CN103827323A - 涉及ns5b多肽和假结的hcv翻译或复制的调节剂的鉴定方法 - Google Patents

涉及ns5b多肽和假结的hcv翻译或复制的调节剂的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及充当丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的调节剂的化合物的鉴定方法，和通过该方法鉴定的化合物，以及所述化合物在医药中的应用。本发明还涉及可用于鉴定HCV翻译和/或复制的调节剂的RNA。本发明还涉及制备有复制能力的HCV病毒的方法。

Description

涉及NS5B多肽和假结的HCV翻译或复制的调节剂的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种充当丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的调节剂的化合物的鉴定方法，以及通过该方法鉴定的化合物和所述化合物在医药中的应用。本发明还涉及用于鉴定HCV翻译和/或复制的调节剂的RNA。本发明还涉及产生有复制能力的HCV病毒的方法。
背景技术
HCV是全世界重要的病毒病原体，感染全球约1亿7000万个体。如果急性感染没有得到清除，则病毒引起持续的肝病从而导致不可逆硬化，并且与每年超过100,000例肝细胞癌相关。在美国和欧洲，HCV引起的肝病是肝移植的主要适应症。
由于目前没有对抗HCV的疫苗，并且病毒水平的变化使得有效候选物的前景不可靠，因此当前的治疗限于利巴韦林和PEG化的干扰素-α的组合。急需新的疗法。解析HCV基因组结构和功能的反向遗传学方法也受到数量有限的有的体外复制系统的妨碍。
因此需要对HCV分子生物学进一步了解来辅助鉴定新的治疗靶标。
发明内容
本发明目标是涉及HCV病毒的RNA二级结构的分子相互作用，从而鉴定能够调节HCV翻译和/或复制的化合物。对HCV病毒的RNA二级结构的修饰还使得可以产生有复制能力的HCV病毒。
本发明人令人惊讶地指出，涉及SL9266/PK假结(本文中也称为SL9266/PK)的分子相互作用对HCV翻译有作用。此相互作用还依赖于NS5B多肽。对于给定化合物对HCV翻译的调节效果的鉴定也能鉴定对HCV复制的调节效果。
因此，本发明提供了调节HCV翻译和/或复制的化合物的筛选方法。该方法利用包含SL9266/PK或其变体和NS5B多肽的RNA形式的上述分子相互作用中的组分。在这些组分的情况下确定了测试化合物对HCV翻译的效果。这提供了可有助于开发解决HCV感染的治疗策略的药物开发新方法。
另外，本发明人还指出，对诸如SL9266/PK等HCV病毒的RNA二级结构稳定性的修饰对于产生有复制能力的HCV可具有有益效果。这在允许提供用于分析HCV的改善的体外系统方面带来另一益处。
因此，本发明提供一种调节丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的化合物的鉴定方法，所述方法包括：
(a)使包含SL9266/PK假结或其变体和能够翻译的报告物编码序列的RNA在NS5B多肽或其变体的存在下与所述化合物接触；和
(b)测定所述报告物编码序列的翻译。
根据本发明的优选方面，所述方法还包括：
(c)将步骤b)中测定的报告物编码序列的翻译与对于未与所述化合物接触的步骤a)中的RNA所获得的对照值进行比较，由此确定所述化合物是否是HCV翻译和/或复制的调节剂。
本发明的方法可用于增强或抑制NS5B多肽对HCV翻译的阻遏的化合物的鉴定方法，或用于增加或减少HCV复制的化合物的鉴定方法，或用于适合于预防或治疗HCV感染的化合物的鉴定方法。
在另一方面，本发明提供了一种包含SL9266/PK假结或其变体以及能够翻译的报告物编码序列的RNA。在优选实施方式中，所述RNA还包含能够翻译的NS5B或NS5B变体编码序列，可选的是其中所述报告物编码序列和NS5B或NS5B变体编码序列位于不同的顺反子。
根据本发明，通过本发明的任何方法鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂可用于预防或治疗受试对象的HCV感染的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的HCV翻译和/或复制的调节剂。
在又一方面，本发明提供一种产生有复制能力的HCV病毒的方法，所述方法包括：
(a)确定HCV病毒基因组的一个或多个部分的RNA二级结构的稳定性；
(b)将所述RNA二级结构的稳定性与JFH-1HCV病毒的对应结构的稳定性进行比较；和
(c)按照与JFH-1HCV病毒的对应结构相似的方式在所述HCV病毒基因组中引入稳定所述RNA二级结构的突变，由此产生有复制能力的HCV病毒。
在另一方面，本发明提供一种包含8至48个核苷酸长度的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸与HCV的9266至9314中的部分或全部区域基本上互补。此类寡核苷酸可用于预防或治疗HCV感染。
附图说明
图1显示了在两种不同的体外HCV复制系统中对SL9266/PK结构的分析。(A)Con1b。(B)JFH-1。关键位置以～为前缀来指示特定核苷酸，并且相邻的茎环以反向图像显示，上游和“吻合环”相互作用以灰色阴影菱形标出。
图2显示了SL9266/PK和NS5B介导的翻译反馈的体外分析。(A)双顺反子报告物系统和带帽NS5BmRNA。星号表示工程化到双顺反子报告物版本中的终止密码子，称为NS5B-停止。(B)在左手侧列出的报告物存在下确定的相对于亲本双顺反子报告物标准化的荧光素酶活性。C9302A是SL9266/PK中的点突变。带帽NS5B mRNA以1:1至1:10摩尔过量反式补充。
图3显示了对不同体外复制系统中SL9571的结构的分析。各条表示9566-9602区域中各核苷酸与显示出更大反应性的未配对核苷酸的化学反应性。反向箭头表示SL9571的推断的双链区域，虚线表示与SL9266形成‘吻合环’时涉及的顶环(apical loop)。(A)Con1b，(B)JFH-1和(C)具有破坏“吻合环”相互作用的G9583A突变的JFH-1。
图4显示了在J6/JFH-1和Con1b中的长范围RNA序列与SL9266的相互作用的示意图和比较，以及标出了特定突变的影响。
图5和6分别显示了Con1b的SL9266和SL9571以及JFH-1的SL9266和SL9571的结构和针对它们的寡核苷酸的另外的示意性分析。与实施例所用的寡核苷酸互补的HCV序列以粗体表示。
图7显示了利用双顺反子报告物评价针对SL9266的寡核苷酸对翻译的效果的测试结果。1-5道利用了合成NS5B的报告物，6-10道利用了不合成NS5B的报告物。
图8显示了评价针对SL9266和SL9571的寡核苷酸对亚基因组复制子复制的效果的测试结果。
图9显示了在病毒复制测试中利用针对SL9571和SL9266的寡核苷酸的测试结果。
序列说明
SEQ ID NO:1是NS5B聚合酶的核酸序列。
SEQ ID NO:2是NS5B聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是双顺反子报告物构建体的核酸序列。
SEQ ID NO:4是含有5’HCV IRES的一部分的HCV核心蛋白编码序列区域的核酸序列。
SEQ ID NO:5是与SL9571茎环互补的寡核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO:6是Con1b抗-SL9266LNA寡核苷酸的核酸序列。.
SEQ ID NO:7是随机化(randomised)LNA寡核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO:8是JFH-1抗-SL9266LNA寡核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO:9是Con1b/JFH-1抗-SL9571LNA寡核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO:10是Con1b核酸序列。
SEQ ID NO:11是SL9266_C寡核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO:12是SL9266_J寡核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO:13是Con1b SL9571核酸序列。
SEQ ID NO:14是JFH-1SL9266核酸序列。
SEQ ID NO:15是JFH-1SL9266核酸序列。
具体实施方式
应当理解的是，所公开的方法的不同应用可以根据本领域中的特殊需要而定制。还应当理解的是，本文所使用的术语是仅仅用于描述发明本的具体实施例的目的，而不是意图限制。此外，除非内容另外明确指出，否则在本说明书中和在所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象。因此，例如，述及“化合物”包含“多个化合物”，述及“多肽”包括两个或多个这样的多肽等。不论上文还是下文，本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用整体并入本文。
调节HCV翻译和/或复制的化合物的鉴定
本发明提供了充当HCV翻译和/或复制的调节剂的化合物的鉴定方法。该方法涉及使含有SL9266/PK假结或其变体和能够翻译的报告物编码序列的RNA在NS5B多肽的存在下与化合物接触。该方法还涉及测定报告物编码序列的翻译。
该方法也可以用于鉴定增强或抑制NS5B多肽对HCV翻译的阻遏的化合物。该方法还可用于鉴定增强或抑制的NS5B多肽的RNA聚合酶活性的化合物，或鉴定减小或增大HCV复制的化合物。该方法也优选用于鉴定适于治疗或预防HCV感染的化合物。
RNA
所述RNA包括SL9266/PK假结或其变体和可翻译的报告物编码序列。RNA可以从如下面所描述的DNA分子转录。RNA优选为单链RNA。
典型的是，该RNA在尺寸上小于天然丙型肝炎病毒基因组，并且不包括HCV基因组的编码区或基本上不包括所有的编码区。该RNA可以缺乏HCV基因组的E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B和NS5A编码序列中的一个或多个，例如2个以上、3个以上或所有。RNA可以如下面所描述缺乏核心HCV蛋白的编码序列，或仅包括其片段。RNA可以缺乏全长NS5B编码序列，其中NS5B以反式提供。然而，RNA保持足够的NS5B编码序列从而允许形成SL9266/PK。
所述RNA可缺乏5’非编码HCV区，或可以仅包括足以提供HCV翻译和/或复制的其片段。相似的是，所述RNA可缺乏3’非编码HCV区，或可以仅包括足以提供HCV翻译和/或复制的其片段。然而，所述RNA保留了足够的3’HCV非编码区序列从而允许形成SL9266/PK。
因此SL9266/PK可以只是包括在RNA中的HCV衍生序列。然而，所述RNA优选包括全长的NS5B编码序列。更优选地，所述RNA还包含全长HCV3'非编码区和/或全长HCV5'非编码区。可使用能够提供HCV翻译和/或复制的HCV3'非编码区和/或HCV5'非编码区的片段来代替全长非编码区。
优选地，所述5'HCV IRES或其片段包含在所述的RNA中。5'HCV IRES包括位于5'非编码区并且共约340个核苷酸长度的4个茎环结构（域I-IV），并延伸到所述多蛋白编码序列。将核心编码区中的保守结构命名为域V和VI。
特别优选的是所述RNA包括核心蛋白编码序列或其片段，所述片段包括存在于HCV IRES的3'端的RNA的二级结构区。此片段下文中进一步描述。公开的每一个如上所述的HCV序列可以在所述RNA中以所有可能的排列相互组合。
所述RNA可以为任何尺寸。通常，所述RNA尺寸为约15kb以下。所述RNA尺寸可以为约12kb以下、约10kb以下、约9kb以下、约8kb以下、约7kb以下、约6kb以下、约5kb以下、约4kb以下、约3kb以下、约2.5kb以下、约2kb以下、约1.5kb以下、或约1kb以下。例如，所述RNA尺寸可以为约1kb至约10kb、约2kb至约10kb、约2kb至约5kb、或约5kb至约10kb。
尺寸较大的RNA，如尺寸约10kb至约15KB的RNA，通常在提供全长或基本上全长HCV基因组的情况下使用。较小的RNA包括监视对HCV翻译的效果必要的最少元件，即，SL9266/PK或其变体、报告物编码序列和可选的NS5B编码序列。例如，SL9266/PK尺寸是约600个核苷酸（nt），GFP报告物编码序列尺寸可以为约600nt；因此这些元件可在约1.2kb尺寸的RNA中提供。优选的是，可包括HCV5'NCR（347nt）和第二IRES（也许另一350nt），从而提供约1.9kb尺寸的RNA。
与SEQ ID NO:3的双顺反子报告物构建体等效的RNA尺寸约4.7kb，并包含HCV5’非编码区(7-347nt)、HCV核心蛋白编码区的小区域(348-395nt)、荧光素酶报告物基因(395-2057nt)、源自脑心肌炎病毒的第二内部核糖体进入位点(2076-2676nt)、V5标签(2677-2721nt.)、NS5B蛋白(2722-4497nt.)和HCV的3’非编码区(4498-4728nt)。
在所述RNA利用的SL9266/PK包括核心RNA茎环序列和茎-环的5'和3'侧的序列，他们形成扩展的RNA二级结构的区域，也被描述为假结。SL9266/PK的序列源自NS5B编码序列的3'部分，并延伸到丙型肝炎病毒基因组的3'非编码区。
HCV3'非编码区的长度为约200个核苷酸，并且包括三个离散的茎环，被称为SLI-III(从3‘端编号)，形成已知为X尾部的结构。该结构通过超变结构域和长度与序列可变的嘧啶富集束(pyrmidine-rich tract)与HCV编码区隔开。编码NS5B多肽的3'NCR的5'近端的序列包含5个另外的系统发生的保守RNA茎-环结构，这些根据本文中所述规定被指定为SL9033、SL9132、SL9217、SL9266和SL9324。SL9266预计占据包含邻近的SL9217（5BSL3.1）和SL9324（5BSL3.3）茎环的十字结构中的中心位置。
称为SL9266的核心RNA茎环在本领域中还称为5BSL3.2或SL-V。SL9266结构包括顶环和由3’近末端凸起隔开的两个短碱基配对螺旋(参见图1)。顶环和3’近末端凸环参与了上游和下游远程RNA-RNA相互作用，所述相互作用产生了扩展RNA二级结构的区域。该远程相互作用与在SL9266茎环的上游和下游的约200个核苷酸的序列一起出现。SL9266/PK的结构在Diviney等(J.Virol(2008)82,pp9008-9022)中更详细综述。
提供SL9266/PK需要提供足够的HCV基因组序列，以包含SL9266茎环和参与与茎环远程相互作用、并且可使RNA二级结构的扩展区域折叠和稳定的的上游和下游序列。
所述RNA使用的天然SL9266/PK通常包括HCV基因组的约9000位核苷酸至约9650位核苷酸的序列、由所述序列组成或基本由所述序列组成。SL9266/PK的变体包括其保留天然SL9266/PK的功能的截短和修饰版本(如下所述)。
SL9266命名法参考HCV基因型1a原型株H7722,，其中SL9266核心RNA茎环的5’核苷酸处于第9266位。HCV基因组的命名法Kuiken,C等(Hepatology(2006)44,pp1355-1361)和Lemon等(Fields virology5th Ed.(2007),Hepatitis C virus p1253-1304)综述。
通过限定，Kuiken的文章描述了对所有HCV基因型通用的编号系统。所比对的序列在相同的位置始终具有相同的结构(假设它们在系统发生学上是保守的)。SL9266/PK对于所有HCV基因型而言在系统发生学上是保守的。因此，本领域技术人员可以参照与本文所述序列给出的核苷酸位置相关的上述参比序列并外推至其他基因组和基因型中的相似位置。
本发明RNA中所用的SL9266/PK可源自任何天然来源的HCV基因型、血清型或分离株或进化枝。本领域技术人员已知，天然存在的HCV病毒可根据各种生物学体系分类。本领域技术人员可基于其常识提供任何天然来源的HCV基因型、血清型或分离株或进化枝的SL9266/PK所对应的序列。
HCV基因型通常根据它们的基因型而指代。HCV基因型编号为1至11，每一种具有多种亚型(a、b、c等)。代表性基因型和登录号包括：基因型1b(Con1分离株)AJ238799和基因型2a(JFH-1分离株)AB047639。
HCV病毒可以根据它们的血清型而指代。血清型对应于HCV变体亚种，所述变体亚种由于其衣壳表面抗原的表达情况而具有独特的反应性，可用于将其与其它变体亚种区分开。通常，具有特定HCV血清型的病毒不能有效与对任何其他HCV血清型具有特异性的中和抗体发生交叉反应。
HCV病毒还可以根据进化枝或或克隆来指代。这是指天然来源的HCV病毒的系统发生学关系，通常指可以回溯至共同祖先的HCV病毒的系统发生学组，并且包括其所有后裔。另外，HCV病毒可以根据特定分离株来指代，即，自然中发现的特定HCV病毒的遗传分离株。术语遗传分离株描述了与其他天然存在的HCV病毒进行了有限的遗传混合的HCV病毒群，从而限定了在遗传水平可鉴定的独立群。
本领域技术人员根据其公知常识可选择HCV合适的基因型、血清型、进化枝、克隆或分离株，来用于提供SL9266/PK和本发明中所用的RNA的任何其他HCV序列。应当理解的是，本发明还包括可能尚未被鉴定或表征的HCV基因型、血清型、进化枝、克隆或分离株的HCV基因组的SL9266/PK和任何其他序列的应用。
另外，本发明包括来自任何已知体外HCV复制系统的SL9266/PK的应用。这些包括由HCV基因型1b共有序列Con1b产生的亚基因组复制子(SGR)(Lohmann等,(1999)Science285,pp110-113)。另一合适的系统是记载为JFH-1/HCVcc的全长基因型2a HCV(Wakita等,Nat Med(2005)11,pp791-796)。
本发明还包括SL9266/PK变体的应用。SL9266/PK的变体是源自SL9266/PK的任何序列，该序列包含SL9266茎环或其变体以及可使RNA二级结构的扩展区域折叠和稳定的其上游序列和下游的序列。
如Diviney等(同上)所述，SL9266/PK具有作为HCV的顺式作用复制元件的功能。令人惊讶的是，本发明人还发现SL9266/PK对于控制HCV翻译是必须的。特别是，SL9266/PK连同NS5B的表达一起控制了翻译的终止，从而使复制可以开始。
因此，SL9266/PK的变体通常包含使得可以从HCV IRES进行翻译的来自HCV基因组的NS5B编码序列和3’非编码区的必要序列。优选的是，变体可以包含使得可以从全长天然5’和/或3’非编码HCV区的HCV IRES翻译全长HCV编码区的必要序列。变体还可以包含使得HCV基因组体外复制的来自HCV基因组的NS5B编码序列和3’非编码区的必要序列。
另外并且出乎预料的是，本发明人发现在SL9266/PK的情况下NS5B HCV RNA聚合酶可以抑制HCV翻译。
因此，SL9266/PK的变体在本文中也称为源自HCV基因组的NS5B编码区和3’非编码区的、可以使NS5B多肽抑制报告物编码序列从所述RNA上翻译的任何序列。
应当理解的是，变体SL9266/PK不需要以与野生型天然SL9266/PK相同的程度使NS5B多肽抑制翻译。SL9266/PK的变体是使得可测定NS5B对翻译的效果的任何变体，所述翻译进而使得可鉴定测试化合物对HCV翻译和/或复制的效果。SL9266/PK的变体可以以利用天然SL9266/PK观察到的水平的40%以上，通常50%、60%、70%、更优选80%、85%、90%、95%以上的水平来翻译报告物编码序列。该翻译效率可以在与HCV IRES可操作地连接的报告物编码序列的情况下观察。
变体SL9266/PK可以包含从HCV基因组的至少约9000位以上的核苷酸例如9010、9020、9030、9040、9050、9060、9070、9080、9090、9100、9110以上开始并在至少约9585、9590、9595或9600位核苷酸终止的HCV基因组序列，可以由其组成，或者基本由其组成。公开以上起点位置中的每一个可以与上述终点位置中的每一个组合。
应当理解的是，与天然SL9266/PK相比变体SL9266/PK还可以包含内部序列的缺失、取代或添加，条件是这些修饰仍然能够使NS5B多肽抑制报告物编码序列从所述RNA的翻译。修饰优选不改变SL9266/PK的结构的折叠或稳定。优选的是，当NS5B编码序列与SL9266/PK组合在所述RNA上提供时，任何所述修饰不削弱编码的NS5B的功能。
还优选的是，不对存在于SL9266/PK中的介导RNA-RNA相互作用的序列区中进行任何所述修饰。因此，优选不对茎环SL9266的序列进行缺失、取代或添加，或不对与茎环相互作用的该茎环的上游或下游序列进行缺失、取代或添加。“上游”表示序列位于另一序列的5’，例如HCV基因组中茎环SL9266的5’。“下游”表示序列位于另一序列的3’，例如HCV基因组中茎环SL9266的3’。
通常不被修饰的序列包括HCV基因组的核苷酸9110附近的SL9266茎环上游序列和HCV基因组的核苷酸9580附近的SL9266茎环下游序列，特别是这些上游和下游序列内与例如图1所示的SL9266茎环相互作用和/或与例如图1所示的SL9266茎环至少部分互补的区域。
本文将这些相互作用序列也称为“上游SL9266-相互作用序列”和“下游SL9266-相互作用序列”。本领域技术人员可以选择适当的核苷酸区域，所述核苷酸区域包含能够与SL9266茎环相互作用并稳定SL9266茎环的此类序列。
通常，不对HCV基因组的从至少约9266位核苷酸至至少约9314位核苷酸的核苷酸区域，更优选从至少约9250位核苷酸至至少约9330位核苷酸的核苷酸区域进行修饰。通常也不对HCV基因组的从至少约9108位核苷酸至至少约9112位核苷酸的核苷酸区域、更优选从至少约9090位核苷酸至至少约9130位核苷酸的核苷酸区域进行修饰。通常也不对HCV基因组的从至少约9571位核苷酸至至少约9586位核苷酸的核苷酸区域、更优选从至少约9550位核苷酸至至少约9590位核苷酸的核苷酸区域进行修饰。
然而，可以在这些区域中引入一个或多个缺失、取代或添加，条件是NS5B多肽保持能够抑制报告物编码序列从所述RNA的翻译即可。下面进一步描述对诸如SL9266茎环等区域的适合的修饰的选择。
变体SL9266/PK还可以只保留等同于上述介导天然SL9266/PK的特异性RNA-RNA相互作用的序列的那些序列区域，条件是这些区域以与天然结构相对应的距离相互间隔即可。进行间隔的选择从而使得变体SL9266/PK的折叠和构象与天然折叠和构象相似。插入序列可以随机选择为任何能够提供NS5B多肽对报告物编码序列从所述RNA上翻译的阻遏的序列。
变体SL9266/PK可包含SL9266或其变体的序列，例如，HCV基因组的从至少约9266位核苷酸至至少约9314位核苷酸的核苷酸序列或其变体，位于本文所述的上游SL9266-相互作用序列3’的约150至约600个核苷酸处。上游-相互作用序列可以是HCV基因组的从至少约9108位核苷酸至至少约9112位核苷酸的序列或其变体。更优选的是，SL9266或其变体位于上游SL9266-相互作用序列3’的约200至约500、例如约200至约300个核苷酸处。SL9266序列或其变体可以位于上游SL9266-相互作用序列3’的约150、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、或约250个核苷酸处。
变体SL9266/PK可包含SL9266序列或其变体，例如，HCV基因组的从至少约9266位核苷酸至至少约9314位核苷酸的核苷酸序列或其变体，位于本文所述的下游SL9266-相互作用序列5’的约150至约300个核苷酸处。下游-相互作用序列可以是HCV基因组的从至少约9571位核苷酸至至少约9586位核苷酸的序列或其变体。更优选的是，SL9266或其变体位于下游SL9266-相互作用序列5’的约200至约250个核苷酸处。SL9266序列或其变体可以位于下游SL9266-相互作用序列5’的约150、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、或约250个核苷酸处。
报告物和NS5B编码序列
报告物编码序列编码为了作为翻译活性度量而检测其存在的任何多肽。本领域技术人员能够根据其公知常识来选择适当的报告物编码序列，并且作为所用来监测HCV翻译的检测方法的类型的函数。
如下所述，对于报告物编码序列翻译检测翻译的优选方法包括发光、荧光或免疫测试。因此，报告物编码序列可以编码发光或荧光蛋白，从而可通过测定发光或荧光信号来检测翻译水平。发光报告物编码序列的适当实例是荧光素酶。作为选择，报告物编码序列可编码其存在能够利用适当抗体进行免疫学检测的任何多肽。
报告物编码序列必须可从所述RNA翻译。当NS5B多肽也在同一RNA上编码时，NS5B编码序列也必须能够翻译。因此，报告物编码序列和NS5B编码序列位于所述RNA上能够获取翻译所需成分和活性的适当位置。报告物或NS5B编码序列可以位于所述RNA的5’端并包括5’帽。报告物或NS5B编码序列可以位于所述RNA序列的内部位点。在此情形中，报告物编码序列通常与内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。报告物编码序列的IRES可以具有任何起点和具有任何序列，只要在SL9266/PK的情况下提供所述RNA翻译即可。本领域技术人员能够根据其常识选择适当的IRES。
优选的是，报告物编码序列的IRES源自HCV，即，是HCV IRES。HCV IRES可以源自任何天然来源的HCV基因型、血清型、或进化枝，包括上文具体描述的那些。天然HCV IRES位于HCV基因组的5’非编码区并延伸到核心蛋白编码区。
还可以使用变体HCV IRES。变体HCV IRES是可允许报告物从本发明RNA上翻译的源自HCV IRES的任何序列。变体包括具有核苷酸取代和/或内部缺失或添加的截短形式和序列。本文所述的具体截短HCV IRES如SEQ ID NO:4所示，并仅包含源自核心蛋白编码序列的HCV IRES的一部分。该区域包含多种明确确定的RNA二级结构。上述截短HCV IRES不具有可以使其自己翻译的功能，但可以与可进行报告物编码序列的翻译的另一要素(即，另外的IRES或5’帽)组合提供。上述截短HCVIRES优选包含在本发明的RNA中。
NS5B编码序列的IRES也可以从任何来源提供，但优选不源自HCV。适当的IRES的实例是来自EMCV IRES的IRES，不过也可以替代性使用另一来源(病毒或细胞)的IRES。
当所述RNA包含报告物编码序列和NS5B编码序列时，这些序列通常在所述RNA的不同顺反子上提供。这两种顺反子可以在任何适当的构造提供，所述构造使的两种编码序列在SL9266/PK的情况下翻译。优选的是报告物编码序列在NS5B编码序列的5’。然而，NS5B编码序列可以在报告物编码序列的5’。
SL9266/PK或其变体优选位于报告物编码序列的3’。然而，SL9266/PK还可以位于报告物编码序列的5’，条件是NS5B多肽能够阻遏报告物编码序列从所述RNA上的翻译即可。
除了SL9266/PK或其变体、报告物编码序列和可选的是NS5B编码序列以外，所述RNA还可以包含辅助翻译的任何其他调节序列。例如，所述RNA可包含与报告物编码序列相邻的5’UTR或3’UTR，提供增强翻译的序列。
NS5B多肽及其变体
所述方法在NS5B多肽或其变体的存在下进行。NS5B RNA聚合酶的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的蛋白。
NS5B多肽或其变体是任何阻遏报告物编码序列从本发明的RNA上翻译的多肽。NS5B多肽或其变体还可以进行HCV基因组的复制，但这不是必要的。如下所述，NS5B多肽或其变体阻遏报告物编码序列翻译的能力可由本领域技术人员常规确定。优选的是，与SEQ ID NO:2的多肽相比，NS5B多肽或变体对报告物编码序列的翻译提供相似或更高的阻遏。
SEQ ID NO:1或2的变体可包括其截短体、突变体或同源物。SEQ ID NO:1的变体可以是其任何编码功能性NS5B多肽的转录变体。
本文提及的任何同源物通常与SEQ ID NO:1或2的相关区域有至少70%的同源性。
同源性可利用已知方法测定。例如UWGCG软件包提供可用于计算同源性的BESTFIT程序(例如以其默认设置来使用)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或对齐序列(通常为其默认设置)，例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300;Altschul,S,F等(1990)J Mol Biol215:403-10中所述。进行BLAST分析的软件可通过National Center for BiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
在优选实施方式中，变体序列可编码与SEQ ID NO:2的相关区域在至少20、优选至少30、如至少40、60、100、200、300、400以上个连续氨基酸或者甚至在变体整个序列上有至少55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%并且更优选至少95%、97%或99%同源性的多肽。相关区域是在阻遏报告物编码序列从本发明的RNA上翻译中提供NS5B功能活性的区域。所述区域可以是与核仁、p68(螺旋酶)、heIF4All、hPLIC1(泛素样)或亲环素B相互作用的NS5B区域。
作为选择并且优选的是，变体序列可编码在其整个序列上与全长SEQ ID NO:2有至少70%、75%、80%、85%、90%并且更优选至少95%、97%或99%同源性的多肽。通常，变体序列与SEQ ID NO:2的相关区域相差至少或小于2、5、10、20、40、50或60个突变(其中每一个可以是取代、插入或缺失)。
变体NS5B多肽在上述序列的任何长度上可以与SEQ ID NO:2的特定区域具有与任何特定百分比同源性值相同的百分比同一性(即，其可以具有至少70%、80%或90%并且更优选至少95%、97%或99%同一性)。
SEQ ID NO:2的变体也包括截短体。可以使用任何截短体，只要所述变体仍然能够阻遏报告物编码序列从本发明的RNA上翻译。通常制备截短体以去除对阻遏翻译的活性不必要的和/或不影响折叠蛋白构象或与相关的相互作用蛋白的蛋白-蛋白相互作用的序列。合适的截短体通常通过从N末端或C末端系统性截短不同长度序列来鉴定。优选的截短体是N末端截短体并且可去掉除催化域之外的所有其他序列。
SEQ ID NO:2的变体还包括相对于SEQ ID NO:2的特定区域具有1个以上，例如2、3、4、5至10、10至20、20至40以上氨基酸插入、取代或缺失的突变体。缺失和插入和取代通常在对遏制翻译的活性非必须的和/或不影响折叠蛋白构象的区域中进行。
取代优选引入一个或多个保守变化，其将氨基酸替换为具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸替换。所引入的氨基酸可与其所替代的氨基酸具有相似极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。作为选择，保守变化可引入芳香性或脂肪性氨基酸替换原有的芳香性或脂肪性氨基酸。
保守氨基酸变化是本领域公知的，并且可以根据下表A限定的20种主要氨基酸的性质选择。典型的取代的实例是SEQ ID NO:2的甲硫氨酸残基的突变，例如位于序列中2位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸，从而防止不期望的内部翻译开始。
相似的是，可用于提供NS5B多肽或其变体的SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的优选的变体包括与SEQ ID NO:1的相关区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%并且更优选至少95%、97%或99%同源性的多核苷酸。优选所述变体显示出与全长SEQ ID NO:1其整个序列的这些水平的同源性。
表A–氨基酸的化学性质
Figure BDA0000482944380000141
所要测试的化合物
测试化合物可以是HCV翻译的增强剂或抑制剂。HCV翻译的增强剂增加报告物编码序列的翻译。HCV翻译的抑制剂减少报告物编码序列的翻译。HCV翻译的增强剂可抑制HCV复制，例如通过降低HCV复制或使HCV不能复制。HCV翻译的抑制剂可激活或增加HCV复制。
HCV翻译的调节剂可通过任何机制增加或降低报告物编码序列的翻译。相似的是，HCV复制的调节剂可通过任何机制抑制、激活或增加HCV复制。
例如，HCV翻译和/或复制的调节剂可通过与NS5B多肽结合而直接作用。NS5B多肽是RNA聚合酶。因此，调节剂可直接结合在酶活性位点或可以结合在另一位点并对酶功能发挥变构作用。调节剂可影响NS5B多肽与HCVRNA基因组区域(例如,RNA二级结构的区域)之间的相互作用。HCV翻译和/或复制的调节剂可与SL9266/P直接结合K或与HCV基因组的RNA二级结构的另一元件直接结合。
HCV翻译和/或复制的调节剂还可以间接作用于SL9266/PK和NS5B多肽之间的分子相互作用。其可作用于包含NS5B的蛋白复合物中另外的组分。其还可以作用于对于NS5B多肽阻遏HCV翻译的效果必需的其他细胞因子。其还可以对NS5B聚合酶活性的激活有效果，例如通过经由第二信使系统的作用。HCV翻译和/或复制的调节剂还可以在NS5B翻译水平起作用，从而增加或降低NS5B mRNA或蛋白水平。其还可以发挥作用以调节所表达的mRNA或蛋白的稳定性。
任何化合物都可用于本发明的方法。化合物优选是怀疑调节HCV翻译和/或复制的化合物。
如下所述，化合物可以以任何适当的形式提供。
化合物可以是用于药物筛选程序的任何化合物。它们可以是天然的或合成的。还可以使用含有数种经表征或未经表征的成分的植物提取物。通常，对有机分子进行筛选，优选分子量为50道尔顿至2500道尔顿的有机小分子。化合物可以是生物分子，包括肽和肽模拟物、寡核苷酸、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们的衍生物、结构类似物或组合。候选化合物可以从各种来源获得，包括合成物或天然物的文库。可以对已知药理学试剂进行定向或随机化学修饰，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，从而产生结构类似物。化合物可以是本领域目前公知的组合文库的产物(例如参见Newton(1997)Expert Opinion Therapeutic Patents,7(10):1183-1194)。还可以使用天然产物文库，例如展示库(如，噬菌体展示文库)。
针对调节翻译并涉及SL9266/PK假结的分子相互作用的组分(例如NS5B多肽或SL9266/PK)的抗体是另一类适当的化合物。例如，可以使用单克隆抗体和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体和人源化抗体。所述抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，如Fab、F(ab’)2或Fv片段。可以表征候选抑制剂抗体，并可以确定其结合区域，从而提供负责破坏相关相互作用的单链抗体及其片段。
适当的抗体可以与NS5B多肽或SL9266/PK结合，由此阻止或阻断这些组分之间的直接或间接相互作用。抗体可以针对NS5B多肽或SL9266/PK的特定表位产生。
还可以使用RNA干扰来下调感兴趣的候选基因的表达，以筛选其对HCV翻译和/或复制的作用，例如可使用siRNA文库。
另外，与SL9266(或相互作用序列)结合并因此阻止SL9266折叠、远程相互作用和功能的寡核苷酸是另一类适当的化合物。例如，可以使用LNA(锁核酸)寡核苷酸(见http://en.wikipedia.org/wiki/Locked_nucleic_acid)。
翻译/复制的测试条件和测定
本发明的方法使得可以筛选一个或多个化合物作为HCV翻译和/或复制的调节剂的能力。所述方法优选在体外或离体进行。
所述方法可用于确定通过任何其他方式鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂的效果。因此，例如，已知的HCV翻译和/或复制的调节剂是否增强或抑制NS5B多肽对HCV翻译的阻遏。另外，例如，已知的HCV翻译和/或复制的调节剂是否增强或抑制NS5B多肽对HCV复制的激活。
确定化合物对报告物编码序列的翻译的效果的技术在本领域中已知。任何这些技术可以根据本发明来使用。
所述方法可以在允许测定报告物编码序列的翻译的任何适当的测试系统中进行。方法可以在体外进行，例如在无细胞系统中或作为选择在基于细胞的系统中进行。
优选的体外翻译系统利用提供对于翻译过程而言必须的组分的细胞提取物。这些通常包括大分子组分，例如核糖体、tRNA、氨酰基tRNA合成酶、启动、延伸和终止因子。细胞提取物可以为任何来源，条件是它们允许报告物编码序列的翻译即可。适当的细胞提取物可以获自网织红细胞，例如兔网织红细胞、小麦胚芽和细菌提取物，例如大肠杆菌提取物。细胞提取物适当补充有翻译所需的另外的成分，例如氨基酸、核苷酸三磷酸能源和其他辅因子。本领域技术人员熟悉所述系统的使用。
在优选实施方式中，所述RNA直接以RNA形式添加到体外翻译系统中。作为选择，可以利用偶联或连锁的转录/翻译系统，其中在翻译出所获得的RNA之前先转录编码RNA的DNA构建体。
除了使用细胞提取物来提供翻译机构之外，来自其他细胞的细胞质提取物可以包含在体外测试中，从而研究其他组分在对HCV翻译和/或复制的效果中的作用。适当的细胞提取物包括Huh-7或Huh7.5细胞提取物。
本发明的基于细胞的方法通常要求将报告物构建体转染到适当的细胞系中。通常，报告物构建体以RNA形式转染。然而，也可以将编码所述RNA的DNA构建体转染到细胞系中，然后其被转录为RNA。这种DNA构建体也可以整合在细胞基因组中来提供。相似的是，在NS5B反式提供的情况下，包含NS5B编码序列的RNA或DNA构建体也可以转染到细胞中。上述DNA构建体也可以整合在细胞基因组中来提供。报告物编码序列和/或NS5B编码序列的表达可以是瞬时的或稳定的，是诱导的或组成式的。化合物还可以在细胞中表达或外源添加。
所述方法可以利用任何形式的任何NS5B多肽来进行。适当的NS5B多肽下面将更详细地讨论。通常，仅使用一种NS5B多肽。然而，在一些实施方式中，可以使用2种以上，例如3、4或5种以上的不同NS5B多肽。
NS5B多肽可以反式提供或可以从与报告物编码序列相同的构建体表达。当NS5B多肽反式提供时，其可以由RNA或DNA构建体表达或直接以多肽形式提供。
当NS5B多肽由DNA构建体表达时，例如通过转染到细胞中表达时，适当转染的细胞表达能够转录NS5B编码序列的RNA聚合酶。所述RNA聚合酶可以例如为T7RNA聚合酶。作为选择，能够允许通过任何RNA聚合酶转录的泛在启动子(ubiquitous promoter)，例如巨细胞病毒启动子可以与NS5B编码序列可操作地连接。
NS5B多肽可以在溶液中。所述溶液可包含适当的缓冲液中的纯化或基本纯化的重组NS5B多肽。所述缓冲液是本领域已知的。作为选择，所述溶液可以是培养基或表达NS5B多肽的细胞培养物的细胞裂解物。NS5B多肽还可以固定在平台或表面上。适当的平台或表面是本领域中已知的。一个实例是标准的96或384孔板。
如果与化合物的接触发生在溶液中或平台或表面上，则所述方法在允许NS5B发挥功能、特别是控制翻译的条件下进行。适当的条件包括但不限于20mM Tri-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、25mM KCl、1mM EDTA，温育温度为20℃至37℃。
NS5B多肽可以首先与化合物接触，然后引入到存在的RNA中。这种类型的预温育可以对于使化合物有充分时间对NS5B活性起作用是必须的。作为选择，化合物可以引入到同时存在的NS5B多肽和所述RNA中。与化合物的接触进行足够的时间从而使得HCV翻译通过下述方法测量。
当NS5B多肽和所述RNA在细胞或细胞培养物中表达时，所述方法在保持细胞或细胞培养物活力的条件下进行。适当的条件包括但不限于适当培养基中于37℃的5%CO2的湿润气氛中。适当的细胞包括Huh-7或Huh7.5细胞、HepG2、HeLa、293、NIH3T3和CHO细胞。
本发明的方法可以在单反应(即，含有至少一种化合物、NS5B多肽和RNA的反应)中进行。例如，本发明的方法可用于鉴定一种个体化合物是否是HCV翻译和/或复制的调节剂。
然而，应当理解的是，特别对于体外翻译系统，本发明的方法优选以多个同时或并发的反应进行，例如5、10、15、20、30、40、50、100、150、200个以上同时或并发的反应。每个反应包含至少一种化合物、至少一种NS5B多肽和至少一种RNA。这使得可以研究HCV翻译和/或复制的调节的各方面。
优选的是，本发明的方法涉及同时或并发地鉴定多个调节HCV翻译和/或复制的化合物。换言之，本发明的方法可以涉及多于一种化合物的高通量筛选。高通量筛选通常利用5、10、15、20、30、40、50、100、150、200种以上不同化合物进行。通常，在不同反应中筛选各化合物。然而，可以在同一反应中测试2种以上化合物。
本发明的方法可用于鉴定最佳地调节HCV翻译和/或复制的化合物的浓度。在所述实施方式中，多个反应在各反应中利用不同浓度的化合物同时或并发地进行。
多个反应可以在平板的孔中进行。孔通常具有约25μl至约250μl、约30μl至约200μl、约40μl至约150μl或约50至100μl的容量。在标准的96或384孔板的孔中可以同时或并发地进行96或384个反应。需要时，结合蛋白或抗体可以固定在一个或多个、优选所有孔的表面。这些可用于将NS5B多肽固定至孔表面。
在进行多个反应时，各反应通常在相似的条件设置下进行，从而可以对获得的结果进行比较。适当的条件如上所述。适当地，各反应还通常利用相同摩尔浓度或输入量的反应成分(即化合物、所述RNA和/或NS5B多肽)来进行，从而可以对获得的结果进行比较。适当水平的RNA可以是0.1微克至10微克。当NS5B反式表达时，与包含报告物编码序列的RNA相比，编码NS5B的RNA通常可以为0.1至10倍摩尔过量。
所要接触的化合物浓度随化合物的性质而变化。本领域技术人员可以确定适合的浓度。通常，可以使用浓度为约0.01nM至100nM，例如0.1nM至10nM的化合物。
当使用细胞或细胞培养物时，各反应通常包含相同数量的细胞。例如，细胞通常以各板孔中大致相同数量的细胞来接种，并且各反应在相同的时间后进行。通常96孔板的每个孔中接种3-5x104个细胞。
对于每一个上述实施方式，测试中使用的确切条件可以有变化。实验条件可以由本领域技术人员根据其常识来优化常规条件，从而改善本发明方法的灵敏度和可靠性。
为了确定化合物是否是HCV翻译和/或复制的调节剂，与对照值进行比较。将NS5B多肽与化合物和所述RNA接触后获得的报告物编码序列的翻译的值与对照值比较。对照值是在NS5B多肽已经与所述RNA接触但没有与化合物接触的条件下观察到的报告物翻译活性。优选的是，所述条件在其他方面与用于在与化合物接触后获得报告物翻译值的条件相同。在与对照值比较后，可以在相对于对照值而言报告物编码序列翻译增加或报告物编码序列翻译降低方面来鉴定化合物的效果。增加表示增强剂。降低表示抑制剂。
优选的是，对照值在进行本发明的方法的同时获得。例如，对照反应与其中NS5B多肽接触所述RNA和化合物的反应同时进行。这确保了对照值在与使NS5B多肽接触所述RNA和化合物后测定的报告物编码序列翻译值相同的条件下获得。
对照值也可以与本发明的方法分开获得。例如，对照值可以事先获得并记录，例如记录在计算机上。对照值可以用于所述方法的多次重复。对照值可来自多于一个对照反应。例如，对照值可以是从数次例如2、5、10、15次以上对照反应的测量的算术平均值。为了进行有效比较，对照值与其所比较的测试样品的测量具有相同的单位。本领域技术人员能够获得所述值。
上述对照值的类型在本领域中通常已知为“阴性对照”。本发明的方法还可以与用于调节HCV翻译和/或复制的一个或多个阳性对照联合进行。这包括利用一个或多个已知调节HCV翻译和/或复制的化合物进行反应。阳性对照使得可以验证在本发明方法中使用的报告物编码序列翻译活性。例如，其可以用于对不同细胞类型的结果进行比较。阳性对照还可以用于确定化合物对HCV翻译和/或复制调节的程度。合适的阳性对照的实例是利巴韦林，利巴韦林是HCV复制的抑制剂。
在测定报告物编码序列翻译活性之前的反应成分的温育时间可以根据产生适当强度的信号所需的时间来选择。报告物编码序列翻译的测定可以在与测试化合物接触之后的一个或多个时间点进行。这可以允许确定化合物效果的持续时间和稳定性。
测定报告物编码序列的翻译的技术是本领域公知的。可以使用任何适当的技术。测定报告物编码序列翻译的优选的方法包括发光、荧光或免疫测定。例如，报告物编码序列可以编码发光或荧光蛋白，从而可通过测定发光或荧光信号来监测翻译水平。发光报告物编码序列的适当实例是荧光素酶。
利用免疫测试法来测定翻译蛋白水平也是本领域公知的。可以使用可通过抗体检测报告物编码序列的任何合适的免疫测试法。可以使用针对给定靶标的任何合适的商售抗体。合适的免疫测试法的实例是酶联免疫吸附测试法(ELISA)。在一些实施方式中，ELISA测试可以在孔涂覆有结合蛋白或抗体的平板中进行，所述结合蛋白或抗体能够结合所翻译的报告物多肽并使得可以对其进行检测。其他类型的疫测试法包括免疫沉淀和蛋白质印迹。
虽然优选免疫测试法，但任何其他高亲和性配体-受体相互作用，例如抗生蛋白链菌素-生物素也可以用于测定翻译活性。
如本文所述，除了提供HCV复制的已知作用以外，NS5B聚合酶还对HCV翻译阻遏。因此，本发明方法中对调节HCV翻译的化合物的鉴定还可以鉴定该化合物对HCV复制的附加效果。
本发明的方法因此还可以包括测定HCV复制的步骤。优选的是，在包含全HCV基因组或其有复制能力的变体的RNA的环境中测定HCV复制。例如，所述RNA可包含SGR的序列或JFH-1的序列(HCVcc)。然而，可以使用允许测定在至少一个阶段的HCV复制循环中的效果的任何适当的系统。因此，可以在不要求全复制循环的情况下和不需要任何对基因组包装的情况下测定对HCV复制的效果。
通过向缺少HCV病毒–核心、E1和E2等结构蛋白的亚基因组复制子中引入报告物，来在遗传水平上测定HCV复制。还可以通过在编码区框内引入报告物(例如荧光素酶)来测定全长基因组的复制。还可以在产生传染性病毒颗粒的水平测定HCV复制。有复制能力的HCV基因型用于所述测定，例如JFH-1病毒。
本发明的产物
本发明还提供了包含SL9266/PK假结或其变体和可翻译的报告物编码序列的RNA作为产物本身。该RNA的特征在上文中就本发明方法中所用的RNA进行了描述。
本发明还提供了可用于进行本发明的筛选方法的试剂盒。试剂盒通常包括所述RNA或测定所述RNA表达的要素(means)、提供NS5B多肽或其变体的要素以及可选的能够在本发明的方法中使用试剂盒的说明书。用于表达所述RNA的要素可以是编码所述RNA的DNA构建体，例如质粒。提供NS5B多肽或其变体的要素可以作为RNA的一部分或作为同一DNA构建体的一部分(在所述RNA还包含NS5B编码序列的情况下)包含。作为选择，试剂盒可包含编码NS5B多肽或其变体的第二DNA构建体。
试剂盒还适当地包含翻译过程所需的组分。这些组分可以以上述细胞提取物的形式提供。细胞提取物通常可包括大分子组分，例如核糖体、tRNA、氨酰基tRNA合成酶、启动、延伸和终止因子。试剂盒可包括翻译所需的另外组分，例如氨基酸、核苷酸三磷酸能源和其他辅因子。
试剂盒可另外包含能够使上述方法的任何实施方式能够进行的一种或多种其他试剂或装置。所述试剂或装置包括一种或多种以下试剂或装置：适当的缓冲液(水溶液)、与检测部分偶联的抗体、用于酶活性标签的底物、从受试对象获得样品的要素(例如包括针的容器或装置)、测定报告物编码序列的翻译和/或表达的要素、或细胞培养物仪器。试剂可以以干燥状态存在于试剂盒中，以使液体样品重悬所述试剂。
试剂盒还可以可选地包括能够使试剂盒用于本发明方法的说明书。
本发明还提供了通过本发明方法鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂作为产物本身。这些产物在上文中在涉及测试化合物的部分有所描述。
本发明优选的HCV翻译和/或复制的调节剂包括但不限于抗体和分子量为50道尔顿至2500道尔顿的有机小分子。
HCV翻译和/或复制的调节剂可以以下述形式提供：从其天然环境中分离和/或纯化、基本纯或均质的形式、或不含或基本不含其来源或起源的其他物质。用于本文时，术语“分离的”包含了所有这些可能性。它们可以可选地带有标记或偶联至其他化合物。
可将HCV翻译和/或复制的调节剂配制为药物组合物。这些组合物除了上述物质中的一种外还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员公知的其他物质。所述物质应该无毒并且不能干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质取决于施用途径，例如口服、静脉内、经皮或皮下、鼻内、肌肉内、腹膜内途径。
口服用药物组合物可以为片剂、胶囊剂、粉末或液体形式。片剂可包括固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包含生理盐水、右旋糖或其他糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、经皮或皮下注射、或病痛位点的注射，活性成分可以为胃肠外可接受的水性溶液形式，所述胃肠外可接受的水性溶液无热原并具有适当的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员完全能够利用例如等渗载质制备适当的溶液，所述等渗载质例如有氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
为了延迟释放，HCV翻译和/或复制的调节剂可以根据本领域已知的方法包含在为缓释而配制的药物组合物中，例如由生物相容性聚合物形成的微囊中，或脂质体载体系统中。
HCV翻译和/或复制的调节剂的剂量可以根据各种参数来确定，尤其是根据所用的物质；所治疗患者的年龄、体重和情况；施用途径；和所需治疗方案。同样，医师能够对于任何具体患者确定所需的施用途径和剂量。根据特定调节剂的活性、所治疗受试对象的年龄、体重和情况以及施用频率和途径，常见的日常剂量为约0.1至50mg/kg体重。优选的是，日常剂量水平为5mg至2g。所述剂量可以作为单剂量提供，或者可以作为多剂量提供，例如定期服用的多剂量，例如每日施用2剂、3剂或4剂。
寡核苷酸抑制剂
本发明的一个方面涉及与SL9266具有互补性的寡核苷酸，所述寡核苷酸可以用于抑制HCV复制或翻译。所述寡核苷酸可以用于治疗HCV感染。通常，所述寡核苷酸作为具有磷酸二酯、2’O-甲基、2’甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、膦酸甲酯和/或硫代磷酸酯骨架化学的单链核酸提供。通常，寡核苷酸作为DNA分子提供，所述DNA分子在一个或多个位置具有修饰化学从而增加其稳定性。通常，可以提供锁核酸(LNA)。
用于本发明的寡核苷酸与SL9266的一部分或全部基本互补，并且干扰SL9266的形成、该区域与HCV基因组的其他区域的相互作用、和/或该区域与相互作用蛋白的相互作用。所述寡核苷酸干扰HCV翻译和/或复制。所述寡核苷酸可干扰翻译和/或复制中涉及的一个或多个过程，从而降低病毒基因组的翻译和/或复制。病毒翻译和/或复制的水平可以降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%直至100%。通常，所述寡核苷酸与9266至9314区域中的部分或全部互补。通常，寡核苷酸与该区域中第8至48个核苷酸的区域互补，即10至30个核苷酸，例如10至25个核苷酸。寡核苷酸长通常为8至30个碱基，例如产度为10至25个核苷酸。
寡核苷酸与SL9266茎环的一部分或全部互补。通常，提供具有100%互补性的寡核苷酸。然而，也可以接受更低水平的互补性，例如95%、90%、85%或80%。寡核苷酸因此在SL9266茎环的10、15、20、25或30个核苷酸区域中可具有1、2、3、4直至5个错配。优选100%互补性存在于茎环的一部分或全部中的在HCV基因型中保守的的位置。可以提供与SL9266的茎部分的一部分或全部、环部分的一部分或全部或茎和环部分的一部分或全部具有互补性的寡核苷酸。
示例性寡核苷酸具有序列TCACGGACCTTTCACAGC。
治疗方法和医药用途
本发明还提供了预防或治疗受试对象中的HCV感染的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的根据本发明鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂或上述寡核苷酸抑制剂。
本发明还提供了用于预防或治疗HCV感染的方法中的根据本发明鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂，或本发明的寡核苷酸抑制剂。本发明还提供了根据本发明鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂，或本发明的寡核苷酸抑制剂在制造用于预防或治疗HCV感染的药物中的应用。
在所有实施方式中，可以施用HCV翻译和/或复制的调节剂或寡核苷酸抑制剂来预防HCV感染的一个或多个症状的发作。在该实施方式中，受试对象可以无症状。受试对象可具有被HCV感染的倾向。对这样的受试对象施用预防有效量的HCV翻译和/或复制的调节剂或寡核苷酸。预防有效量是预防HCV感染的一个或多个症状的发作的量。调节剂或寡核苷酸抑制剂可以用来预防由HCV感染引起的肝病或预防肝细胞癌。
作为选择，一旦受试对象出现HCV感染的症状，就可以施用HCV翻译和/或复制的调节剂或寡核苷酸抑制剂，即，用于治愈已有的HCV感染。可以对这样的受试对象施用治疗有效量的调节剂或寡核苷酸。治疗有效量是有效改善HCV感染的一个或多个症状的量。通常，所述量降低受试对象的HCV感染或病毒滴度。
已经建立或可以执行HCV感染的动物模型也可以用于鉴定适合用于本发明的治疗方法和医药应用中的HCV翻译和/或复制的调节剂。
有复制能力的HCV病毒的产生方法
本发明还提供了有复制能力的病毒的产生方法。所述方法包括：
(a)确定HCV病毒基因组的一个或多个部分的RNA二级结构的稳定性；
(b)将所述RNA二级结构的稳定性与JFH-1HCV病毒的对应结构的稳定性进行比较；和
(c)按照与JFH-1HCV病毒的对应结构相似的方式在所述HCV病毒基因组中引入稳定所述RNA二级结构的突变，由此产生有复制能力的HCV病毒。
与其他HCV基因组构建体例如基因型1b Con1b SGR系统和基因型1a H77cDNA相比，本发明人令人惊讶地鉴定了JFH-1(HCVcc)HCV病毒的复制能力与JFH-1的RNA二级结构的特定构象和稳定性相关。因此，可通过以在JFH-1中观察到的相类似的折叠和构象来稳定病毒的RNA二级结构，从而改善HCV病毒的复制能力。
所要稳定的所述RNA二级结构可以是其稳定性和构象对HCV的复制能力有影响的HCV病毒的RNA二级结构的任何区域。所述RNA二级结构可以位于HCV基因组的5’或3’非编码区、或位于HCV基因组的编码区，并且可以与HCV基因组的这些区域中的一个或多个重叠。
优选的是，所要稳定的RNA二级结构包含SL9266/PK假结。如本文所述，本发明人已经令人惊讶地鉴定了在JFH-1与Con1b SGR系统之间SL9266/PK结构和稳定性的显著差异。据信这些差异与Con1b-SGR系统的更弱的复制表型相关。
为了确定HCV基因组中可以经修饰而与JFH-1HCV病毒的相应结构具有相似稳定性和构象的RNA二级结构的区域的稳定性，本领域技术人员可以使用本领域已知的任何适合于确定RNA二级结构区域存在的方法。特别合适的方法是SHAPE(Selective2’hydroxyl acylation analysed by primer extension，通过引物延伸分析的选择性2‘羟基酰化)。在该方法中，从例如NMIA(N-甲基靛红酸)等试剂与相关区域中RNA的2’羟基的加合物的形成的缺乏，可以推定碱基配对区域的存在。
确定RNA元件的结构和稳定性的替代性方法包括：利用不同化学修饰剂例如1-甲基-7-硝基靛红酸酐的SHAPE、利用羟基或硫酸二甲酯进行的化学作图、使用特异性核糖核酸酶如V1或T1核糖核酸酶或核磁共振谱。
然后将RNA二级结构区域的稳定性与JFH-1病毒的相应区域的稳定性进行比较。可以在相应二级结构中氢键的数量方面或者在由所有相关的分子相互作用介导的整体稳定性方面来确定稳定性，所述分子相互作用包括堆积能、非沃森-克里克碱基配对和开放或关闭的碱基对。稳定性可以以热力学方式计算。例如，稳定性的适当度量是RNA自由能。所述RNA自由能通过本领域已知的方法来计算，例如M折叠和UNA折叠。适当的方法在以下文献中有所描述：
Markham,N.R.&Zuker,M.(2005)DINAMelt web server for nucleic acid meltingprediction.Nucleic Acids Res.,33,W577-W581.
Markham,N.R.&Zuker,M.(2008)UNAFold:software for nucleic acid folding andhybriziation.In Keith,J.M.,editor,Bioinformatics,Volume II.Structure,Function andApplications,number453in Methods in Molecular Biology,chapter1,pages3–31.Humana Press,Totowa,NJ.ISBN978-1-60327-428-9.
M.Zuker.Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13),3406-3415,2003.
感兴趣的整个HCV病毒基因组中RNA二级结构的一个或多个区域的热力学稳定性可以通过计算机方法来系统分析。
所述方法因此包括突变的引入，从而提供可与JFH-1病毒的对应结构比较的所述RNA二级结构的稳定性。所述突变可以选自核苷酸取代、添加和缺失。优选的是，当在HCV病毒基因组的编码区(特别是NS5B编码序列)中引入突变时，它们不影响所编码蛋白的功能。
可比较的稳定性优选特征在于与JFH-1中的相应结构相比各相关二级结构中存在大致相同数量的氢键。例如，当相关结构是HCV病毒的SL9266茎环双链时，可比较的稳定性可包括存在的氢键数量大致与在JFH-1病毒中的SL9266茎环的上部和下部双链中观察到的相同。可比较的稳定性还可以表示以热力学术语表示为可比较的RNA自由能。
可比较的稳定性还可以(或作为选择)特征在于考虑上部和下部双链的相对稳定性。特别是，JFH-1的上部和下部双链之间的平衡有助于复制能力并且使得该区域不受上游相互作用的影响。相反，Con1b在上部和下部双链区域之间具有更大的能量差异，因此据预测较不稳定。因此，本发明包含使得上部和下部双链区域的能量差异更小的修饰，这进而降低了对来自上游序列(例如9110位核苷酸附近的保守序列)的稳定性的要求.
本发明的方法对于HCV的SL9266/PK具有特定应用。
可以在对稳定JFH-1中SL9266/PK的折叠构象有作用的SL9266/PK的任何部分中进行突变，但通常在与SL9266相邻的区域进行突变并且包含SL9266，以及在上述上游和下游SL9266-相互作用区域进行突变。HCV基因组中这些区域的核苷酸位置可以如上文中相对于用于鉴定HCV翻译和/或复制的调节剂的RNA中提供的SL9266/PK那样定义。
如图1和图4所示，JFH-1中SL9266/PK的结构的特征在于在SL9266茎环的两个环区域与上游和下游序列之间存在相互作用。SL9266的顶环与茎环SL9571的顶环相互作用，茎环SL9571位于“吻合环”相互作用中HCV基因组3’非编码区的3’端附近。SL9266的3’近末端凸环与以9110位核苷酸为中心的非结构区域相互作用。这些相互作用区域在上文中有更详细论述。另外，SL9266具有由3’近末端凸环分开的上部和下部双链。
惊讶地发现，与Con1b SGR相比，在JFH-1SL9266/PK中与顶环相邻的SL9266茎环的上部双链的稳定性显著增加。另外，发现与Con1b SGR相比，在JFH-1中在茎环基部和3’近末端凸起下面的下部双链具有更低的稳定性。
稳定性的这些相对变化具有的效果在于JFH-1中上部和下部双链具有更相似的稳定性。双链稳定性的这些变化据认为是在JFH-1中而不是Con1b中观察到的上述吻合环相互作用形成的原因。与Con1b相比，JFH-1中双链稳定性的变化还可以使涉及3’近末端凸环的上述上游相互作用去稳定。更通常的是，所述差异导致有复制能力的JFH-1系统中SL9266/PK的特定构象和稳定性。
因此，本发明通过在所述HCV病毒基因组引入突变而再现(recapitulation)了感兴趣的HCV病毒中JFH-1的SL9266/PK的复制能力构象，所述再现按照与JFH-1HCV病毒的SL9266/PK相似的方式稳定SL9266/PK。
所述突变优选产生SL9266/PK，所述SL9266/PK特征在于具有在SL9266的顶环和与HCV基因组3’末端相邻的下游顶环(也称作SL9571)之间的相互作用。该相互作用在本文中也称为“吻合环”相互作用。更优选的是，突变产生稳定性与在JFH-1病毒中观察到的相似的“吻合环”相互作用。相互作用元件优选也显示了与JFH-1病毒相似的构象和折叠。
这种突变还优选产生在SL9266的3’近末端凸环与以HCV基因组的约9110位核苷酸为中心的上游区域之间的相互作用，其具有的稳定性与JFH-1病毒中观察到的相似。相互作用元件优选也显示了与JFH-1病毒相似的构象和折叠。
还特别优选的是，所述突变为感兴趣的HCV病毒中SL9266茎环的上部和下部双链引起相似的稳定性，最佳的是与在JFH-1中SL9266的上部和下部双链中所观察到的稳定性相当的稳定性。
所述突变具有产生性质与JFH-1病毒相似的有复制能力的HCV病毒的效果。因此，突变产生的HCV病毒能够导致传染性病毒颗粒，并因此导致其他轮的病毒复制。HCV病毒通常在Huh7.5人肝癌细胞系中有复制能力。替代性的细胞系包括人Huh7人肝癌细胞。还可以在适当补充有对HCV复制必须的微小RNA(miR-122)的人HepG2细胞中显示复制。
HCV病毒可产生由JFH-1病毒所产生的传染性病毒颗粒量的约10%以上、优选20%、30%、40%、50%、60%、70%、更优选80%、90%、95%以上的传染性病毒颗粒量。
以下实施例说明本发明。
实施例
实施例1–HCV翻译中涉及SL9266/PK和NS5B多肽
图2a图示了两种RNA分子。上部的RNA分子由HCV IRES、荧光素酶报告物基因和EMCV IRES、NS5B的编码区和HCV3’非编码区(双顺反子报告物)组成。指示了SL9266/PK RNA结构的位置。星号表示引入到某些RNA分子中以防止NS5B合成的停止密码子的位置。下部的RNA仅编码NS5B，由体外转录的带帽RNA翻译而来。翻译结果如下部的图所示。1微克的双顺反子报告物转染到Huh7.5细胞中，并在转染后24小时对荧光素酶活性定量(利用商售试剂盒确定)(柱1)。相似量的在SL9266的近末端凸环内携带C9302A突变的双顺反子RNA平行转染到新鲜细胞中，并在24小时确定荧光素酶活性。将该表达水平相对由未修饰模板进行的表达(柱2)标准化。相似的是，具有停止密码子的双顺反子模板(NS5B-停止)的荧光素酶活性定量并相对未经修饰的双顺反子模板(柱3)标准化。1微克NS5B-停止和水平增加的带帽NS5BRNA的共转染(柱4至6–表示相对于双顺反子报告物有1、5和10倍摩尔过量)用于确定反式引入NS5B的效果，同样其结果相对于未经修饰的双顺反子模板的表达水平进行标准化。
构建基于Con1b HCV序列的双顺反子报告物系统，从而研究SL9266/PK和NS5B在HCV翻译中的可以作用。该报告物构建体的序列如SEQ ID NO:3所示。在该构建体中，荧光素酶报告物编码序列受HCV IRES控制。监测荧光素酶活性来确定Huh-7.5细胞中的翻译活性。
图2显示SL9266/PK和NS5B在双顺反子系统中在2至4倍范围内影响HCV IRES介导的荧光素酶报告物基因的翻译。
发现对涉及SL9266茎环的上游相互作用的破坏(利用突变C9302A或G9110U(数据未显示)增强了翻译。另外，还发现编码NS5B多肽的未成熟的截短体(NS5B-停止)也增强了翻译。相对而言，NS5B的反式过表达遏制了翻译。
其结果与NS5B和SL9266/PK在HCV翻译控制中的作用一致。通过电泳移动迁移测试(EMSA)或RNA亲和色谱(RAC)，初步观察(数据未显示)不支持NS5B与包含SL9266/PK的序列之间的直接特异的相互作用。因此，NS5B发挥的对翻译的阻遏可以是间接的。存在可以实现这种情况的多种情形；NS5B可以结合或修饰翻译所需的细胞蛋白，由此阻止其结合SL9266/PK(或受SL9266/PK结构影响的mRNA的远侧区域–参见WP3)，或包含细胞蛋白和NS5B的复合物可以在募集至SL9266/PK后实施控制。
这些可能性以及其他可能性可利用双顺反子系统进行分析。相似的是，报告物系统允许测试化合物对HCV翻译有调节效果。
实施例2–对不同HCV病毒背景中SL9266的相互作用的研究
A.材料与方法
茎环命名
本发明采用对HCV序列编号的标准化系统，其中茎环由参照H77完整基因组序列(GenBank Accession#AF011753)的结构(Kuiken等,2006)中第一个5’配对核苷酸的位置来指代。SLIV–VII或SL8828、SL8926、SL9011、SL9061和SL9118的茎环结构(此前称为5BSL3.1–3.3))分别称为SL9033、SL9132、SL9217、SL9266和SL9324。5’NCR茎环IIId称为SL253，共同形成X-尾的3个结构体(5’-SLIII、SLII和SLI-3’)命名为SL9548、SL9571和SL9601。
细胞培养
单层人肝癌细胞系Huh7.5保持在补充有10%(v/v)胎牛血清(Invitrogen)、1%非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺和100U青霉素/100μg链霉素/ml(DMEM P/S)的Dulbecco的改良最小必需培养基中。胰蛋白酶/EDTA处理后细胞传代并以1:3至1:5的稀释度接种。
HCV cDNA质粒和诱变
称为pFKnt341-sp-P1-lucEI3420-9605/5.1的亲本萤火虫荧光素酶编码Con1b复制子(方便起见，本文中称作Con1b-luc-rep)此前已有报道(Friebe等,J.Virol.,12047-12057:2001)。利用SatageneQuickChangeTM系统向在pBluescript II SK(+)(Stratagene)中克隆的该质粒的独特Spe I–Xho I子片段中引入突变。然后通过DNA测序确定其存在，之后重构到亲本质粒中。
亲本质粒pFK-J6/JFH-1-C-846(方便起见，本文中称作J6/JFH-1)全长cDNA此前已有全面描述(B.Lindenbach等2005)。对亚克隆到pUC18中的独特Hind III–Ssp I(8208-10128)片段进行QuickChangeTM诱变，通过DNA测序确认，并将修饰区域重构到Hind III–Mlu I片段(8208-9903)上的亲本cDNA中。
通过NS5B聚合酶的活性位点内的取代(GDD至GND)，产生了复制子和感染性病毒系统的不能复制的衍生物。
体外RNA转录
为了利用T7MEGAscript试剂盒(Ambion)根据制造商的说明书体外产生RNA，将1μg的J6/JFH来源质粒cDNA(其包含5’顺式作用RNA切割核酶)或ScaI-线性化的Con1b-luc-rep cDNA用作模板。RNA以RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)纯化，通过变性琼脂糖凝胶电泳确认完整性，并通过NanoDrop光谱进行定量。
用于SHAPE的RNA修饰
将SHAPE反应的模板—在10μl0.5×Tris-EDTA(pH8.0)(TE)中的40pmol的亚基因组RNA转录物(HCV基因组的nt.9005至3’末端)或10pmol的全长pFK-J6/JFH-1-C-846或Con1b-luc-rep RNA转录物，在95℃加热3分钟，在冰上温育3分钟，然后补充6μl的折叠缓冲液(330mM HEPES,[pH8.0],20mM MgCl2,330mMNaCl)，并使其在37℃重折叠20分钟。
然后将样品分为两半，并以1μl的溶于DMSO的100mM NMIA或1μl的DMSO在37℃温育45分钟。各反应通过乙醇沉淀终止，然后添加100μl的EDTA(100mM)，4μl的NaCl(5M)和2μl的糖原(20mg/ml)。样品重悬于含有RNA安全物(Ambion)的0.5×TE中，并加热至65℃10分钟，然后用于引物延伸反应。
5’-[32P]-引物标记
将60μM引物与10个单位的T4 多核苷酸激酶(New England Biolabs)、2μl所补充的10×缓冲液和12.5μl γ-[32p]-CTP(PerkinElmer)在37℃温育20分钟，通过在65℃温育20分钟终止反应。放射性标记的引物通过20% PAGE凝胶(7M尿素)纯化，从凝胶切片中过夜被动洗脱到水中，乙醇沉淀并在使用前重悬于100μl的1mM HEPES(pH8.0)中。
用于SHAPE的引物延伸反应
将NMIA-或对照-处理的RNA与3μl的30μM放射性标记引物混合，在95℃变性5分钟，然后在35℃温育5分钟，从而使引物退火，然后在冰上骤冷2分钟。添加6μl的RT混合物(5×Superscript III缓冲液,17mM DTT和1.7mM dNTP;Invitrogen)，然后将样品在55℃温育1分钟，之后添加1μl的Superscript III (Invitrogen)，并继续在55℃再温育30分钟。
通过添加1μl的4M NaOH并在95℃温育5分钟来降解DNA模板，然后添加29μl的酸终止混合物(160mM未缓冲的Tris-HCL、73%甲酰胺、0.43×TBE,43mM EDTA[pH8.0]、溴苯酚蓝和二甲苯苯胺失踪染料)，之后再于95℃温育5分钟。
通过添加2μl的20mM ddNTP(Fermentas)，然后添加RT混合物来延伸未经修饰的RNA，从而产生二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)测序标记物。通过在70W进行变性电泳(7%(19:1)丙烯酰胺:二丙烯酰胺、1×TBE、7M尿素)1小时和5小时(时间取决于所要分析的片段尺寸)来分离cDNA延伸产物，并在光学成像仪(Fujitsu)上视觉观察。利用TotalLab1D凝胶分析软件在每个核苷酸位置上分析NMIA-和DMSO对照-反应中图像的平均带强度/像素。
复制子分析、病毒回收和定量
通过电穿孔对Huh7.5细胞进行转染。简言之，将胰蛋白酶化并洗涤的Huh7.5细胞以3×107个细胞/ml重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，与5μg的体外转录RNA在预冷的4mm比色皿中混合，利用Bio-Rad Gene Pulser Xcell单元脉冲一次(方波脉冲，250V进行25毫秒)，然后在冰上温育5分钟，最终重悬于10ml的DMEM P/S中。
利用Bright-Glo裂解缓冲液(Promega)和Turner TL-20光度计，对于转移至六孔板中、以PBS洗涤两次、以0.5ml Glo-裂解缓冲液(Promega)裂解并在分析之前冻存的2.5ml的经转染的重悬细胞，在转染后4、24、48和72小时确定由Con1b-luc-rep复制子进行的荧光素酶表达。
为了分析J6/JFH-1cDNA的传染性，将2ml的重悬转染细胞转移到六孔板的单孔中，其余8ml转移到T75烧瓶中。3天后，将六孔板中的单层以PBS洗涤两次，以1ml的4%多聚甲醛固定20分钟，并再次以PBS洗涤两次。从T75烧瓶收获上清液，通过离心澄清，以0.20μM过滤器过滤，并对Huh7.5细胞一式三份地测定病毒滴度，并且表示为焦点形成单位/ml(ffu/ml)。
在两种情况中，利用以1:5000稀释在10%胎牛血清(FBS)中的针对NS5A(αNS5A)的多克隆绵羊抗体，在以恒定振荡在0.1%Triton PBS温育7分钟从而渗透并随后以PBS洗涤的经固定细胞中通过免疫荧光来测定复制病毒。温育1小时后，通过UV显微术，利用在PBS中洗涤并在分析前于含0.1%VECTASHIELD DAPI(VectorLaboratories)的PBS中储存的AlexaFluor594偶联的二抗抗绵羊抗体(在10%FBS中1:500;Invitrogen)检测一抗。
B.结果
SL9266的SHAPE作图
SHAPE(通过引物延伸分析的选择性2’-羟基酰化)利用对折叠RNA分子中未配对碱基的化学修饰使它们在引物延伸反应期间不可复制。结果，通过对引物结合位点的明智选择，可以对RNA分子中局部和远程相互作用进行作图。另外，通过分析单独或补偿的点突变，可以确定复制基因组中产生表型效果的突变对RNA结构的影响。
发明人通过对源自编码荧光素酶的Con-1b来源的亚基因组复制子(Con1b-luc-rep)或源自J6/JFH-1的RNA转录物的SHAPE分析，研究了SL9266的结构。在各情况中，两个正义转录物用于SHAPE作图研究；质粒载体中的噬菌体T7聚合酶产生的全长转录物或从基因组的9005位核苷酸至最3’端的PCR产物产生的亚基因组转录物。
没有例外，对于Con1b-luc-rep或J6/JFH-1，以较长模板获得的结果通过所分析的区域均不能区分，表明较短的NS5B-3’UTR模板中存在的RNA结构根本不受病毒基因组中其他地方序列的影响。
发明人初始分析了J6/JFH-1中SL9266中的序列和附近的序列对化学修饰物(NMIA)的暴露。发明人观察到生物信息学预测的结构与对该区域此前进行的生物化学作图(Tuplin等,2004)之间有良好的相关性。例如，如U9240、U9241、A9242和U9243处的强终止所表明的(在解读SHAPE放射自显影时，注意到引物延伸产物终止在不可复制的化学酰化的暴露核苷酸之前的碱基处)，5’紧邻结构(SL9118)的末端核苷酸(9239-9242)未配对。在SL9118双链的3’侧内，存在U9259处的另外的显著的终止，表明G9258如预测那样未配对。
紧邻SL92663’的序列与NMIA有强反应性，表明如预测那样该区域(9313-9323位核苷酸)明显未配对。还显示出未表现NMIA反应性的SL9324的茎的5’部分(9324-9336位核苷酸)，与预测的结构相符(Tuplin等,2004).
在J6/JFH-1SL9266本身内，在减去不存在NMIA时的信号之后，发明人分析了NMIA反应性和将各核苷酸的暴露定量，并在感兴趣区域中延伸窗口中进行标准化。该方法使得容易与其它基因组或同一序列的变体的相似区域进行比较(见下文)。
所暴露的核苷酸得分为正。相反，与NMIA反应性差或不反应的核苷酸评分为负值。在J6/JFH-1SL9266中，G9273像UC9312-9313那样充分暴露。前一核苷酸占据了下部双链的顶部，与近末端凸环相对，而后者位于结构的3’碱基。
如果SL9266的末端和近末端环均未配对，则发明人预期分别占据9280-9291位核苷酸和9298-9305位核苷酸的这些序列有广泛的NMIA反应性。然而，所观察到的并非如此。两个区域均表现出一些暴露的核苷酸(9281-9284和9298-9300)，其余部分显示出低于平均的暴露，表明它们受到保护而免于与NMIA反应。
应注意，SL9266末端和近末端环中明显不与NMIA反应的区域是预测与HCV基因组中其他地方的序列形成远程相互作用的那些区域。J6/JFH-1SL9266的其余区域显示出低于平均NMIA反应性，支持了对于双链区域的生物信息学预测。
为了比较，发明人对Con1b SL9266进行了相同的分析。并不令人吃惊的是，形成下部双链的基部处的互补对的G9313和C9266均对NMIA有较差反应性。与J6/JFH-1的SL9266的情况相反，末端环中的几乎每个核苷酸均充分暴露(9281-9289)，并且在近末端环区域中有极少或没有反应性，仅G9273有弱信号。从这一初步比较中明显看出，本发明的SHAPE分析支持了J6/JFH-1和Con1b中SL9266的核心局部双链结构，但SL9266与其他区域的相互作用–表现为末端和近末端环的暴露–差异显著。
影响SL9266的预测相互作用的突变体的SHAPE作图
对J6/JFH-1和Con1b中的SL9266的天然结构的初步分析促使本发明人研究抑制基因组复制的突变的SL9266的结构和相互作用的后果。另外，发明人研究了远端区域中局部RNA结构–以9110位核苷酸为中心的X-尾茎环SL9571中–已知或预测SL9266与其相互作用。具体而言，发明人分析了突变的作用，所述突变破坏(G9110U或C9302A;数据未显示)或恢复(G9110U和C9302A;数据未显示)所提出的在近末端凸环与9110位核苷酸附近序列之间相互作用(Diviney等,2008)。
发明人还研究了SL9266的末端环与SL9571的相互作用(Friebe等,2005)的破坏(G9583A;图3中的小图A)和恢复(C9287U和G9583A;数据未显示)。
J6/JFH-1:SL9266近末端凸环和9110区域
在J6/JFH-1中，G9110U或C9302A取代对SL9266或SL9266相互作用序列的效果几乎不能区分。每一种取代均显著增加了SL9266的近末端凸环中序列(9298-9305)的暴露，并同时增加了以9110位核苷酸为中心的上游区域中序列(9108-9113)的暴露。
G9273–接近SL9266下部双链的顶部的核酸，与近末端凸环相对定位(图1A)–的显著降低的暴露表明，存在由抑制远程上游相互作用导致的对于SL9266的另外的结构后果。
上游相互作用的抑制对与SL9571相互作用的SL9266的末端环序列的暴露影响极小(如果有任何影响的话)，不过与SL9571相互作用序列紧邻的UU9281-9282的反应性有很小的下降。C9302A和G9110U共变体取代的一同引入没有恢复在天然序列中可见的J6/JFH-1SL9266的结构。实际上，在存在双突变或个别任一突变的情况下SL9266的结构之间有极小差异。类似的是，双突变体中SL9571和9110区域的NMIA反应性与任一单独突变体完全不能区分。
Con1b:SL9266近末端凸环和9110区域
Con1b和J6/JFH-1模板中SL9266序列的NMIA-反应性之间有显著差异。在Con1b中，SL9266的天然结构似乎主要与大多未配对的SL9266的末端环–以及SL9571中的互补序列形成上游相互作用。
为抑制上游相互作用而设计的取代(G9910U或C9302A)增加SL9266的近末端环中序列的暴露，虽然这在9298-9300位核苷酸中最显著。同时，上游区域–包括所有提出的相互作用序列–变得显著有更多NMIA反应性。在G9910U或C9302A共变体取代存在下，SL9266的末端和近末端环以及9110位核苷酸附近区域的NMIA-反应性恢复到野生型水平。G9110U或C9302A取代也均导致SL9266的末端环和SL9571中序列的暴露稍微减少。
这表明Con1b SL9266的相互作用虽然强烈偏好上游区域，但是能够在SL9266的末端环与SL9571之间发生。虽然两个取代的存在对SL9266的末端环恢复了接近天然的NMIA反应性，但SL9571的暴露极少有明显变化，不过应该注意由于该区域已经是大部分未配对并暴露，小变化难以定量。
J6/JFH-1:SL9266末端环和SL9571
发明人研究了通过向3’X尾中SL9571引入G9583A取代而破坏SL9266的末端环和SL9571的相互作用的后果。所观察到的NMIA-反应性支持所提出的这些区域的相互作用；SL9266中的9280-9289位核苷酸和SL9571中的9581-9588位核苷酸在G9583A存在下变得显著更暴露于NMIA。在SL9571内，侧接于末端环的区域显示出降低的NMIA反应性。与此相反，9110区域中序列的暴露有极少或没有变化。
通过引入C9287U和G9583A的共变体取代而恢复J6/JFH-1SL9571和SL9266末端环的相互作用，减少了两个末端环区域的暴露，并将侧接于SL9571末端环的序列的暴露，增加至近似天然水平。
未修饰模板和携带G9583A突变之间的SL9571结构惊人变化在原始SHAPE反应性方面特别明显；在前者中，与SL9266的区域相互作用比占据SL9571的所提出双链区域的侧翼序列有更少NMIA暴露。相反，这种暴露在G9583A突变体中恢复，其中SL9571的末端环是唯一展示出高水平SHAPE反应性的区域。无论是单独的G9583A突变还是C9287U与G9583A的组合均不引起9110位核苷酸附近区域中序列的NMIA可及性的显著变化。
Con1b:SL9266末端环和SL9571
为测试SL9571和SL9266相互作用而设计的单独的C9287U取代或者C9287U和G9583A取代对后一结构的末端环的暴露几乎没有作用。另外，这些取代对于SL9266的其余部分或对9110附近的上游区域没有可测量的作用，例外是在两种修饰模板中G9103的暴露降低(这也见于所有突变模板中。然而，C9287U确实轻微地提高了SL9571末端环的暴露，特别是在与末端环侧接的序列对比时尤其如此。这些变化通过C9287U和G9583A突变的存在而得到至少部分恢复。
对J6/JFH-1SL9266假结进行诱变的表型结果
发明人此前报道了在基于Con1b的亚基因组复制子研究中支持以9110和9302位核苷酸为中心的核苷酸序列之间预测的相互作用的遗传学证据(Diviney等,2008)。破坏SL9266的上游区域和近末端凸环之间生物信息学预测配对的突变抑制了复制。引入位于9110和9302的共变体恢复了复制，从而确认了所述RNA-RNA相互作用的重要性，而不是序列本身的重要性。
发明人分析，由于在基因型2a JFH-1基因组中9110和9302之间的远程相互作用同样能够很好地预测–实际上所预测的相互作用序列相似–在J6/JFH-1HCVcc系统中作出的类似的突变能够展示出等同的表型。
J6/JFH-1基因组通过引入G9110U取代或C9302A和C9303G的双取代而进行修饰，所有这些突变据预测能抑制SL9266的近末端凸环与上游区域的相互作用。另外，发明人在同样的基因组中工程化了G9110U和C9302A突变，恢复了序列之间的互补性。
将体外转录的RNA转染到Huh-7.5细胞中，72小时后收获上清液病毒并进行定量。在这些研究中，对照未经修饰的J6/JFH-1基因组产生～105个集落形成单位/ml(ffu/ml)，而在NS5B聚合酶活性位点内具有突变的基因组不复制并且不产生子代病毒。
携带G9110U取代的基因组与未修饰病毒不可区分地复制，而携带C9302A；C9302A和C9303G；或G9110U和C9302A基因组均产生比阳性对照少约0.5log10的病毒。这些病毒的进一步传代没有增加病毒产量。
由于所观察到的病毒表型与那些根据此前基于复制子的研究预测的表型有惊人的差异，发明人继续研究J6/JFH-1SL9266的核心结构或SL9266与X尾中序列相互作用中涉及的序列的突变的后果。
C9275G和G9293A(二者均破坏SL9266的上部双链区域)的双取代在RNA转染时没有产生可检测的病毒，但进一步传代产生了～102ffu/ml，推测这反映了具有恢复的复制能力的回复体或共变体基因组的选择。在已经携带C9275G和G9293A的基因组中引入另外的C9278U和G9296C取代从而恢复SL9266上部双链的完整性，这将复制能力完全恢复到亲本J6/JFH-1水平。
最后，SL9571末端环中G9583A的单一点突变显著降低了病毒产量，其在后续连续传代时仅部分恢复。与表明该区域结合SL9266末端环的公开研究(Lohmann等,2003)一致，发明人证明双突变体C9287U和G9583A以野生型水平复制。
结论
目前，两种广泛接受的用于研究HCV复制的方法是基因型1b来源的亚基因组复制子或基因型2a JFH-1(或其嵌合衍生物)HCVcc系统(Lohmann等,1999;Wakita等,2005)。
为了有效复制，前者的基因组在体外传代期间已经获得了主要在NS5A非结构蛋白中的适应性突变(Blight等,2000;Lohmann等,2003;Lohmann等,2001)。这些增强基因组复制，但可能与体内复制不相容(Bukh等,2002)，或不增加病毒颗粒的产量(Ikeda等,2002;Pietschmann等,2002)。
相反，源自爆发性肝炎病例的JFH-1复制良好并产生高水平的传染性子代颗粒(体外和体内)，而不获得细胞培养物中的适应性突变(Lindenbach等,2005;Wakita等,2005;Zhong等,2005)。
发明人发现，两种HCV基因型的复制能力的差异可以在SL9266/PK中存在的结构和相互作用水平上解释。
虽然SL9266的核心结构相似，但当两种表型进行比较时由末端环和近末端环显示出的相互作用之间有惊人差异。这些差异在分析未修饰模板时显而易见，并且随后得到SL9266以及与其相互作用区域的突变的支持。引人注意的是，此前报道的SL9266末端环和SL9571之间的‘吻合环’远程相互作用也影响X尾的后一区域的结构。
在Con1b和JFH-1中观察到的相互作用的最显著差异在SL9266的末端环和形成SL9571的末端环的序列之间。如已经表明的，在JFH-1中该相互作用能够容易观察、被G9583A取代破坏，并且通过添加共变体C9287U突变而恢复。相反，在Con1b中，利用SHAPE作图在基因组的这些区域之间几乎没有相互作用的证据。Con1b中的G9583A取代没有增加SL9266末端环的暴露，也没有改变X尾区域中序列的NMIA可及性。发明人因此提出SL9266的稳态构象和相互作用在Con1b和JFH-1基因组之间根本不同。
通过比较天然SL9266结构和突变SL9266结构得到的惊人和出乎预料的结果是SL9266末端环与3’X尾中的序列之间的相互作用显著影响SL9571的结构。在J6/JFH-1中，未经修饰的模板在预测形成SL9571的茎区域的序列中显示出约2倍高的NMIA-反应性。相反，在G9583A存在下，SL9571的所预测的茎区域变为无NMIA反应性，而整个末端环(9581-9588)变为暴露。
这种情况在Con1b SL9571的未经修饰结构中非常相似，其中大部分SL9266配对位于9110区域，这是在G9583A取代存在下而加剧的位，所述G9583A消除侧接SL9571末端环的序列的NMIA-反应性。本发明初步研究表明H77的SL9266(基因型1a原型株)在结构上与Con1b(数据未显示)相似，其中SL9266的末端环未与SL9571配对并且近末端环与9110位核苷酸附近的序列完全配对。
发明人认为在不发生与SL9266的‘吻合环’相互作用时，对SL9571–核苷酸9571-9597–的形成有贡献的序列仅形成茎环结构。
本发明数据表明Con1b SL9266的上游相互作用抑制了后者与SL9571的相互作用。相反，在J6/JFH-1中，5’和3’相互作用是独立的。另外，发明人已经显示出‘吻合环’相互作用根本上影响J6/JFH-1中的SL9571结构，并且相似的是–虽然没有那么显著–在Con1b SL9571中可辨识出改变。
发明人提出SL9266的一个功能是通过该‘吻合环’相互作用控制SL9571的结构。由于‘吻合环’相互作用已显示出在Con1b和J6/JFH-1中是必须的，因此表明SL9571可能参与衣壳化事件之前的关键复制阶段。
实施例3–实验系统
翻译测试
翻译测试利用实施例1所述的双顺反子报告物基因系统。简言之，萤火虫荧光素酶报告物基因受作为HCV完整5’非翻译区一部分的HCV内部核糖体进入位点(IRES)的翻译控制。荧光素酶基因之后为来自不相关病毒(脑心肌炎病毒;EMCV)的IRES，其驱动HCV(NS5B蛋白)的所述RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的表达，其后进而是HCV3’非翻译区(3’UTR)。
所有实验在人肝癌细胞–Huh-7.5中常规进行。Huh-7.5是其中HCV可复制的细胞系。然而，发明人还研究了在HepG2、HeLa和鼠类细胞系中以及在补充有Huh-7.5细胞提取物的无细胞翻译系统中的双顺反子报告物系统。除了鼠类细胞系之外，发明人在测试的所有细胞系中和在无细胞翻译系统中证明了翻译控制。
翻译测试的读取结果为荧光素酶活性。为控制转染的差异，本发明共转染了编码海肾荧光素酶的单独质粒，并将所有萤火虫结果相对其进行标准化。
通常通过共转染由具有所测试的寡核苷酸的双顺反子报告物质粒体外产生的RNA，从而进行翻译抑制测试。荧光素酶测试在转染后4小时常规进行。
亚基因组复制子测试
该测试利用与Lohmann(Lohmann等,1999)所描述类似的亚基因组复制子。如上所述，发明人共转染了编码海肾荧萤火虫光素酶的RNA，从而进行转染水平的标准化。在这些测试中，发明人通常在添加寡核苷酸之前24小时转染亚基因组复制子(和海肾)RNA。
病毒产生测试
该测试利用此前描述的测定传染性基因型2a JFH-1丙肝病毒(Wakita等,2005)HCVcc系统。该测试中，将针对RNA序列或结构的寡核苷酸转染到Huh-7.5细胞中，4小时后键入已知量的病毒。温育24小时后，细胞片固定，并通过对病毒抗原(此处为NS5A蛋白)的免疫染色来定量病毒复制。利用荧光显微镜对感染的细胞计数。
寡核苷酸
我们的研究中采用的合成寡核苷酸由Invitrogen制备，并且为LNA(锁核酸)。这意味着它们具有经修饰的化学，这使得它们在细胞中较不易被降解。
发明人测试了针对SL9266或SL9571(其3’UTR中的茎环与SL9266形成“吻合环”)的4种寡核苷酸和相关对照。针对Con1b SL9266和SL9571的寡核苷酸如图5和以下所示，针对JFH-1的SL9266和SL9571那些寡核苷酸如图6和以下所示所显示了寡核苷酸序列，对经LNA-修饰的碱基加下划线。列出了寡核苷酸的各种物理特性。与所述寡核苷酸互补的HCV序列在图中以粗体突出标示。
Con1b抗SL9266LNA寡核苷酸
5’-GGGCACGAGACAGGCTGTGAT-3’
21个碱基
作为RNA/DNA双链的Tm=84℃
自杂交评分29
二级结构评分22
随机化LNA寡核苷酸
5’-GCACAGCGCAAGTATGTTA-3’
19个碱基
作为RNA/DNA双链的Tm=85℃
自杂交评分37
二级结构评分23
JFH-1抗-SL9266LNA寡核苷酸
5’-ACGCTGTGAAAAATGTC-3’
17个碱基
作为RNA/DNA双链的Tm=79℃
自杂交评分37
二级结构评分30
Con1b/JFH-1抗-SL9571LNA寡核苷酸(该寡核苷酸靶向在Con1b分离株和JFH-1分离株中的保守序列)
5’-TCACGGACCTTTCACAGC-3’
18个碱基
作为RNA/DNA双链的Tm=85℃
自杂交评分28
二级结构评分24
结果
翻译测试–针对SL9266的寡核苷酸抑制丙肝病毒的翻译。所显示的结果相对于未处理的样品进行了标准化。混杂序列(阴性)对照仅具有有限影响，当以1600nM添加时达到最大～20%抑制。相反，针对SL9266的寡核苷酸显示出对翻译高达80%的抑制。在这些测试中，在不合成NS5B的双顺反子报告物版本中观察到了最大抑制(见图7)。
利用亚基因组复制子的复制测试–在该测试中，发明人研究了亚基因组复制子对荧光素酶基因活性编码的抑制和针对SL9266或SL9571的寡核苷酸之前转染的影响。亚基因组复制子是基因型1b序列(Con1b)，并且针对SL9266的直接互补寡核苷酸(经标记的抗SL9266_C)抑制～70%的复制(见图8)。相反，与基因型2a(JFH-1)的SL9266互补的寡核苷酸仅具有部分抑制性。该寡核苷酸仅展示出与Con1b亚基因组复制子的部分互补性：
Con1b序列CAGCGGGGGAGACAUAUAUCACAGCCUGUCUCGUGCCCGACCCCGCUG
SL9266_C AUCACAGCCUGUCUCGUGCCC
SL9266_J GACAUUUUUCACAGCGU
SL9266_J匹配Con1b||||||||||||||
利用JFH-1(基因型2a)的病毒复制测试–在该测试中，发明人测试了针对SL9266和SL9571的寡核苷酸。与未经处理的细胞相比，混杂寡核苷酸对病毒复制几乎没有影响或没有影响。相比之下，针对SL9266和SL9571的寡核苷酸的量增加抑制病毒复制高达60%至80%(见图9)。
Figure IDA0000482944430000011
Figure IDA0000482944430000021
Figure IDA0000482944430000031
Figure IDA0000482944430000041
Figure IDA0000482944430000051
Figure IDA0000482944430000061
Figure IDA0000482944430000081
Figure IDA0000482944430000091
Figure IDA0000482944430000101
Figure IDA0000482944430000111
Figure IDA0000482944430000121
Figure IDA0000482944430000131

Claims (32)

1.一种调节丙肝病毒(HCV)翻译和/或复制的化合物的鉴定方法，所述方法包括：
(a)使包含SL9266/PK假结或其变体和能够翻译的报告物编码序列的RNA在NS5B多肽或其变体的存在下与所述化合物接触；和
(b)测定所述报告物编码序列的翻译。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
(c)将步骤b)中测定的报告物编码序列的翻译与对于未与所述化合物接触的步骤a)中的RNA所获得的对照值进行比较，由此确定所述化合物是否是HCV翻译和/或复制的调节剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述NS5B多肽或其变体反式表达。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA还包含能够翻译的NS5B或NS5B变体编码序列。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述报告物编码序列和NS5B或NS5B变体编码序列从所述RNA的不同顺反子翻译。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述报告物编码序列和/或所述NS5B或NS5B变体编码序列与内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接。
7.如权利要求6所述的方法，其中，与所述报告物编码序列可操作地连接的所述IRES是HCV IRES。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述SL9266/PK假结包含在源自HCV的3’非编码区中，和/或所述RNA包含源自HCV的5’非编码区。
9.一种增强或抑制NS5B多肽对HCV翻译的阻遏的化合物的鉴定方法，所述方法包括进行前述权利要求中任一项所述的方法，由此鉴定增强或抑制所述NS5B多肽对HCV翻译的阻遏的化合物。
10.一种增加或减少HCV复制的化合物的鉴定方法，所述方法包括进行权利要求1至8中任一项所述的方法，从而鉴定增加或减少HCV复制的化合物。
11.一种适合于预防或治疗HCV感染的化合物的鉴定方法，所述方法包括进行前述权利要求中任一项所述的方法，由此鉴定适合于预防或治疗与HCV感染相关的疾病的化合物。
12.一种RNA，所述RNA包含SL9266/PK假结或其变体以及能够翻译的报告物编码序列。
13.如权利要求12所述的RNA，所述RNA还包含能够翻译的NS5B或NS5B变体编码序列。
14.如权利要求13所述的RNA，其中，所述报告物编码序列和NS5B或NS5B变体编码序列位于不同的顺反子。
15.如权利要求11至14中任一项所述的RNA，其中，所述报告物编码序列和/或所述NS5B或NS5B变体编码序列可操控地连接至内部核糖体进入位点(IRES)。
16.如权利要求15所述的RNA，其中，与所述报告物编码序列可操作地连接的所述IRES是HCV IRES。
17.如权利要求12至16中任一项所述的RNA，其中，所述SL9266/PK假结包含在源自HCV的3’非编码区中，和/或所述RNA包含源自HCV的5’非编码区。
18.一种通过权利要求1至11中任一项所述的方法鉴定的HCV翻译和/或复制的调节剂。
19.权利要求18所述的HCV翻译和/或复制的调节剂在制备用于预防或治疗HCV感染的药物中的应用。
20.一种预防或治疗受试对象中HCV感染的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的权利要求18所述的HCV翻译和/或复制的调节剂。
21.一种权利要求18所述的HCV翻译的调节剂，所述调节剂用于预防或治疗HCV感染的方法。
22.一种产生有复制能力的HCV病毒的方法，所述方法包括：
(a)确定HCV病毒基因组的一个或多个部分的RNA二级结构的稳定性；
(b)将所述RNA二级结构的稳定性与JFH-1HCV病毒的对应结构的稳定性进行比较；和
(c)按照与JFH-1HCV病毒的对应结构相似的方式在所述HCV病毒基因组中引入稳定所述RNA二级结构的突变，由此产生有复制能力的HCV病毒。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述RNA二级结构包含来自所述HCV病毒基因组的编码区和/或3’非编码区的RNA二级结构。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述RNA二级结构包含SL9266/PK假结。
25.如权利要求24所述的方法，其中，在所述HCV病毒中所述突变增强SL9266/PK的顶环相互作用的稳定性和/或降低SL9266/PK的凸环相互作用的稳定性。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中，所述突变改变所述RNA二级结构之中或之间的氢键合。
27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中，当将所述突变引入到所述HCV病毒基因组的编码区中时，它们不损害所编码蛋白的功能。
28.一种长度为包含8至48个核苷酸的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸与HCV的9266至9314中的部分或全部区域基本上互补。
29.如权利要求28所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸长度为8至30个核苷酸。
30.如权利要求28或29所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸与HCV的9266至9314中的部分或全部区域100%互补；或者其中，所述寡核苷酸包含1、2、3或4个错配。
31.如权利要求28至30中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含一个或多个锁核酸。
32.如权利要求28至31中任一项所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸用于预防或治疗HCV感染。
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