CN103819632B

CN103819632B - 一种西布曲明磁性分子印迹聚合物及其制备方法

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Publication number: CN103819632B
Application number: CN201410052919.5A
Authority: CN
Inventors: 许贯虹; 陈明路; 赵婷; 吴剑虹; 李婷; 李飞; 胡琴
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-02-17
Also published as: CN103819632A

Abstract

一种西布曲明磁性分子印迹聚合物及其制备方法,该分子印迹聚合物为具有以Fe₃O₄SiO₂磁性纳米粒为芯，西布曲明分子印迹聚合物为壳的芯壳结构的磁性分子印迹聚合物。通过本发明制得的磁性分子印迹聚合物对西布曲明存在特异性的吸附，能够减少其他成分对西布曲明检测的干扰，更重要的是可以在外加磁场的定向控制下，简便地完成吸附、清洗、解吸，操作简便，适合于功能食品中违法添加的西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂的检查。

Description

一种西布曲明磁性分子印迹聚合物及其制备方法

技术领域

本发明属于分子印迹聚合物技术领域，具体涉及提供一种对西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂有特异性识别作用的磁性分子印迹聚合物(MMIPs)。利用该磁性分子印迹聚合物，能够在复杂环境中识别西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂，可用于功能食品中违法添加的西布曲明的检查。

背景技术

西布曲明(Sibutramine)是一种中枢神经抑制剂，具有兴奋、抑食等作用。但是，西布曲明可能增加服用者患心脏病及中风几率，2010年含西布曲明成分的减肥药已经被欧美等地区禁止销售使用，我国同样于2010年禁止销售使用含西布曲明成分的减肥药。但是，功能食品中违法添加西布曲明的案例屡见报道，西布曲明在动物体内迅速代谢为活性代谢物M₁(N-{1-[1-(4-氯苯基)环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基胺)和M₂(N-1-[1-(4-氯苯基)环丁基]-3-甲基丁基胺)，M₁和M₂的药理作用较其原形药药效强大约100倍左右，因此它主要通过其活性代谢物而发挥作用。不法分子有时通过在功能食品中违法添加西布曲明活性代谢物M₁和M₂逃避检查，因此，需要同时检查西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂。

功能食品中的天然产物成分复杂，为排除功能食品中的天然产物对违法添加西布曲明检测的干扰，需要采用昂贵、维护费用高的高效液相色谱-质谱仪等大型仪器，增加了检测的成本。

分子印记聚合物具有强特异性和高选择性，但是，分子印迹聚合物的吸附、清洗、解吸需要采用离心分离等方法，分离过程比较复杂。磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体，在外加磁场的定向控制下，通过吸附、清洗、解吸操作，可以一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子，具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点，已经广泛用于复杂环境中微量成分的检测（JournalofHazardousMaterials2011，191:177–183）。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可用于识别西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂的磁性分子印迹聚合物及其制备方法。该磁性分子印迹聚合物能够识别具有西布曲明，在外加磁场的定向控制下，可以简便地完成吸附、清洗、解吸。可用于功能食品中违法添加的西布曲明的检查。

技术方案：一种西布曲明磁性分子印迹聚合物，具有以Fe₃O₄SiO₂磁性纳米粒为芯，西布曲明分子印迹聚合物为壳的芯壳结构的磁性分子印迹聚合物。

所述西布曲明磁性分子印迹聚合物:

a.以Fe₃O₄SiO₂磁性纳米粒为芯，西布曲明分子印迹聚合物为壳；

b.西布曲明分子印迹聚合物，其中：模板分子为：（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲胺；

c.西布曲明分子印迹聚合物，其中：先将模板分子与甲基丙烯酰氯反应，生成（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺；

d.西布曲明分子印迹聚合物，其中：功能单体为4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶、丙烯酰胺中的至少一种，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种，引发剂为偶氮二异丁腈。

上述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，步骤为：a.将功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒、（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺和功能单体按1:（2-1）:3的摩尔比溶解到含有交联剂、引发剂的甲苯-乙腈溶液中，其中甲苯:乙腈的体积比为9:1，室温搅拌预聚；按比例，100mL甲苯-乙腈溶液中含Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-丙烯酰胺，2-3mmol的功能单体，4-6mmol交联剂和80mg引发剂；b.将预聚液密封后，采用加热搅拌的方式聚合反应生成粉末状聚合物，聚合反应温度为50-85℃，反应时间为12-36h；c．将所得的MMIPs在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性；d.提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到西布曲明磁性分子印迹聚合物。

所述功能单体为4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶中的至少一种。

所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种。

所述引发剂为偶氮二异丁腈。

所述（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺的制备方法为：按比例，将（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲胺3.0g溶于二氯甲烷30mL中，搅拌下加入甲基丙烯酰氯2.0mL，反应2小时，反应体系加水50mL，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和NaCl洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干，得淡黄色液体，硅胶柱层析提纯，得黄色油状物2.2g。

所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，按比例，取功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-丙烯酰胺，2mmol的功能单体2-乙烯吡啶均匀地分散于100mL甲苯-乙腈溶液中，其中甲苯:乙腈的体积比为9:1，室温搅拌预聚1h；然后加入4mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）和80mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），通氮气15min除去氧气后密封，升温至50℃加热反应6h；然后再升温至60℃反应24h；最后在85℃下反应6h结束；将所得的MMIPs在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性即可，聚合物真空干燥备用。

所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，按比例，取功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺，3mmol的功能单体4-乙烯吡啶均匀地分散于100mL甲苯-乙腈溶液中，其中甲苯:乙腈的体积比为9:1，室温搅拌预聚1h；然后加入6mmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA）和80mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），通氮气15min除去氧气后密封，升温至50℃加热反应6h；然后再升温至60℃反应24h；最后在85℃下反应6h结束；将所得的MMIPs在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性即可，聚合物真空干燥备用。

所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，按比例，取Fe₃O₄SiO₂磁性纳米粒1.0g，分散于100mL甲苯中，加入γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH-570)20mL，在氮气保护下120℃加热回流24h；利用外磁场，将所得的产物依次用乙醇、甲苯洗涤纯化，真空干燥，得功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒。

有益效果：制得的磁性分子印迹聚合物对西布曲明存在特异性的吸附，能够减少其他成分对西布曲明检测的干扰，更重要的是可以在外加磁场的定向控制下，简便地完成吸附、清洗、解吸，操作简便，适合于功能食品中违法添加的西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂的检查。

附图说明

图1是西布曲明、西布曲明体内代谢物M1、西布曲明体内代谢物M2的化学结构。

图2是西布曲明磁性分子印迹聚合物（方法2）的透射电镜图，粒子中心最暗的部分为Fe₃O₄，中间相对较暗的为SiO₂层（a：20-40nm），最外缘为分子印记层（b：20-30nm）。

图3是西布曲明磁性分子印迹聚合物选择性吸附试验。西布曲明MMIPs（方法2）对西布曲明、西布曲明体内代谢物M1、西布曲明体内代谢物M2均有良好的吸附效果，其吸附量远大于MNIPs。说明西布曲明MMIPs具有对西布曲明及其代谢物分子具有特异性识别作用。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：磁性纳米粒（Fe₃O₄SiO₂）的制备：

在室温下，250mL三颈瓶中加入除氧去离子水80mL，保持搅拌速度800rmpmin^-1，氮气保护下加入FeCl₂·4H₂O（1.72g）和FeCl₃·6H₂O（4.72g），当温度升至80℃时逐滴加入氨水(28%wt)10mL，反应1h，然后加入PEG-2002mL，搅拌10min，磁性分离，去离子水洗至中性，即得Fe₃O₄磁性纳米粒，分散于异丙醇中备用。

取Fe₃O₄磁性纳米粒0.3g，分散于50mL异丙醇中，超声15min。保持搅拌速度200rmpmin^-1，加入去离子水2mL和氨水(28%wt)2mL，以20μLmin^-1速度加入正硅酸乙酯（TEOS）5mL，室温反应12h，去离子水洗至中性，真空干燥，得磁性纳米粒Fe₃O₄SiO₂。

Fe₃O₄SiO₂表面修饰：

取Fe₃O₄SiO₂磁性纳米粒1.0g，分散于100mL甲苯中，加入γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH-570)20mL，在氮气保护下120℃加热回流24h。利用外磁场，将所得的产物依次用乙醇、甲苯洗涤纯化，真空干燥，得功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒。

（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲胺的制备：

（±）N-1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁胺5.0g溶于乙醇15mL中，搅拌下加入甲醛水溶液（甲醛浓度37%wt-40%wt）10mL，反应2小时。减压回收乙醇。反应体系加水50mL，乙酸乙酯（50mL×3）萃取，水洗（50mL×1），饱和NaCl洗（50mL×1）。无水硫酸钠干燥，抽滤，回收乙酸乙酯。将所得液体溶于乙醇，加入硼氢化钠，至不再产生气泡，搅拌1小时。旋干，得淡黄色液体，硅胶柱层析提纯，得黄色油状物3.1g。¹HNMR(300MH_Z，DMSO)：δ7.37-7.22(m，4H)，2.58-2.49(m，1H)，2.44-2.37(m，2H)，2.22-2.14(m，3H），1.86-1.83(m，1H)，1.66-1.57(m，2H)，1.37-1.21(m，1H)，1.00-0.89(m，2H)，0.85-0.77(m，6H).

（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺的制备：

（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲胺3.0g溶于二氯甲烷30mL中，搅拌下加入甲基丙烯酰氯2.0mL，反应2小时。反应体系加水50mL，乙酸乙酯（50mL×3）萃取，水洗（50mL×1），饱和NaCl洗（50mL×1）。无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干，得淡黄色液体，硅胶柱层析提纯，得黄色油状物2.2g。¹HNMR(300MH_Z，DMSO)：δ7.36-7.21(m，4H)，5.92-5.86(d，1H)，5.52-5.47(d，1H)，2.58-2.49(m，1H)，2.44-2.37(m，2H)，2.22-2.14(m，3H），1.95-1.91(m，3H)，1.86-1.83(m，1H)，1.66-1.57(m，2H)，1.37-1.21(m，1H)，1.00-0.89(m，2H)，0.85-0.77(m，6H).

MMIPs的制备(方法1)

取功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-丙烯酰胺，2mmol的功能单体2-乙烯吡啶均匀地分散于100mL甲苯-乙腈（9:1，v/v）中，室温搅拌预聚1h；然后加入4mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）和80mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），通氮气15min除去氧气后密封，升温至50℃加热反应6h；然后再升温至60℃反应24h；最后在85℃下反应6h结束。将所得的MMIPs在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性即可，聚合物真空干燥备用。磁性非印记聚合物（MNIPs）除不加模板分子外，其余制备过程与MMIPs一致。

实施例2：MMIPs的制备(方法2)

同实施例1，区别在于：取功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺，3mmol的功能单体4-乙烯吡啶均匀地分散于100mL甲苯-乙腈（9:1，v/v）中，室温搅拌预聚1h；然后加入6mmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA）和80mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），通氮气15min除去氧气后密封，升温至50℃加热反应6h；然后再升温至60℃反应24h；最后在85℃下反应6h结束。将所得的MMIPs在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性即可，聚合物真空干燥备用。磁性非印记聚合物（MNIPs）除不加模板分子外，其余制备过程与MMIPs一致。

实施例3：选择性吸附试验

精密称定若干份20mgMMIPs和MNIPs分散于10mL2.0mM的西布曲明及其活性代谢物M₁和M₂的甲苯-乙腈（9:1，v/v）溶液，于室温下恒温振荡器中振荡1h，然后磁性分离，取上清液，HPLC-UV测定吸附前后样品溶液的浓度，根据结合前后溶液浓度的变化，计算MMIPs和MNIPs对不同化合物的吸附量（图3），西布曲明MMIPs（方法2）对西布曲明、西布曲明体内代谢物M1、西布曲明体内代谢物M2均有良好的吸附效果，其吸附量远大于MNIPs。说明西布曲明MMIPs具有对西布曲明及其代谢物分子具有特异性识别作用。

Claims

1.西布曲明磁性分子印迹聚合物，其特征在于：

2.权利要求1所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：

a.将功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒、（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺和功能单体按1:（2-1）:3的摩尔比溶解到含有交联剂、引发剂的甲苯-乙腈溶液中，其中甲苯:乙腈的体积比为9:1，室温搅拌预聚；按比例，100mL甲苯-乙腈溶液中含Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-丙烯酰胺，2-3mmol的功能单体，4-6mmol交联剂和80mg引发剂；

b.将预聚液密封后，采用加热搅拌的方式聚合反应生成粉末状聚合物，聚合反应温度为50-85℃，反应时间为12-36h；所述功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒由以下方法制得：按比例，取Fe₃O₄SiO₂磁性纳米粒1.0g，分散于100mL甲苯中，加入γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH-570)20mL，在氮气保护下120℃加热回流24h；利用外磁场，将所得的产物依次用乙醇、甲苯洗涤纯化，真空干燥，得功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒；

c．将所得的粉末状聚合物在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性；

d.提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到西布曲明磁性分子印迹聚合物。

3.根据权利要求2所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述功能单体为4-乙烯吡啶、2-乙烯吡啶中的至少一种。

4.根据权利要求2所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺的制备方法为：按比例，将（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲胺3.0g溶于二氯甲烷30mL中，搅拌下加入甲基丙烯酰氯2.0mL，反应2小时，反应体系加水50mL，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和NaCl洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干，得淡黄色液体，硅胶柱层析提纯，得黄色油状物2.2g。

5.根据权利要求2所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：按比例，取功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-丙烯酰胺，2mmol的功能单体2-乙烯吡啶均匀地分散于100mL甲苯-乙腈溶液中，其中甲苯:乙腈的体积比为9:1，室温搅拌预聚1h；然后加入4mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）和80mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），通氮气15min除去氧气后密封，升温至50℃加热反应6h；然后再升温至60℃反应24h；最后在85℃下反应6h结束；将所得的粉末状聚合物在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性即可，聚合物真空干燥备用。

6.根据权利要求2所述西布曲明磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：按比例，取功能化修饰的Fe₃O₄SiO₂纳米粒40mg，1mmol的（±）N-{1-[1-（4-氯苯基）环丁基]-3-甲基丁基}-N-甲基-N-甲基丙烯酰胺，3mmol的功能单体4-乙烯吡啶均匀地分散于100mL甲苯-乙腈溶液中，其中甲苯:乙腈的体积比为9:1，室温搅拌预聚1h；然后加入6mmol交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TMPTMA）和80mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），通氮气15min除去氧气后密封，升温至50℃加热反应6h；然后再升温至60℃反应24h；最后在85℃下反应6h结束；将所得的粉末状聚合物在外磁场下分离后用1M盐酸溶液反复超声洗脱去除模板分子，然后用甲醇洗至中性即可，聚合物真空干燥备用。