CN103833564B - L-鸟氨酸谷氨酸复盐及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学、生物化学和医药领域，公开了L‑鸟氨酸谷氨酸复盐及其制备方法和应用。该L‑鸟氨酸谷氨酸复盐的结构式如式（I）所示。该L‑鸟氨酸谷氨酸复盐可用于制备治疗因急慢性肝病所致的高血氨症的药物，特别适用于制备因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状解除的药物及肝昏迷抢救的药物。制备方法简单易于操作且收率高，成本低，环境污染小，便于工业化生产，晶形完善，粒度较大，结晶效果好。

Description

L-鸟氨酸谷氨酸复盐及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学、生物化学和医药领域，涉及L-鸟氨酸谷氨酸复盐及其制备方法和应用。具体涉及L-鸟氨酸谷氨酸复盐及其晶体的制备方法以及L-鸟氨酸谷氨酸复盐在制备治疗因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状解除药物及肝昏迷抢救药物中的应用。

背景技术

肝是人体最大的腺体，具有代谢、凝血、免疫、胆汁生成等功能。人体肝功能损害可导致体内氨代谢紊乱，造成体内高血氨状态，氨对生物体是有毒物质，特别是高等动物的脑对氨极为敏感，血液中1%的氨就可引起中枢神经系统中毒，人类氨中毒症状表现为语言紊乱，视力模糊，机体发生一种特有的震颤，甚至昏迷或死亡。氨对中枢神经系统的危害的机制目前尚未完全阐明，一般认为，氨进入脑细胞后，可与脑中的α-酮戊二酸结合生成谷氨酰胺，而α-酮戊二酸是三羧酸循环中的重要中间产物，三羧酸循环是体内糖酯类及蛋白质分解代谢的共同途径，是释放能量的重要环节，α-酮戊二酸的消耗必然导致三羧酸循环的减弱，从而使脑组织中ATP的生成减少，引起大脑功能障碍。

鸟氨酸作为尿素循环的反应底物，迅速激活肝细胞内的尿素循环，将机体病态下产生的有害的二氧化碳及氨通过尿素排出体外，使得肝脏内酶代谢逐步恢复，从而使得肝脏的活力得到恢复，起到保肝、护肝的作用。另外，当肝功能受损而不能正常代谢氨时，过高的氨浓度会激活大脑中尿素循环的进行，鸟氨酸的摄入可加速其反应的进行，快速清除脑内氨态氮，从而避免氨对脑中枢神经的损害。

谷氨酸是脑内含量最多的氨基酸，它在中枢神经的突触传递中起着递质的作用。谷氨酸进入脑细胞后，可在谷氨酸脱羧酶的作用下迅速转化成γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸是另一种神经递质，谷氨酸与γ-氨基丁酸协同作用，使脑中枢神经递质保持平衡；其次，它可经谷氨酸脱氢酶或转氨形成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是三羧酸循环的中间产物，生成的α-酮戊二酸可促使三羧酸循环产生ATP，从而为脑组织提供能量。另外，谷氨酸还可与氨结合变成成谷氨酰胺，进一步降低氨的有毒水平，谷氨酰胺随血液循环运到肾脏随尿排出。

目前市场上尚未有将L-鸟氨酸谷氨酸复盐用于治疗因急慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎所致的高血氨症，特别是用于治疗因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状的解除及肝昏迷的抢救，也没有一种能够适于工业化生产的L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶体的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明以L-鸟氨酸发酵液为原料，提出了一种新的反应与结晶耦合制备L-鸟氨酸谷氨酸复盐的方法。

本发明的另一目的是提供L-鸟氨酸谷氨酸复盐的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种结构式如式（1）的L-鸟氨酸谷氨酸复盐：

式（1）

所述L-鸟氨酸谷氨酸复盐的晶型，该晶型的参数包括以下特征：

X-粉末衍射法：在2θ=5.5，16.52，24.9，27.72度处有主峰，在2θ=11，17.82，22.1，30.02，32.68，33.28，40.92度处有较弱的峰；

红外光谱法：在3010.484cm^-1、2939.128cm^-1、1641.206cm^-1、1586.278cm^-1、1494.635cm^-1、1411.707cm^-1处有较大吸收峰；

热重/差示扫描量热（TG/DSC）法：熔点温度为229.4℃。

所述的L-鸟氨酸谷氨酸复盐或者所述L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶型的制备方法，该方法为耦合反应结晶方法，包括以下步骤：

在20～30℃下，取游离L-鸟氨酸水溶液，然后向其中加入谷氨酸粉末，恒温搅拌20～30min使反应完全，加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种，30～60min后加入溶析剂，然后将溶液温度降至5～15℃，恒温30～60min，将得到的悬浮液过滤、洗涤、干燥，得到L-鸟氨酸谷氨酸复盐结晶产品。溶析剂经过分离可循环使用。

所述的制备方法，其中游离L-鸟氨酸水溶液的浓度为45.1～53.2g/L。

所述的制备方法，其中游离L-鸟氨酸水溶液可以采用L-鸟氨酸发酵液为原料，经膜过滤、连续离交、脱色等过程处理获得（万红贵,陆彬,朱庆平等.L-鸟氨酸的制备及应用[J].生物加工过程，2008,6（1），12-16），另外还可以通过化学合成（如：George A K,Orinda,Richard J W,et al.Ornithine synthesis[P].US:3168588,1965-2-2.）、酶反应（如：Makryaleas K,Drauz K.Method for the preparation of salts of L-ornithine[P].US:5405761,1995-4-11.焦庆才,李加友,曹瑜等.固定化酶法制备L-鸟氨酸的方法[P].CN:166102,2005-8-31.）、L-鸟氨酸盐脱盐（如：离子交换树脂对L-鸟氨酸盐酸盐脱盐）等方法中的任意一种或多种获得游离L-鸟氨酸水溶液。

L-鸟氨酸发酵液的获得可以采用现有技术中任何微生物发酵法制备得到，常见的可以下列菌株进行微生物发酵得到：①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的瓜氨酸缺陷(Cit^-)或精氨酸缺陷(Arg^-)突变株；②乳酸发酵短杆菌、川崎短杆菌(Brevibacterium kawasaki)、柠檬酸节杆菌(Arthrobacter citreus)等的Arg^-突变株^[21]；③大肠杆菌、枯草杆菌、产气气杆菌、帕特介里变形杆菌(Proteus retigeri)的Arg^-突变株；④解烃棒杆菌(C.hydrocarbodastue)和一种石蜡节杆菌(A.pataffineus)的Arg^-突变株；⑤洁白链霉菌(Steptomyces virginiae)的Lys^-和硫胺素^-双重缺陷突变株。优选采用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)1006（保藏号：CGMCC No.3663，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏）（见文献CN101955901A记载）。

所述的制备方法，其中加入的谷氨酸与游离L-鸟氨酸的摩尔比为0.9～1.1:1。形成L-鸟氨酸谷氨酸复盐溶液的pH为6.5～8。

所述的制备方法，其中溶析剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈、丙酮中的一种或多种，溶析剂用量是游离L-鸟氨酸水溶液体积的1～3倍。

所述的制备方法，其中L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种加入量是加入谷氨酸质量的1～4%。

所述的制备方法，其中干燥条件是：温度20～30℃，真空度0.08～0.1MPa。

所述的L-鸟氨酸谷氨酸复盐或所述的L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶型在制备治疗急慢性肝病所致的高血氨症的药物中的应用；以及在制备因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状解除药物及肝昏迷抢救药物中的应用。所述急慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎。

本发明的有益效果：

（1）本发明采用游离L－鸟氨酸与谷氨酸进行反应制备L-鸟氨酸谷氨酸复盐，尤其是以L-鸟氨酸发酵液为原料，可将L-鸟氨酸的发酵生产与L-鸟氨酸谷氨酸复盐的制备相偶联，有效缩短流程，减少排放，节省制备成本。

（2）本发明采用反应与结晶耦合的方法制备L-鸟氨酸谷氨酸复盐，所有过程均在反应结晶器中进行，大大提高生产效率和设备利用率。结晶产品为不聚结的白色柱状晶体，纯度可达99.0%～99.6%，晶形完善，粒度较大，结晶效果好。

（3）由于L-鸟氨酸难以作为结晶获得，一般以其盐酸盐的形式存在，而L-鸟氨酸盐酸盐含有过量的氯离子，病人易产生高氯性酸中毒，另外，L-鸟氨酸盐酸盐具有苦味。本发明将L-鸟氨酸制成L-鸟氨酸谷氨酸复盐，有效克服了L-鸟氨酸盐酸盐在使用过程中的不足，且所制得的L-鸟氨酸谷氨酸复盐无异味，能更好，更安全地应用于医学临床。

（4）本发明所提供的L-鸟氨酸谷氨酸复盐稳定性及水溶性较谷氨酸都好，提高了药品的生物利用度，且便于药品的储存，同时该盐水溶液的pH接近人体pH，减少了刺激。

（5）本发明L-鸟氨酸谷氨酸复盐兼具谷氨酸和L-鸟氨酸的生理功效，二者协同作用增强了药效，可以迅速修复受损肝细胞，有效清除血氨并为机体细胞提供能量，改善肝脑功能。可用于制备治疗因急慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎所致的高血氨症的药物，特别适用于制备因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状解除的药物及肝昏迷抢救的药物。

（6）本发明所提供的制备方法收率高，成本低，产品质量稳定，环境污染小，易于进行大规模工业生产。

附图说明

图1为L-鸟氨酸谷氨酸复盐的热重/扫描量热（TG/DSC）图

图2为L-鸟氨酸谷氨酸复盐的X-粉末衍射（XPRD）图

图3为L-鸟氨酸谷氨酸复盐的扫描电镜（SEI）图

图4为L-鸟氨酸谷氨酸复盐的红外光谱（IR）图

图5为反应结晶装置图。

其中：1.量筒，2.蠕动泵，3.数显电动搅拌机，4.超级水浴锅，5.三角烧瓶，6.谷氨酸粉末与晶种加入口。

具体实施例

下面通过具体实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

先将L-鸟氨酸发酵液（如按文献CN101955901A中实施例1或2的方法得到的发酵液）经膜过滤，连续离交，脱色等过程进行预处理，得游离L-鸟氨酸水溶液，并将其浓缩至浓度为48g/L，取100ml倒入反应结晶器（如图5所示，下同），然后向其中投入5.31g谷氨酸粉末，25℃恒温搅拌25min使反应完全，加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种0.1g，搅拌养晶30min，滴加150ml乙醇。然后降温至10℃，恒温0.5h。将得到的悬浮液抽滤，洗涤，20℃、真空度0.08MPa干燥5小时，得到白色柱状L-鸟氨酸谷氨酸复盐的晶体。经测定其纯度为99.2%，收率为93.6%。

实施例2

L-鸟氨酸盐酸盐经脱氯得游离L-鸟氨酸水溶液，减压浓缩至游离L-鸟氨酸浓度为46g/L，取100ml倒入反应结晶器，然后向其中投入5.14g谷氨酸粉末，22℃恒温搅拌30min使反应完全，加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种0.08g，搅拌养晶45min，滴加200ml甲醇。然后降温至8℃，恒温0.5h。将得到的悬浮液抽滤，洗涤，30℃、真空度0.08MPa干燥4小时，得到白色柱状L-鸟氨酸谷氨酸复盐的晶体。经测定其纯度为99.3%，收率为95.6%。

实施例3

先将L-鸟氨酸发酵液（如按文献CN101955901A中实施例1或2的方法得到的发酵液）进行预处理（预处理方法同实施例1），得游离L-鸟氨酸水溶液，并将其浓缩至浓度为46g/L，取150ml倒入反应结晶器，然后向其中投入7.1g谷氨酸粉末，20℃恒温搅拌20min使反应完全，加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种0.2g，搅拌养晶45min，滴加300ml丙酮。然后降温至10℃，恒温0.5h。将得到的悬浮液抽滤，洗涤，20℃真空度0.08MPa干燥3小时，得到白色柱状L-鸟氨酸谷氨酸复盐的晶体。经测定其纯度为99.4%，收率为94.8%。

实施例4

先将L-鸟氨酸发酵液（如按文献CN101955901A中实施例1或2的方法得到的发酵液）进行预处理（预处理方法同实施例1），得游离L-鸟氨酸水溶液，并将其浓缩至浓度为50g/L，取100ml倒入反应结晶器，然后向其中投入5.56g谷氨酸粉末，30℃恒温搅拌25min使反应完全，加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种0.15g，搅拌养晶45min，滴加300ml异丙醇。然后降温至10℃，恒温0.5h。将得到的悬浮液抽滤，洗涤，25℃真空度0.08MPa干燥3小时，得到白色柱状L-鸟氨酸谷氨酸复盐的晶体。经测定其纯度为99.1%，收率为96.4%。

试验实施例1：热重/差示扫描量热（TG/DSC）法

对实施例1制备的晶体，进行热重/差示扫描量热（TG/DSC）分析，检测条件是：升温速率10℃/min；升温范围30～320℃；氮气流速30mL/min；检测结果见图1.从图1可知：L-鸟氨酸谷氨酸复盐的熔点温度为229.4℃。

试验实施例2：X-粉末衍射法

对实施例1制备的晶体，进行X-射线粉末衍射检测，检测条件是：X-射线源；C_u Kα₁（波长为工作电压：40KV；工作电流强度：40mA；扫描角度：3～45°；（2-theta）步长值：0.05°；扫描速度：1秒/步，检测结果见图2。从图2可知：晶体特征X-射线粉末衍射花样在2-theta角2θ=5.5，16.52，24.9，27.72度处有主峰，而在2θ=11，17.82，22.1，30.02，32.68，33.28，40.92度处有较弱的峰。

试验实施例3：扫描电镜法

对于实施例1制备的晶体，应用扫描电镜进行检测，放大倍数为1500倍，检测结果见图3。从图3可见，其晶形为长柱状，粒径在5～10_μm范围内。

试验实施例4：红外光谱法

对于实施例1制备的晶体，进行红外光谱检测，检测结果见图4，从图4可知在波数为3010.484cm^-1、2939.128cm^-1、1641.206cm^-1、1586.278cm^-1、1494.635cm^-1、1411.707cm^-1处有较大吸收峰。

水溶性的测定：

25℃下，向装有10ml蒸馏水的磨口三角瓶中逐次加入1～2mg的L-鸟氨酸谷氨酸复盐，并不断搅拌，直至L-鸟氨酸谷氨酸复盐不再溶解，记录下所加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐的质量，结果发现L-鸟氨酸谷氨酸复盐的水溶性有了很大的改善，其溶解度为10.25g/100ml水（谷氨酸在水溶液中的溶解度仅为0.83g/100ml水）。

水溶液pH的测定：

将5gL-鸟氨酸谷氨酸复盐溶于100ml水中，用精密pH计测定其pH为7，与人体生理pH接近。

水溶液稳定性测定：

分别配制5mg/mlL-鸟氨酸谷氨酸复盐水溶液，室温下，避光静置30天，再用HPLC进行跟踪测定，未发现有水解产物或其他分解产物。

实施例5：L-鸟氨酸谷氨酸复盐对轻微型肝性脑病的作用研究

1、实验材料：成年健康Wistar雄性大鼠83只，体重270-300g。

2、轻微型肝性脑病大鼠模型和急性肝性脑病大鼠模型的制备：购入的实验大鼠在实验室适应饲养一周，按称重顺序编原始号，随机取出10只作为空白对照组，给予鼠料喂食，自来水饮用。其余73只大鼠则给予含10%猪油高脂饲料喂食，4%乙醇溶液为饮料，并用40%的CCl₄橄榄油溶液背部皮下注射诱导肝纤维化，首次0.5ml/100g，之后每次0.3ml/100g，每隔3天一次，连续注射9周，此时73只造模组中大鼠有17只死亡，剩下的56只食欲明显下降，活动减少，不活泼。全部大鼠尾静脉取血检测血氨浓度，随机选取40只分为模型对照组、L-鸟氨酸谷氨酸复盐（按实施例1制备）低剂量组(8mg/Kg)，中剂量组(16mg/Kg)，高剂量组(24mg/Kg)，阳性药物组（乳果糖6g/Kg）。并且剩下的16只大鼠，以内毒素3mg/Kg做腹腔注射诱导急性肝性脑病的发生。

3、行为学实验

3.1开场实验

开场箱（长100cm，宽100cm，高50cm，底面积划分为面积相等的10cm×10cm正方形100个格子敞箱）。末次给药后1h进行，让大鼠在敞箱适应2min，为减少对实验的干扰，观察并记录3min内大鼠的水平、垂直活动次数，即爬行格子数和站立次数。

3.2Morris水迷宫实验

Morris水迷宫设置：直径为130cm，高50cm的圆形水池，水深30cm，水温保持在（26±1）℃，水内倒入适量墨汁并混匀。池壁上有象征四个象限的不同标志，分别为SW、NW、SE、NE，在NW象限中央离池壁33cm处放置一9cm²、高29cm的透明平台，站台浸没于水下2cm。水池周围贴有丰富的参照线索供大鼠用来定位平台。训练期间迷宫外参照物保持不变，且迷宫上装有摄像头，大鼠行程被其记录下来。

Morris水迷宫实验：实验共进行5天，第一天让大鼠自由游泳2分钟，从第二天起，每天上午8点和下午4点进行训练，每个时间段训练4次，大鼠面向池壁按顺序分别从4个入水点放入池中，观察大鼠寻找并爬上平台的情况。每次大鼠到达平台后，在平台上休息30s。第5天最后一次训练，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间（潜伏期）。如果在120s内大鼠仍未能找到平台，则将其引导到平台，潜伏期记为120s

4、给药：CCl₄诱发轻微型肝性脑病大鼠模型建成后，空白对照组、模型对照组灌胃蒸馏水，给药组灌胃受试药物，1次/d，每周称1次体重，根据体重调整相应的给药量。所有组分均喂饲普通饲料，连续造模，并预防给药9周。

5、观测指标：大鼠行为学实验后，3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心分离血清，测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血氨（Amm）值，同时取肝右叶1g左右，做肝组织切片检查。

6、结果

a)大鼠行为学结果

在造模9周时发现模型组大鼠自主活动明显减少，开场实验中水平活动格数明显减少（P<0.01），经12周给予L-鸟氨酸谷氨酸复盐和阳性药物的治疗，各组大鼠分别有0，4，2，1，0，1只大鼠死亡，而给予L-鸟氨酸谷氨酸复盐高剂量和阳性药物两组大鼠的自主活动有显著影响（P<0.01，P<0.05），见表1。

同样，大鼠Morris水迷宫寻台实验中，从各组大鼠空间学习记忆参数的比较发现，与空白对照组相比，造模9周时模型对照组的寻台潜伏期明显延长（P<0.01）。经12周给予L-鸟氨酸谷氨酸复盐高剂量和阳性药物的治疗，两组大鼠寻台潜伏期明显比模型组缩短（P<0.05），见表2。

表1L-鸟氨酸谷氨酸复盐对大鼠水平和垂直方向活动的影响

表2各组的平均逃避潜伏期

Morris水迷宫是神经生物学研究动物空间学习记忆功能常用的模型工具。能够较准确的反应实验动物的空间、记忆、定向及定位能力的变化。目前大脑海马部位突触传递效能的长时增强现象被公认为记忆的突触可塑性模式，是行为、学习、记忆的神经元机制。本实验中造模9周时模型对照组的寻台潜伏期明显延长，说明这些实验大鼠学习记忆、空间认知存在明显的障碍，而经过L-L-鸟氨酸谷氨酸复盐的治疗，实验大鼠学习记忆功能有所改善，间接说明L-L-鸟氨酸谷氨酸复盐对轻微型肝性脑病有一定的治疗作用。

b)L-鸟氨酸谷氨酸复盐对大鼠血氨（Amm）影响

由表3可见，与正常组相比，模型组大鼠血清中Amm的水平明显升高（P<0.05）。尽管肝性脑病的发生机制十分复杂，但高血氨的重要致病作用已得到广泛认可，表明本模型较成功的模拟了轻微肝性脑病的基本症状。与模型组相比，治疗组能显著的降低Amm值（P<0.05），实验大鼠精神状态明显好转且呈现剂量依赖性。

表3：各组大鼠血氨比较

c)L-鸟氨酸谷氨酸复盐对大鼠肝功能的影响

血清中的ALT和AST可以反应肝脏功能。本实验采用经典的CCl₄连续给药模式，使实验大鼠形成肝纤维化动物模型，其与人类所患该疾病症状相似，病变形成明显的纤维化，造模方法简单易行，死亡率低。CCl₄诱发肝纤维化模型建成后，模型对照组ALT、AST明显高于正常对照组（P<0.05），说明CCl₄诱发肝纤维化模型造模成功，肝脏有明显的损害。并且连续观察该模型，经过9周的CCl₄连续灌胃，实验大鼠运动量明显减少，部分出现昏迷状态。而经过L-鸟氨酸谷氨酸复盐给药，给药组ALT、AST有明显降低，说明L-鸟氨酸谷氨酸复盐能明显降低大鼠ALT、AST，与模型组对比，差异有极其显著的意义（P<0.01），其结果见表4。

表4：各组大鼠肝功能变化情况

d)各组大鼠肝脏组织病理表现

解剖发现，模型对照组大鼠肝脏普遍肿大，表面较粗糙，肝细胞较疏松，有较粗的颗粒，部分细胞怀素，肝小叶结构模糊不清，有数个大小不等的假小叶形成；空白对照组大鼠肝脏未见异常。事实证明肝硬化模型成功建立。

本实验借助化学试剂CCl₄，诱导轻微型肝性脑病的发生，其作为一种选择性的肝毒性药物，可以引起肝小叶内中央静脉周围细胞坏死，导致纤维增生。业内人士一般认为肝脏病理学检查是诊断肝硬化的金标准，所以本实验在实验结束后也进行了病理组织切片观察，结果显示CCl₄诱导后的大鼠肝脏组织结构改变，假小叶形成，说明肝硬化模型建立成功。并且我们通过观察建模后的大鼠行为学实验，发现模型组大鼠自主活动明显减少、寻台潜伏期明显延长，说明这些实验大鼠学习记忆、空间认知存在明显的障碍，大脑海马部位受到损伤。并且模型组ALT、AST、Amm值均有所上升，证明本实验轻微型肝性脑病模型成功建立。

实施例6：L-鸟氨酸谷氨酸复盐、L-鸟氨酸及谷氨酸钠对轻微型肝性脑病的作用比较

实验用动物为成年健康Wistar雄性大鼠50只，体重270-300，除留下8只为空白对照组外，其余42只均按例5的方法在大鼠背部皮下注射40%的CCl₄橄榄油溶液诱导轻微型肝性脑病大鼠。经9周造模，死亡10只，剩下32只分为CCl₄组、CCl₄/L-鸟氨酸谷氨酸复盐组、CCl₄/L-鸟氨酸组、CCl₄/谷氨酸钠组，每组8只。其中空白对照组、CCl₄组灌胃蒸馏水，CCl₄/L-鸟氨酸谷氨酸复盐组、CCl₄/L-鸟氨酸组、CCl₄/谷氨酸钠组分别喂食剂量为24mg/kg/d的L-鸟氨酸谷氨酸复盐组、24mg/Kg/d L-鸟氨酸以及6g/Kg/d谷氨酸钠12周。给药结束后，各组还剩下大鼠8、4、8、7、7只，随后3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心分离血清，测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血氨（Amm）值，并评价其疗效结果。

表5两组治疗前后肝功能、血氨比较

从实验结果可以看出，CCl₄组ALT、AST、Amm明显高于空白对照组（P<0.05），说明CCl₄诱发肝纤维化模型造模成功，肝脏有明显的损害。并且连续观察该模型，经过L-鸟氨酸谷氨酸复盐、L-鸟氨酸、谷氨酸钠给药，各个给药组ALT、AST、Amm值均有所降低降低，CCl₄/L-鸟氨酸谷氨酸复盐组能明显降低大鼠ALT、AST，Amm值，且与CCl₄组对比，差异有极其显著的意义（P<0.01）。而CCl₄/L-鸟氨酸组和CCl₄/谷氨酸钠单独使用虽然也能降低大鼠ALT、AST，Amm值，但与CCl₄组对比，差异没有显著的意义（P>0.05）。究其原因可能是在单独使用时，虽然L-鸟氨酸作为尿素循环的反应底物，迅速激活肝细胞内的尿素循环，将机体病态下产生的有害的二氧化碳及氨通过尿素排出体外，使得肝脏内酶代谢逐步恢复，从而使得肝脏的活力得到恢复，起到保肝、护肝的作用，但是由于缺少了作为兴奋性神经递质的谷氨酸参与，昏迷的大鼠很难清醒。而单独使用谷氨酸钠时，但在没有L-鸟氨酸的参与下，其很容易造成机体碱血症、电解质平衡被打破以及低血钾，并且少尿、尿闭或肾功能减退者更加不能服用。而用L-鸟氨酸谷氨酸复盐时，可以克服以上单独使用的弊端，相辅相成。并且L-鸟氨酸谷氨酸复盐在胃里迅速分解为离子态的L-鸟氨酸和L-谷氨酸，在肠胃吸收效果好，能很好的缓解机体的病症。

实施例7：L-鸟氨酸谷氨酸复盐对急性肝性脑病救治

本实验以例5中的空白对照大鼠继续作空白，为了便于实验的观察，在例5实验中选取剩下的CCl₄诱导后的轻微型肝性脑病大鼠体内注射内毒素3mg/Kg诱导急性肝性脑病，在注射后的2小时，发现该16只大鼠行动变迟缓；2.5小时出现部分昏迷，个别有全身颤动，身体蜷缩，疼痛刺激反应弱；6小时全部昏迷。

1、治疗方法：将16只大鼠随机分为治疗组合和对照组，治疗组强制灌胃高剂量L-鸟氨酸谷氨酸复盐12mg/Kg/d，每天一次；对照组也强制灌胃乳果糖6g/Kg/d，每天一次，密切观察2周。

2、观察指标

给药结束后，3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心分离血清，测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血氨（Amm）值，并评价其疗效结果。

3、结果

a）两组治疗前后生化指标比较

表6两组治疗前后肝功能、血氨比较

从实验结果可以看出，轻微型肝性脑病动物，机体对不良刺激敏感，注射小剂量的内毒素应激反应十分明显，实验动物血氨、肝功能指标明显迅速飙升。经过两周的治疗后，治疗组和对照组的ALT值、AST值和Amm值都大大高于正常空白组，但相比治疗前有显著差异（P<0.05）。虽然治疗组ALT值、AST值和Amm值均未达到正常水平，但比对照组疗效要好多了。

b）两组治疗前后存活率比较

分组给药期间，治疗组和对照组分别有1只和4只大鼠死亡，其余大鼠均逐渐恢复意识，治疗组和对照组早期存活率分别为75%（6/8），对照组为50%（4/8），两组比较有显著差异（P<0.05）。

肝性脑病（hepatic encephalopathy，HE）又称肝昏迷，是指严重的肝病引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经系统的功能紊乱临床综合症，常见于终末期肝硬化。目前关于肝昏迷发病机理的学说有好几种，但每一种学说都不能单独完全解释肝昏迷的机理。其中，氨中毒学说是其发病机理的一个重要学说。在严重的肝脏疾病下，体内血氨增加，肝和肾清除氨的能力降低，直接增加大脑的氨承受负荷，干扰脑内能量代谢。在去氨过程中，消耗大量辅酶ATP、谷氨酸、α-酮戊二酸，并生成大量的谷氨酰胺。在血氨增加时，铵离子可以取代钾离子，直接影响钠离子和钾离子在神经细胞膜的正常分布和去极化，干扰神经冲动传导。本实验中，肝性脑病症大鼠灌服本发明物后，其ALT、AST、Amm浓度明显降低，行为学实验中，大鼠活动变频、寻台潜伏期明显缩短，说明本实验对肝性脑病症大鼠有一定的疗效。究其原因，可以认为，在灌服L-鸟氨酸谷氨酸复盐后，鸟氨酸作为尿素循环的反应底物，迅速激活肝细胞内的尿素循环，将机体病态下产生的有害的二氧化碳及氨通过尿素排出体外，使得肝脏内酶代谢逐步恢复，从而使得肝脏的活力得到恢复，起到保肝、护肝的作用。而谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统含量最丰富的兴奋性神经递质，参与神经系统多种重要功能的调节，对神经发育、突触可塑性的维持、神经元回路的形成及学习过程起着关键性的作用。谷氨酸可以和血中过多的氨结合生成无害的谷氨酰胺，从而降低了血氨浓度，使疾病症状减轻或暂时缓解。有资料显示，谷氨酸不能直接通过血脑屏障，但在体内的过多的血氨作用下，谷氨酸能迅速的与血氨结合生成谷氨酰胺，谷氨酰胺进入大脑以后生成谷氨酸，使肝性脑病的大鼠大脑海马中兴奋性氨基酸谷氨酸有所增加，与此同时生成的血氨参与脑内的鸟氨酸循环，进而降低了脑内的血氨浓度，所以在灌服本发明后，昏迷的肝性脑病大鼠逐渐苏醒，并且多余的谷氨酰胺有着其独特的功效，它在不同的组织中有着不同的代谢功能，在肝脏是糖异生作用和尿素合成的原料；肾脏中是肾小管分泌氨的主要氮源；在神经组织中是神经递质的前体物质，在血液中能暂时解除氨毒作用。且谷氨酸还能与体内的半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽，清除体内的自由基。

实验证明本发明对四氯化碳所致的大鼠急性肝损伤有保护作用，减轻肝细胞损伤，同时修复受损的肝细胞。说明本发明物能有效治疗因急慢性肝病所致的高血氨症，特别适用于因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状的解除及肝昏迷的抢救。

注：表1－6的表名结尾处（）内不能正确显示的内容为

Claims (9)

1.一种L-鸟氨酸谷氨酸复盐的晶型，该L-鸟氨酸谷氨酸复盐的结构式如式(1)所示：

其晶型的参数包括以下特征：

X-粉末衍射法：在2θ＝5.5，16.52，24.9，27.72度处有主峰，在2θ＝11，17.82，22.1，30.02，32.68，33.28，40.92度处有较弱的峰；

红外光谱法：在3010.484cm^-1、2939.128cm^-1、1641.206cm^-1、1586.278cm^-1、1494.635cm^-1、1411.707cm^-1处有较大吸收峰；

热重/差示扫描量热(TG/DSC)法：熔点温度为229.4℃。

2.权利要求1所述L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶型的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

在20～30℃下，取游离L-鸟氨酸水溶液，然后向其中加入谷氨酸粉末，恒温搅拌20～30min使反应完全，加入L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种，30～60min后加入溶析剂，然后将溶液温度降至5～15℃，恒温30～60min，将得到的悬浮液过滤、洗涤、干燥，得到L-鸟氨酸谷氨酸复盐结晶产品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于游离L-鸟氨酸水溶液的浓度为45.1～53.2g/L。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于游离L-鸟氨酸水溶液通过L-鸟氨酸发酵液经处理获得，或者通过化学合成、酶反应、L-鸟氨酸盐脱盐的任意一种或多种方法获得。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于加入的谷氨酸与游离L-鸟氨酸的摩尔比为0.9～1.1:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于溶析剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈、丙酮中的一种或多种，溶析剂用量是游离L-鸟氨酸水溶液体积的1～3倍。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶种加入量是加入谷氨酸质量的1～4％。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于干燥条件是：温度20～30℃，真空度0.08～0.1MPa。

9.权利要求1所述的L-鸟氨酸谷氨酸复盐晶型在制备治疗肝性脑病的药物及肝昏迷抢救药物中的应用。