交换色谱法进一步纯化。例如，为了获得中等或低分子量的NASP级分，高分子量NASP可以使用浓度范围为0.02至1.5M的酸如如HCl(或任何其他合适的酸)并且在温度范围为25℃至80℃下进行水解。水解反应时间典型的范围为15分钟至若干小时。所得水解反应混合物然后通过添加碱(例如，氢氧化钠)中和。随后除去盐，例如，通过电渗析，并且使用用于碳水化合物分析的常规分析技术，分析水解产物以确定重均分子量、糖含量和硫含量。替代地，可以采用酶方法来降解NASP，使用例如糖苷酶。用于本发明的NASP可以是异质的或同质的，这取决于采用的分离程度。

在某些实施方式中，本发明的口服组合物包括凝血因子，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂和岩藻依聚糖，如例如，岩藻依聚糖5307002，水疱墨角藻，最大MW峰值126.7kD；岩藻依聚糖VG49，水疱墨角藻，较低MW的5307002的水解样品，最大MW峰值22.5kD；岩藻依聚糖VG57，裙带菜，高电荷(高硫酸化，去乙酰化的)；岩藻依聚糖GFS(5508005)，裙带菜，去热原的；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01091)，水疱墨角藻，去热原的，最大MW峰值125kD；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01092)，水疱墨角藻，去热原的，最大MW峰值260kD；岩藻依聚糖GFS(L/FVF-01093)，水疱墨角藻，水解去热原的，最大MW峰值36kD；

边花昆布提取物；

Ecklonia maxima提取物；

巨藻提取物；

免疫试验岩藻依聚糖混合物；及其任意组合。

在其他实施方式中，联合肠道上皮屏障渗透促进剂，本发明的口服组合物可以包括合成NASP。合成NASP是硫酸多糖，其通过人工方法(例如，化学合成)产生的部分或全部。例如，合成NASP可以是硫酸低聚物，如硫酸寡糖或脂族硫酸酯。在某些情况下，合成NASP是硫酸戊糖，硫酸己糖或硫酸环糊精。例如，合成NASP可以包括，但不限于硫酸麦芽五糖，硫酸β环糊精，硫酸6-羧基艾考糊精及其衍生物。

本发明的口服组合物可以根据需要包括一种或多种NASP。例如，可以组合两种以上的NASP，如三种以上的NASP并且包括四种以上的NASP。在将一种以上的NASP组合在一起的情况下，所有的NASP可以是天然NASP，所有的NASP可以是合成NASP或其任意组合。在口服组合物包括一种以上的NASP的情况下，组合物中的各种NASP的质量百分比可以变化，范围为组合物的总质量的1%以上，如2%以上，如5%以上，如10%以上，如25%以上并且包括组合物的总质量的50%以上。

在本发明的实施方式中，口服组合物中一种或多种NASP和一种或多种肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比可以变化，范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，NASP与胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在一些实施方式中，胃肠道上皮屏障渗透促进剂与NASP的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，胃肠道上皮屏障渗透促进剂与NASP的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。

另外，本发明的口服组合物也可以包括一种或多种凝血因子。例如，组合物可以包括一定量的一种或多种NASP和一种或多种肠道上皮屏障渗透促进剂，联合一种或多种凝血因子。关注的凝血因子包括但不限于因子XI，因子XII，前激肽释放酶，高分子量激肽原(HMWK)，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子VIIa，和冯维勒布兰德因子，因子Xa，因子IXa，因子XIa，因子XIIa，和VIIIa，前激肽释放酶，和高分子量激肽原，组织因子，因子VIIa，因子Va，和因子Xa。

关注的口服组合物中的NASP、胃肠道上皮屏障渗透促进剂和凝血因子中每一种的量(即，质量)可以变化，范围为0.001mg至1000mg，如0.01mg至500mg，如0.1mg至250mg，如0.5mg至100mg，如1mg至50mg，包括1mg至10mg。同样，在主题组合物中，NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂与凝血因子的质量比可以变化，并且在一些情况下，范围可以为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂与凝血因子的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。在一些实施方式中，凝血因子与NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的质量比的范围为1:1至1:2.5；1:2.5至1:5；1:5至1:10；1:10至1:25；1:25至1:50；1:50至1:100；1:100至1:150；1:150至1:200；1:200至1:250；1:250至1:500；1:500至1:1000,或其范围。例如，凝血因子与含有NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂的组合物的质量比的范围可以为1:1至1:10；1:5至1:25；1:10至1:50；1:25至1:100；1:50至1:500;或1:100至1:1000。

口服组合物可以是均质的，仅含有单一类型的NASP和单一类型的胃肠上皮屏障渗透促进剂。在其他实施方式中，关注的组合物是两种以上NASPs或两种以上胃肠上皮屏障渗透促进剂的异质混合物。例如，异质混合物可以含有两种以上NASP和两种以上胃肠上皮屏障渗透促进剂。在其他情况下，异质混合物可以含有一种NASP和两种以上胃肠上皮屏障渗透促进剂。在另外的其他情况下，异质混合物可以含有两种以上NASP和一种胃肠上皮屏障渗透促进剂。

在某些实施方式中，本发明的口服组合物可以进一步包括一种或多种药用赋形剂或口服递送媒介物作为药物组合物的一部分。赋形剂可以包括可以包括，但不限于，碳水化合物，无机盐，抗菌剂，抗氧化剂，表面活性剂，水，醇，多元醇，甘油，植物油，磷脂，缓冲剂，酸，碱，及其任意组合。也可以采用碳水化合物如糖，衍生化糖如糖醇，糖醛酸，酯化糖和/或糖聚合物。关注的一些碳水化合物赋形剂包括例如单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、糊精、淀粉等；和糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇(lactitol)、木糖醇、山梨糖醇(普糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇，肌醇等。无机盐可以包括，但不限于柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其任意组合。

在某些实施方式中，本发明的口服组合物也可以包括用于防止或抑制微生物生长的抗菌剂，如例如苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙基醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)，及其任意组合。

还可以采用一种或多种抗氧化剂。抗氧化剂，其可以减少或防止组合物的氧化及由此的劣化，可以包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯(ascorbylpalmitate)、丁羟茴醚、丁羟甲苯，次磷酸，硫代甘油(monothioglycerol)、没食子酸丙酯，亚硫酸氢钠，甲醛次硫酸钠，偏亚硫酸氢钠及其任意组合。

一种或多种表面活性剂也可以包含在本发明的组合物中。例如，合适的表面活性剂可以包括，但不限于聚山梨醇酯，如"Tween20"和"Tween80,"以及普流罗尼类(pluronics)如F68和F88(BASF，Mount Olive，New Jersey)；脱水山梨糖醇酯；脂质，如磷脂如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选不是脂质体形式)，脂肪酸和脂肪酯；甾醇，如胆固醇；螯合剂；如EDTA；和锌及其他阳离子。

酸或碱也可以存在于本发明的口服组合物中。例如，酸可以包括但不限于盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其任意组合。碱的实例包括但不限于氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸镓，及其任意组合。

口服组合物中任何个体赋形剂的量将根据赋形剂的性质和功能、口服递送媒介物和组合物的特定需要而变化。典型地，任何个体赋形剂的最佳量通过常规实验，即通过制备含有变化量的赋形剂(范围为低至高)的组合物、检查稳定性和其他参数，然后确定在没有显著有害作用下获得最佳性能的范围来确定。然而，一般地，赋形剂在口服组合物中存在的量为约1%至约99%重量，如约5%至约98%重量，如约15至约95%重量的赋形剂，包括少于30%重量。药物赋形剂连同在关注的组合物中可以采用的其他赋形剂描述在"Remington:The Science&Practice of Pharmacy"，19th ed.，Williams&Williams，(1995)，the"Physician’s Desk Reference"，52nd ed.，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbook ofPharmaceutical Excipients，3rd Edition，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中，将其公开内容通过引用结合于此。

如上所述，本发明的组合物可以通过任何方便的施用模式施用，只要所述组合物通过胃肠上皮吸收(例如，经口或通过鼻胃管)。同样，制剂可以变化。例如，本发明的组合物可以为可以在使用前用溶剂重建的粉剂或冻干物、用于在使用前与媒介物组合的干不溶组合物，以及用于施用前稀释的乳液和液体浓缩物。用于重建固体组合物的稀释剂可以包括，但不限于注射用抑菌水、在水中的葡萄糖5%、磷酸缓冲盐水、林格溶液(Ringer's solution)、盐水、无菌水、去离子水，及其任意组合物。在一些实施方式中，本发明的药物组合物可以为用于通过鼻胃管摄取或施加的液体溶液或混悬液、糖浆、片剂、胶囊、粉末、凝胶或其任意组合的形式。例如，本发明的口服组合物可以预先加载到片剂、胶囊、囊剂装置等中，这取决于所需的用途。在某些实施方式中，所述组合物在单位剂型中，使得所述组合物的量准备在单个口服剂量中，为预测量或预包装形式。

应用

所述主题方法和组合物可用于这样的任何情形，其中期望增强受试者的血液凝固、期望增强NASP通过胃肠系统的吸收并且受试者对用NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂的治疗是响应性的。在某些实施方式中，所述主题方法和组合物可以用来治疗出血障碍，如慢性或急性出血障碍，由出血因子缺乏引起的先天凝血障碍，后天凝血障碍以及使用抗凝血剂。例如，出血障碍可以包括，但不限于血友病A，血友病B，冯维勒布兰德病，特发性血小板减少,缺乏一种或多种接触因子，如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，和高分子量激肽原(HMWK),缺乏一种或多种与临床大量出血相关的因子，如因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II(低凝血酶原血症)，和冯维勒布兰德因子，维生素K缺乏，纤维蛋白原障碍，包括脱纤维蛋白原血，低纤维蛋白原血，和异常纤维蛋白原血症，α₂-抗纤维蛋白溶酶缺乏，以及过度出血如由肝病，肾病，血小板减少，血小板功能障碍，血肿，内出血，关节积血，手术，创伤，体温过低，行经和怀孕引起的。

所述主题方法和组合物还可用于增强血液凝固以治疗由血液因子缺乏引起的先天凝血障碍或后天凝血障碍。血液因子缺乏可以由缺乏一种或多种因子，包括但不限于，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子XI，因子XII，因子XIII和冯维勒布兰德因子所引起。

所述主题方法和组合物还可用于增强血液凝固以在治疗出血障碍中改善止血，如与取法凝固因子相关的那些，或用于反转受试者的抗凝血剂的影响。例如，通过本发明的方法和组合物增强血液凝固可以用来治疗出血障碍如先天凝血障碍，后天凝固障碍，和由创伤诱发的出血性障碍。可以用NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂治疗的出血障碍的实例包括，但不限于，血友病A，血友病B，冯维勒布兰德病，特发性血小板减少,缺乏一种或多种接触因子，如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，和高分子量激肽原(HMWK)，缺乏一种或多种与临床大量出血相关的因子，如因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II(低凝血酶原血症)，和冯维勒布兰德因子，维生素K缺乏，纤维蛋白原障碍，包括脱纤维蛋白原血，低纤维蛋白原血，和异常纤维蛋白原血症，α₂-抗纤维蛋白溶酶缺乏，和过度出血如由肝病，肾病，血小板减少，血小板功能障碍，血肿，内出血，关节积血，手术，创伤，体温过低，行经，和怀孕引起的。在某些实施方式中，本发明的方法和组合物用来治疗先天凝血障碍，包括血友病A，血友病B，和冯维勒布兰德病。在其他实施方式中，NASP用来治疗后天凝固障碍，包括缺乏因子VIII，冯维勒布兰德因子，因子IX，因子V，因子XI，因子XII和因子XIII，尤其是由针对凝血因子的抑制剂或自身免疫性引起的障碍，或由导致减少凝固因子合成的疾病或病症引起的止血障碍。

在一些实施方式中，出血障碍可以是在延长时期内需要多个剂量的所述主题方法和组合物的慢性病症(例如，先天或后天凝固因子缺乏)。替代地，本发明的方法的组合物可以在相对较短时期，例如一至二周内以单个或多个剂量经口施用以治疗急性病症(例如，接受凝固替代疗法的受试者的由手术或创伤、或因子抑制剂/自身免疫发作引起的出血)。

所述主题方法和组合物还可用于增强经过手术或侵入性程序的受试者的血液凝固。

所述主题方法和组合物还可用于增强血液凝固以反转抗凝剂在受试者中的作用，所述方法包括联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，向受试者施用治疗有效量的包含促凝血量的NASP的组合物。在某些实施方式中，受试者可以已用抗凝剂治疗，包括，但不限于，肝素，香豆素衍生物，如华法林或双香豆素，TFPI，AT III，狼疮抗凝剂，线虫抗凝肽(NAPc2)，活性位点阻断因子VIIa(因子VIIai)，因子IXa抑制剂，因子Xa抑制剂，包括磺达肝素，艾卓肝素，DX-9065a，和雷扎沙班(DPC906)，因子Va和VIIIa的抑制剂，包括活化蛋白C(APC)和可溶血栓调节蛋白，凝血酶抑制剂，包括水蛭素，比伐卢定，阿加曲班，和希美加群。在某些实施方式中，受试者中的抗凝剂可以是结合凝结因子的抗体，包括但不限于，结合因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子XI，因子XII，冯维勒布兰德因子，前激肽释放酶,或高分子量激肽原(HMWK)的抗体。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗经过其中期望改善血液凝结的手术或侵入性程序的受试者的方法，所述方法包括联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，向受试者经口施用治疗有效量的如本文详细描述的包含促凝血量的NASP的组合物。在某些实施方式中，NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂可以与一种或多种不同的NASP和一种或多种不同的肠道上皮屏障渗透促进剂,和/或联合一种或多种其他治疗剂共同施用至经过手术或侵入性程序的受试者。例如，受试者可以施用治疗有效量的一种或多种选自由以下各项组成的组中的因子：因子XI，因子XII，前激肽释放酶，高分子量激肽原(HMWK)，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子VIIa，和冯维勒布兰德因子。治疗可以进一步包括施用促凝血剂，如内在凝固途径的激活剂，包括因子Xa，因子IXa，因子XIa，因子XIIa，和VIIIa，前激肽释放酶，和高分子量激肽原;或外在凝固途径的激活剂，包括组织因子，因子VIIa，因子Va，和因子Xa。用来治疗经过手术或侵入性程序的受试者的治疗剂可以在相同或不同组合物中并且在施用NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂的同时、之前或之后施用。

如上所公开的，还可以采用止血剂、血液因子和药物。例如，受试者可以施用一种或多种凝血因子，如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，高分子量激肽原(HMWK)，因子V，因子VII，因子VIII，因子IX，因子X，因子XIII，因子II，因子VIIa，冯维勒布兰德因子，因子Xa，因子IXa，因子XIa，因子XIIa，和VIIIa，前激肽释放酶，和高分子量激肽原，组织因子，因子VIIa，因子Va，和因子Xa。

试剂盒

还提供了用于实施主题方法的试剂盒，其中所述试剂盒可以包括一种或多种上述组合物，例如，NASP组合物,胃肠道上皮屏障渗透促进剂组合物和/或凝血因子，如上所述。所述试剂盒可以进一步包括其他组分，例如，施用装置、流体源等，其可以用于实施主题方法。各种组分可以如所需地包装，例如一起或单独地包装。

除了上述组分外，主题试剂盒可以进一步包括用于将所述试剂盒的组分用来实施主题方法的说明书。用于实施主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以打印如在纸或塑料等上。同样，说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中，在试剂盒及其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关)等。在其他实施方式中，说明书作为存在于合适计算机可读存储介质例如CD-ROM，软磁盘等上的电子存储数据文件存在。在另外的其他实施方式中，实际的说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于从远程资源获得说明书的手段，例如经由互联网。这种实施方式的实例是包括网址的试剂盒，在哪里说明书可以阅读和/或可以从其下载说明书。如同说明书一样，这种用于获得说明书的手段记录在合适基底上。

实验

提供以下实施例仅用于举例说明的目的，而不用来以任何方式限制本发明的范围。

已经努力确保关于所使用的数值(例如，量，温度等)的准确性，但是一些实验误差和变差当然应该被允许。

联合肠道上皮屏障渗透促进剂，NASP的生物利用度和吸收研究

联合关注的肠道上皮屏障渗透促进剂，NASP的生物利用度使用CaCo-2细胞模型筛选进行研究。这种方法利用表达在其细胞膜上宽范围的转运蛋白的人结肠癌细胞系。细胞层在分成两个隔室的膜表面上生长(24-孔板)。用于这些实验的实验装置的实例如图1所示。所选的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂样品以1mg/mL的浓度溶解在RPMI细胞培养基中，并施加到在顶端隔室中的细胞上。细胞在37℃在5%CO₂中温育。在不同时间点从底外侧和顶端隔室移出培养基样品。通过测量跨上皮细胞电阻(TEER)监控细胞层的状况。通过凝血酶传代测定(CAT)分析样品。基于来自CAT测定的活性计算NASP浓度。凝血酶传代测定和其他学院凝固测定的实验细节描述在与2005年5月27日提交的美国专利申请序列No.11/140,504，现在的美国专利No.7,767,654以及于2011年1月13日提交的美国专利申请序列No.13/006,396中，将其公开内容通过引用结合于此。

所有的NASP和胃肠道上皮屏障渗透促进剂样品以样品浓度在增大促凝血活性的范围内的方式进行稀释。基于初始加载浓度值，顶端和底外侧浓度以2小时增量(例如，2小时，4小时，6小时，8小时，包括24小时)确定。基于所确定的底外侧浓度，对化合物(即，NASP和肠道上皮屏障渗透促进剂)的每种组合确定吸收百分比。

本文中描述的吸收研究的一个实例显示在表1-3中，这些表概括了联合肠道上皮屏障渗透促进剂，在Caco-2细胞模型中NASP，岩藻依聚糖F.v.1091，菠萝蛋白酶(0.5mg/mL)的顶端(apical)和底外侧(basolateral)浓度。表1显示联合菠萝蛋白酶，F.v.L/FVF1091的开始顶端浓度为约840μg/mL。在约8小时之后，F.v.L/FVF1091的顶端浓度降低约25%至平均为约627μg/mL。

表1:

表2示出了在不同时间处，联合菠萝蛋白酶，F.v.L/FVF1091的底外侧浓度。图2显示在Caco-2系统中在菠萝蛋白酶(0.5mg/mL)存在下的F.v.L/FVF1091的底外侧浓度。图3显示如通过每个试验的对应跨上皮细胞电阻曲线测量的，细胞层的状况。

表2:

表3示出了在不同时间点处在菠萝蛋白酶存在下F.v.L/FVF1091的吸收百分比(%)。

表3:

基于表2和3，在8小时，1联合菠萝蛋白酶，平均吸收为19mg/mL的F.v.L/FVF109并且证实F.v.L/FVF1091的底外侧浓度在肠道上皮屏障渗透促进剂菠萝蛋白酶存在下随时间增大。

表4是在各种浓度的若干胃肠上皮屏障渗透促进剂存在下在Caco-2细胞模型中天然NASP的吸收百分比的概括。如表4中所示，所有的天然NASP显示在关注的胃肠上皮屏障渗透促进剂存在下增大的吸收。

表4:

表5是在各种浓度的若干胃肠上皮屏障渗透促进剂存在下在Caco-2细胞模型中合成NASP的吸收百分比的概括。如表5中所示，所有的合成NASP显示在关注的胃肠上皮屏障渗透增强剂存在下增大的吸收。

表5:

图4-8示出了联合不同的肠道上皮屏障渗透促进剂，如通过TGA和液相色谱/质谱法确定的，在Caco-2细胞模型中一些关注的天然NASP的吸收。图9和10示出了联合不同的肠道上皮屏障渗透促进剂，如通过TGA和液相色谱/质谱法确定的，在Caco-2细胞模型中一些关注的合成NASP的吸收。

图4a-b示出了在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及存在菠萝蛋白酶、脱乙酰壳多糖及存在菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合下，在Caco-2细胞模型中的NASP、BAX513吸收。如图4a-b所示，BAX513的底外侧浓度在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下增大，表明BAX513的吸收在联合肠道上皮屏障渗透促进剂施用时增大。

图5a-c示出了在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及存在若干不同的肠道上皮屏障渗透促进剂癸酸钠，脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶，脱乙酰壳多糖下及存在菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合下，在Caco-2细胞模型中的NASP、岩藻依聚糖F.v.L/FVF1091吸收。图5a-c显示在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下岩藻依聚糖F.v.L/FVF1091的底外侧浓度增大，表明当联合肠道上皮屏障渗透促进剂施用时，岩藻依聚糖F.v.L/FVF1091的吸收增大。尤其是，当在脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合存在下施用时，岩藻依聚糖F.v.L/FVF1091的吸收显著增大。

图6a-b显示在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及在存在肠道上皮屏障渗透促进剂癸酸钠，脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶，脱乙酰壳多糖下及在存在菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合下，在Caco-2细胞模型中的NASP、岩藻依聚糖U.p.5508005吸收。图6a-b显示在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下岩藻依聚糖U.p.5508005的底外侧浓度增大，表明当联合肠道上皮屏障渗透促进剂施用时，岩藻依聚糖U.p.5508005的吸收增大。尤其是，在癸酸钠，菠萝蛋白酶存在下以及在脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合存在下，岩藻依聚糖U.p.5508005的吸收显著增大。

图7a-b示出了在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及在存在肠道上皮屏障渗透促进剂脱氧胆酸盐(在两种不同浓度下)，菠萝蛋白酶，脱乙酰壳多糖下及在存在菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合下，在Caco-2细胞模型中的NASP，岩藻依聚糖FvF DS1001108B吸收。图7a-b显示在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下岩藻依聚糖FvF DS1001108B的底外侧浓度增大，表明当联合肠道上皮屏障渗透促进剂施用时，岩藻依聚糖FvF DS1001108B的吸收增大。尤其是，当在脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合存在下施用时，岩藻依聚糖FvF DS1001108B的吸收显著增大。

图8a-b显示在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及在肠道上皮屏障渗透促进剂脱氧胆酸盐(在不同浓度)，菠萝蛋白酶，脱乙酰壳多糖存在下和在菠萝蛋白酶和脱乙酰壳多糖的组合存在下，在Caco-2细胞模型中NASP、岩藻依聚糖FvF SK110144B吸收。图8a-b证实，在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下岩藻依聚糖FvF SK110144B的底外侧浓度增加，表明当施用联合肠道上皮屏障渗透促进剂时，岩藻依聚糖FvF SK110144B的吸收增加。尤其是，在0.08%脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶存在下和在脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合存在下，岩藻依聚糖FvF SK110144B的吸收显著增加。

图9和14显示在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及在肠道上皮屏障渗透促进剂脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶和癸酸钠存在下在Caco-2细胞模型中合成NASP、硫酸β-环糊精吸收。图9证实在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下硫酸β-环糊精的底外侧浓度增大，表明当施用联合肠道上皮屏障渗透促进剂时，硫酸β-环糊精的吸收增大。尤其是，在8小时在所有三种脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶和癸酸钠存在下，硫酸β-环糊精的吸收显著增加。

图10和15显示在没有任何胃肠道上皮屏障渗透促进剂下以及在肠道上皮屏障渗透促进剂脱氧胆酸盐，菠萝蛋白酶，脱乙酰壳多糖和癸酸钠存在下，在Caco-2细胞模型中的合成NASP、硫酸麦芽五糖吸收。图10证实，在肠道上皮屏障渗透促进剂存在下，硫酸麦芽五糖的底外侧浓度增大，表明，当施用联合肠道上皮屏障渗透促进剂时，硫酸麦芽五糖的吸收增大。尤其是，在8小时在脱氧胆酸盐和菠萝蛋白酶存在下，硫酸麦芽五糖的吸收显著增大。在脱乙酰壳多糖和癸酸钠存在下，硫酸麦芽五糖还显示增大的吸收。

如图4-10所示，天然和合成NASP的底侧浓度在各种肠道上皮屏障渗透促进剂存在下增大，表明相比于没有肠道上皮屏障渗透促进剂，当施用联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂时，NASP的吸收增大。

图11a-b举例说明当采用脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合，联合NASP岩藻依聚糖F.v.L/FVF1091(图11a)和岩藻依聚糖FvF DS1001108B(图11b)时，不同浓度的脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的影响。尤其是，脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶的组合物包括0.3%脱乙酰壳多糖和0.5mg/ml菠萝蛋白酶；1.5%脱乙酰壳多糖和0.25mg/mL菠萝蛋白酶；3%脱乙酰壳多糖和0.05mg/mL菠萝蛋白酶；以及3%脱乙酰壳多糖和0.5mg/mL菠萝蛋白酶。如图10a-b所示，3%脱乙酰壳多糖和0.5mg/mL菠萝蛋白酶的组合证实NASP的最强吸收。

表6是在Caco-2细胞模型中天然和合成NASP的百分比吸收的总结。如表4中所示，所有的NASP证实在关注的胃肠道上皮屏障渗透促进剂存在下吸收增加。

表6

图12a-b和13a-c显示，当分别用硫酸β-环糊精和硫酸麦芽五糖测试时，在有或没有肠道上皮屏障渗透促进剂下，如通过跨上皮细胞电阻测量的细胞层的状况。如图12a-b所示，在硫酸β-环糊精存在下，胃肠道上皮屏障渗透促进剂菠萝蛋白酶显著地降低跨上皮细胞电阻值(<300ohms/cm²)。在添加新鲜介质后，跨上皮细胞电阻值保持较低。然而，单独用胃肠道上皮屏障渗透促进剂处理导致跨上皮细胞电阻恢复。同样，如图13a-c所示，在硫酸麦芽五糖存在下，肠道上皮屏障渗透促进剂菠萝蛋白酶，脱氧胆酸盐和脱乙酰壳多糖显著地降低跨上皮细胞电阻值。然而，与用于硫酸β-环糊精的如图12a-b所示的研究相反，在除去胃肠道上皮屏障渗透促进剂和麦芽五糖后，跨上皮细胞电阻增大。

尽管为了清楚理解的目的，前述发明已通过举例说明和实施例在一定详细地进行了描述，但是依照本发明的教导，对于本领域技术人员来说明显的是，在没有背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些变化和改变。

因此，前述仅是举例说明本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种安排，尽管没有在本文中具体描述或显示，其具体体现本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文中所叙述的实施例和附条件语言原则上意图有助于读者理解本发明的原理以及由发明人对现有技术进一步作出的贡献的构思，并且将被解释为对这样具体叙述的实施例和条件没有限制作用。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方式以及其具体实施例的所有陈述意图涵盖其结构和功能等同替换。另外地，意图这样的等同替换包括目前已知的等同替换和在将来开发的等同替换，即开发的实施相同功能的任何要素，而与结构无关。因此，本发明的范围不意图现有本文中所显示和描述的实施方式。相反，本发明的范围和精神通过所附权利要求体现。

Claims

1.一种增强受试者的血液凝固的方法，所述方法包括：

以足以增强所述受试者的血液凝固的方式，联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，向所述受试者经口施用促凝血量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中向所述受试者施用的所述NASP的量的范围为0.01mg/kg至约100mg/kg。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述NASP是天然或合成的NASP。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述NASP是选自由以下各项组成的组中的天然NASP：N-乙酰基-肝素(NAH)、N-乙酰基-脱-O-硫酸化-肝素(NA-脱-o-SH)、脱-N-硫酸化-肝素(De-NSH)、脱-N-硫酸化-乙酰化-肝素(De-NSAH)、高碘酸盐氧化的肝素(POH)、化学硫酸化的昆布多糖(CSL)、化学硫酸化的海藻酸(CSAA)、化学硫酸化的果胶(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、多硫酸戊聚糖酯(PPS)和岩藻依聚糖、及其组合。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述NASP选自由以下各项组成的组中的合成NASP：硫酸低聚物、硫酸戊糖、硫酸己糖或硫酸环糊精。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述胃肠道上皮屏障渗透促进剂是选自由以下各项组成的组中的紧密连接调节剂：蛋白酶、胆酸、多糖、脂肪酸及其盐、及其组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述紧密连接调节剂选自由以下各项组成的组：菠萝蛋白酶或其酶组分、脱氧胆酸盐、脱乙酰壳多糖、癸酸钠或其组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述胃肠道上皮屏障渗透促进剂包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种选自由以下各项组成的组中的因子：因子XI、因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、冯维勒布兰德因子、组织因子、因子VIIa、因子Va、和因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa、和VIIIa。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者：

(a)具有选自以下各项组成的组中的出血障碍：慢性或急性出血障碍、由出血因子缺乏引起的先天凝血障碍、和后天凝血障碍;或

(b)由于抗凝剂施用前而需要增强的血液凝固；或

(c)由于手术或其他侵入性程序而需要增强的血液凝固。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法是抑制所述受试者的TFPI活性的方法。

12.一种口服组合物，包含：

(a)促凝血量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)；

(b)肠道上皮屏障渗透促进剂；和

(c)口服递送媒介物；

其中所述口服组合物为单位剂型。

13.根据权利要求12所述的口服组合物，其中所述胃肠道上皮屏障渗透促进剂是选自由以下各项组成的组中的紧密连接调节剂：蛋白酶、胆酸、多糖、脂肪酸及其盐、及其组合。

14.根据权利要求13所述的口服组合物，其中所述紧密连接调节剂选自由以下各项组成的组：菠萝蛋白酶或其酶组分、脱氧胆酸盐、脱乙酰壳多糖、癸酸钠或其组合。

15.根据权利要求15所述的口服组合物，其中所述胃肠道上皮屏障渗透促进剂包括脱乙酰壳多糖和菠萝蛋白酶。