CN103819566A

CN103819566A - 融合蛋白vt-gl-b3及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103819566A
Application number: CN201410072083.5A
Authority: CN
Inventors: 高丽华; 胡显文; 李伊培; 陈惠鹏; 王友亮; 邵勇; 高招刚; 潘芸; 刘羽
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: CN103819566B

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白VT-GL-B3及其编码基因和应用。本发明提供的融合蛋白，是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列1自N末端第21-468位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与血管生成相关的由其衍生的蛋白质。本发明还保护所述融合蛋白在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（Ⅰ）至（Ⅴ）中的至少一种：（Ⅰ）抑制血管内皮细胞增殖和/或迁移；（Ⅱ）抑制血管生成；（Ⅲ）抑制肿瘤生长；（Ⅳ）治疗癌症；（Ⅴ）治疗血管生成相关的疾病。本发明对于治疗癌症以及其他与血管生成相关的疾病具有重大价值。

Description

融合蛋白VT-GL-B3及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白VT-GL-B3及其编码基因和应用。

背景技术

1971年，Folkman提出了肿瘤的生长、转移依赖血管的概念。肿瘤初期生长时并不伴有新血管的生成，但其体积长到1-2mm³后，需要依赖新生血管来维持生存转移和对营养物质的需求。肿瘤血管内部崎岖，易形成高缺氧区，低氧分压又促使血管生成因子的表达，形成新的血管使肿瘤生长存活。在已知的血管生成因子中，VEGF（vascularendothelial growth factor，VEGF）的作用最为强烈，这为临床抗肿瘤药物的开发提供了更广的思路。

VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子（placental growth factor，PIGF）。通常所说的VEGF即指VEGF-A。VEGF-A是一种分子量在34-64KD之间的糖蛋白，在许多细胞中表达，如内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等。VEGF-A基因有八个外显子，经过选择性剪切外显子得到至少六个不同的亚型：VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189、VEGF-A206，其中VEGF-A121、VEGF-A165（即VEGF165）、VEGF-A189是表达量最大的亚型。这些VEGF-A的亚型不仅长度不一，并且与肝素或者神经纤毛蛋白（neuropilins，NRPs）的结合能力也不同。肝素是一种广泛使用的抗凝剂。NRP是VEGF的复合受体。VEGF-A165与肝素和neuropilins的亲和力都很低，但因其有与肝素结合的这一特点，VEGF-A165能附着在细胞质基质和细胞表面。VEGF-A121缺少与肝素和neuropilins结合的区域，可以自由的扩散。VEGF-A189、VEGF-A206与肝素有着高亲和力，所以在细胞外基质积累。VEGF-B和PIGF的亚型也是通过外显子的选择性剪切和与肝素或者neuropilins的结合力不同区分的。在肿瘤血管发生过程中，VEGF-A是最主要的血管生成促进因子，激活静止的内皮细胞，促进细胞增殖、迁移和增加血管通透性。PIGF与VEGF-A合作协调共同完成上述作用。VEGF-B的作用至今尚未明确，缺少VEGF-B的小鼠能够存活但是具有异常的心脏传导。VEGF-B在人类肿瘤细胞中表达并且激活VEHGR1和NRP-1。VEGF-C、VEGF-D负责调控淋巴管的生成。VEGF-E存在于除哺乳动物外的脊椎动物中，能刺激血管内皮细胞的萌发、分裂、趋化性及血管生成，它与VEGFR2有极高亲和力，但不与VEGFR1结合。T.flavoviridis svVEGF，一种从蛇毒中发现的类VEGF分子，也被认为是VEGF家族的新成员。

血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptors，VEGFRs）包括五种：VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）、NRP-1、NRP-2，前三者属于酪氨酸蛋白激酶家族成员。这三种酪氨酸蛋白激酶受体均为跨膜蛋白，它由七个类免疫球蛋白结构域组成的胞外区、一个单独的跨膜片段、一个近膜片段和细胞内的酪氨酸蛋白激酶区域组成。VEGFR通过胞外区与VEGF结合后构象改变形成同源二聚体，激活胞内的酪氨酸激酶。其中VEGFR1与VEGF-A、VEGF-B、PIGF结合，其与VEGF-A有极高的亲和力(Kd=1～10pM)，是VEGF的高亲和力诱捕性受体，与VEGF结合后抑制其与VEGFR2结合，VEGFR1与VEGF-A结合的主要部位是胞外区的第二个类免疫球蛋白结构域(the second immunoglobulin domain of VEGFR1,R1D2)。VEGFR1的酪氨酸激酶活性比VEGFR2低大约10倍。虽缺少能够被VEGF刺激进而发生酪氨酸磷酸化的能力，但VEFGR1在血细胞生成过程中发挥重要作用，并能征募单核细胞、骨髓衍生细胞等能够组成肿瘤脉管系统的细胞。VEGFR2在血管和淋巴管内皮细胞中均有表达，可与VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D结合，是引起内皮细胞分裂、转移的最主要受体。VEGFR2主要通过胞外区的第二、三类免疫球蛋白结构域(the second and thirdimmunoglobulin domains of VEGFR2,R2D2D3)与VEGF-A结合，主要的血管生成信号均为VEGFR2被激活后产生的，因此，尽管其与VEGF-A的亲和力远不如VEGFR1，但VEGF介导的内源性肿瘤血管生成及血管通透性增加都是通过与VEGFR2结合，使其磷酸化，调控下游基因表达实现的。VEGFR3正常生理情况下只在淋巴管内皮细胞表达，与VEGF-C、VEGF-D结合，参与淋巴内皮细胞的增殖，迁移，并调节肿瘤的淋巴转移。

NRP是轴突生长锥指导分子信号素的受体。NRP1、NRP2作为VEGFR的复合受体，常在轴索末端、内皮细胞和一些肿瘤细胞内表达，通过增加VEGFRs的蛋白磷酸化程度增强VEGF途径的信号。

血管生成对于肿瘤的生长和成功转移必不可少，它是一个复杂的、连续的、每一步骤都相对独立的多相过程。肿瘤血管结构畸形，组织淋巴回流受阻，传统药物很难到达肿瘤细胞，且肿瘤细胞易突变产生耐药性；而肿瘤血管内皮细胞因具有遗传上的统一性和稳定性，并能和血液中药物直接接触，较少可能的对药物产生耐药性，被认为是理想的治疗靶点。VEGF在血管生成过程中迅速大量上调，原位杂交技术显示VEGFmRNA在许多人类肿瘤组织中表达，包括肺、乳房、胃肠道、肾、卵巢等。阻断VEGF通路的任一环节，均可有效地抑制肿瘤血管生成，使肿瘤血管退化脱落，产生广谱抗肿瘤作用。2004年，Avastin作为首个抗肿瘤血管生成药物在美国成功上市。该药物是VEGF-A的单克隆抗体，能够与VEGF-A所有亚型结合，在治疗转移性结肠癌方面有出色表现。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合蛋白VT-GL-B3及其编码基因和应用。

本发明提供的融合蛋白，是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第21-468位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与血管生成相关的由其衍生的蛋白质。

编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：

（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第61-1404位核苷酸所示的DNA分子；

（2）编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码血管生成相关蛋白的DNA分子；

（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码血管生成相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为在pIRES2-EGFP载体的多克隆位点（如NheI和NotI酶切位之间）插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到重组质粒pIRES2-EGFP-VT-GL-B3。

所述转基因细胞系具体可为将所述重组质粒pIRES2-EGFP-VT-GL-B3导入CHO-K1细胞得到的重组细胞。

本发明还保护所述融合蛋白在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（Ⅰ）至（Ⅴ）中的至少一种：（Ⅰ）抑制血管内皮细胞增殖和/或迁移；（Ⅱ）抑制血管生成；（Ⅲ）抑制肿瘤生长；（Ⅳ）治疗癌症；（Ⅴ）治疗血管生成相关的疾病。所述血管内皮细胞具体可为HUVEC细胞。所述药物具体是通过结合VEGF-A实现所述功能。所述VEGF-A具体可为VEGF165，如商购的rhVEGF165。

本发明还保护一种药物，其活性成分为所述融合蛋白；所述药物的功能为如下（Ⅰ）至（Ⅴ）中的至少一种：（Ⅰ）抑制血管内皮细胞增殖和/或迁移；（Ⅱ）抑制血管生成；（Ⅲ）抑制肿瘤生长；（Ⅳ）治疗癌症；（Ⅴ）治疗血管生成相关的疾病。所述血管内皮细胞具体可为HUVEC细胞。所述药物具体是通过结合VEGF-A实现所述功能。所述VEGF-A具体可为VEGF165。所述VEGF165具体可如序列表的序列3所示。

在肿瘤治疗中，如果仅阻断VEGF途径，会导致其它血管生成因子的高表达，促进肿瘤血管生成，这种反应称为肿瘤援救反应。本发明提供的融合蛋白，可以同时阻断VEGF途径和PIGF途径，从而有效抑制肿瘤援救反应。本发明提供的融合蛋白可以高亲和力与VEGF-A的所有亚型和PIGF-2结合，药代动力学明显优于Avastin，在体内的半衰期较Avastin延长。本发明对于治疗癌症以及其他与血管生成相关的疾病具有重大价值。

附图说明

图1为重组质粒pIRES2-EGFP-VT-GL-B3的结构示意图。

图2为重组细胞在荧光显微镜下的照片。

图3为亲和层析过程中的图谱。

图4为将VT-GL-B3成熟肽溶液进行还原性SDS-PAGE的图谱。

图5为芯片的键合响应过程。

图6为Avastin与rhVEGF165的结合动力学曲线（彩色）与1:1Binding结合模型处理后的拟合曲线（黑色）。

图7为VT-GL-B3成熟肽与rhVEGF165的结合动力学曲线（彩色）与1:1Binding结合模型处理后的拟合曲线（黑色）。

图8为VT-GL-B3成熟肽抑制HUVEC细胞增殖的结果。

图9为划痕实验的结果。

图10为Transwell小室迁移实验的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，均采用BCA法检测蛋白浓度。

pIRES2-EGFP载体：Invitrogen公司，货号为PT3267-5。CHO-K1细胞：ATCC编号为CCL-61。Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒：Invitrogen。贝伐珠单抗注射液（Avastin）：购自罗氏；Lot No.N3526B01。rhVEGF165（重组人血管内皮生长因子VEGF165）：上海近岸生物科技有限公司,货号为C083C。HUVEC细胞：

CRL-1730^TM。

实施例1、VT-GL-B3融合蛋白的制备

一、重组质粒的构建

在pIRES2-EGFP载体的NheI和NotI酶切位之间插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到重组质粒pIRES2-EGFP-VT-GL-B3。重组质粒pIRES2-EGFP-VT-GL-B3的结构示意图见图1。

将序列表的序列2所示的双链DNA分子命名为VT-GL-B3基因。序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为VT-GL-B3融合蛋白。

序列表的序列1中，自N末端第1至20位氨基酸残基为信号肽、第21-236位氨基酸残基为VEGFR1D2R2D3片段（VEGFR1D2R2D3片段由两个区域组成：人血管内皮细胞生长因子受体1的第二个结构域VEGFR1D2和人血管内皮细胞生长因子受体2的第三个结构域VEGFR2D3）、第237-468位氨基酸残基为Fc片段（全称为人IgG1的Fc片段）。VEGFR1D2R2D3片段和Fc片段组成VT-GL-B3成熟肽。

序列表的序列2中，自5’末端第1-60位核苷酸为信号肽的密码序列、第61-708位核苷酸为VEGFR1D2R2D3片段片段的编码序列、第709-1407位核苷酸为Fc片段的编码序列。

二、VT-GL-B3融合蛋白的制备

1、采用Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒并按试剂盒说明书操作，将重组质粒pIRES2-EGFP-VT-GL-B3导入CHO-K1细胞，得到重组细胞。重组细胞在荧光显微镜下的照片见图2（A为明视场，B为暗视场；40×），暗视场中清晰可见绿色荧光。

2、将步骤1得到的重组细胞接种至含5%（体积比）新生牛血清的DMEM/F12培养基，然后在37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时，然后收集上清液。

3、取步骤2得到的上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液，然后调pH至7.4。

4、将步骤3得到的滤液进行亲和层析纯化。

Mab Select ^TM protein A亲和填料购自GE公司。

平衡缓冲液：含0.5M NaCl的pH7.4、0.5M的Tris-HCl缓冲液；

洗脱液：pH3.0、0.1M的Gly-HCl缓冲液。

先用平衡缓冲液洗涤3个柱体积，然后用洗脱液洗涤目标物，流速均为5mL/min。

A280nm检测紫外吸收峰。

亲和层析过程中的图谱见图3。

采用收集管收集目标峰（收集管中含有pH9.0的饱和精氨酸溶液以中和目的蛋白pH值至中性），然后将收集管中的溶液转移至透析袋中，在pH7.4、0.01M PBS缓冲液中进行透析（以去除精氨酸、甘氨酸以及其他离子），得到VT-GL-B3成熟肽溶液。

将VT-GL-B3成熟肽溶液进行还原性SDS-PAGE，图谱见图4。回收目的条带并进行测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列1自N末端第21至35位氨基酸残基所示。

实施例2、VT-GL-B3成熟肽的生物活性

一、VT-GL-B3成熟肽与rhVEGF165的亲和力

Biacore T200、CM5传感芯片（Lot No.10148134）、Amine Coupling Kit（Lot No.2057704）、Human Antibody Capture Kit（Lot No.10137214）、HBS-EP+缓冲液(10×)（Lot No.BCBJ0266V）均购自GE Healthcare。

Anti-Human IgG(Fc)Antibody为Human Antibody Capture Kit（Lot No.10137214）的组分。HBS-EP⁺缓冲液(10×)用去离子水稀释至10倍体积，即为HBS-EP⁺缓冲溶液。

1、Anti-Human IgG(Fc)Antibody与CM5传感芯片表面结合

（1）将CM5传感器芯片嵌入Biacore T200。

（2）用pH5.0、10mM的醋酸钠缓冲液配制Anti-Human IgG(Fc)Antibody溶液。

（3）按照Immobilization程序设定中样品摆放方法，将Amine Coupling Kit中的溶液放置在Biacore自动进样器的适当位置。

（4）点击Immobilization程序自动进行Fc3、Fc4通道氨基偶联固定。

2、分别进行VT-GL-B3成熟肽及avastin的芯片捕获

以HBS-EP+缓冲溶液作为流动相，在Fc4通道注入6.5nM浓度的VT-GL-B3成熟肽或1.5nM浓度的avastin。

3、分别进行待测品与人VEGF-A165的动力学测试

以结合待测品（Avastin或VT-GL-B3成熟肽）的Fc4通道为检测通道，未结合所述待测品的流通池(Fc3)为参比通道，分别注入含有不同浓度rhVEGF165的HBS-EP+缓冲溶液（待测品为Avastin时，rhVEGF165的浓度分别为5.5nM、1.4nM、0.34nM、0.086nM、0.021nM；待测品为VT-GL-B3成熟肽时，rhVEGF165的浓度分别为5.5nM、1.8nM、0.62nM0.21nM、0.068nM；rhVEGF₁₆₅的浓度以蛋白计，同时设0浓度点；设置流速为30μL·min^-1）；设置Single Cycle Kinetics方法并运行（检测温度：25℃；结合时间：6min；解离时间：100min）。

Biacore T200Control Software采集SPR信号并保存，进而利用Biacore T200Evaluation分析软件进行数据处理。检测通道得到的图谱均减去相应参比通道得到的图谱，进行校正。1：1Binding结合动力学模型用于曲线拟合以最恰当地描述反应动力学，并用于计算k_a，k_d和K_D值。

图5为芯片的键合响应过程，Anti-Human IgG(Fc)Antibody键合芯片信号响应值最终固定在7500RU左右。Avastin与rhVEGF₁₆₅的结合动力学曲线（彩色）与1:1Binding结合模型处理后的拟合曲线（黑色）见图6。VT-GL-B3成熟肽与rhVEGF₁₆₅的结合动力学曲线（彩色）与1:1Binding结合模型处理后的拟合曲线（黑色）见图7。待测品（Avastin或VT-GL-B3成熟肽）与rhVEGF165的动力学常数结果见表1。根据Biacore判定标准一般认为相差五倍以内，可以判定为亲和能力没有差别。VT-GL-B3成熟肽与rhVEGF₁₆₅的亲和力比Avastin与rhVEGF₁₆₅的亲和力高出十倍，有显著性差别。

表1待测品（Avastin或VT-GL-B3成熟肽）与rhVEGF₁₆₅的动力学常数结果

	k_a×E⁶(M^-1s^-1)	k_d×E^-5(s^-1)	K_A×E¹¹(M^-1)	K_D×E^-12(M)
					VT-GL-B3成熟肽	6.783	2.571	2.638	3.791
Avastin	1.227	4.026	0.305	32.82

二、VT-GL-B3成熟肽抑制HUVEC细胞增殖

1、取HUVEC细胞，胰酶消化并计数，然后以1000个细胞/孔的密度接种至96孔细胞培养板，37℃静置培养24h（细胞完全贴壁），吸弃上清液。

2、完成步骤1后，将孔分为14组，每组5个复孔，分别处理如下：

第一组：每孔加入100μL含4000ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第二组：每孔加入100μL含2000ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第三组：每孔加入100μL含1000ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第四组：每孔加入100μL含500ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第五组：每孔加入100μL含250ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第六组：每孔加入100μL含125ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第七组：每孔加入100μL含62.5ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第八组：每孔加入100μL含4000ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第九组：每孔加入100μL含2000ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第十组：每孔加入100μL含1000ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第十一组：每孔加入100μL含500ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第十二组：每孔加入100μL含250ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第十三组：每孔加入100μL含125ng/mL、Avastin20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第十四组：每孔加入100μL含62.5ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

VT-GL-B3成熟肽和Avastin的浓度均以蛋白质的浓度计；

置于37℃、5%CO2温箱中连续培养4天，第5天每孔加入10μL cck-8试剂并37℃避光孵育1h，然后405nm处读值。结果见图8。rhVEGF165可以促进HUVEC细胞增殖，而VT-GL-B3成熟肽和Avastin均可以通过与HUVEC细胞竞争性结合rhVEGF₁₆₅，从而抑制HUVEC细胞增殖，VT-GL-B3成熟肽的作用效果优于Avastin。

三、划痕实验

1、取HUVEC细胞，胰酶消化并计数，然后以5000个细胞/孔的密度接种至96孔细胞培养板，37℃静置培养至90%融合，用白枪头在每个培养孔内笔直的画出划痕，吸弃上清液，用PBS缓冲液洗涤两遍。

2、完成步骤1后，将孔分为7组，每组3个复孔，分别处理如下：

第一组：每孔加入100μL含1000ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第二组：每孔加入100μL含500ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第三组：每孔加入100μL含50ng/mL VT-GL-B3成熟肽、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第四组：每孔加入100μL含1000ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第五组：每孔加入100μL含500ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

第六组：每孔加入100μL含50ng/mL Avastin、20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

对照组：每孔加入100μL含20ng/mL rhVEGF₁₆₅和10%（体积比）小牛血清的RPMI-1640培养基；

VT-GL-B3成熟肽和Avastin的浓度均是以蛋白质的浓度计；

置于37℃、5%CO2温箱中连续培养8h，在显微镜下观察划痕愈合情况。

照片见图9。VT-GL-B3成熟肽可显著抑制rhVEGF₁₆₅诱导的HUVEC细胞迁移。

四、Transwell小室迁移实验

1、HUVEC细胞饥饿培养12h（以去除血清对实验结果的影响），然后胰酶消化，然后用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。

2、24孔细胞培养板当做下室，将孔分成8组，每组3个复孔，分别处理如下：

第一组：每孔加入750μL含1000ng/mL VT-GL-B3成熟肽和20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基；

第二组：每孔加入750μL含500ng/mL VT-GL-B3成熟肽和20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基；

第三组：每孔加入750μL含50ng/mL VT-GL-B3成熟肽和20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基；

第四组：每孔加入750μL含1000ng/mL Avastin和20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基；

第五组：每孔加入750μL含500ng/mL Avastin和20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基；

第六组：每孔加入750μL含50ng/mL Avastin和20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基；

第七组（blank组）：每孔加入750μL无血清RPMI-1640培养基；

第八组（control组）：每孔加入750μL含20ng/mL rhVEGF₁₆₅的无血清RPMI-1640培养基。

3、将Transwell小室放在完成步骤2的24孔板的培养孔上，当做上室，每孔加入200μL无血清HUVEC细胞悬液（4×10⁴cell/200μL/室），置于37℃、5%CO₂温箱中连续培养20h，取上室底部的聚碳酸酯膜，进行如下操作：用甲醇固定10min，用PBS缓冲液洗涤三次，晾干，用结晶紫避光染色15min，用PBS缓冲液洗涤三次，用干净棉签均匀用力的擦掉聚碳酸酯膜上底面（面向上室的面）未迁移的细胞，下底面（面向下室的面）向上，置于显微镜下观察拍照，每个聚碳酸酯膜随机选择三个视野，观察计数后取平均值。

结果见图10（*P﹤0.05）。VT-GL-B3成熟肽可显著抑制rhVEGF₁₆₅诱导的HUVEC细胞迁移。

Claims

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）或（c）：

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：

（2）编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（Ⅰ）至（Ⅴ）中的至少一种：（Ⅰ）抑制血管内皮细胞增殖和/或迁移；（Ⅱ）抑制血管生成；（Ⅲ）抑制肿瘤生长；（Ⅳ）治疗癌症；（Ⅴ）治疗血管生成相关的疾病。

6.一种药物，其活性成分为权利要求1所述蛋白质；；所述药物的功能为如下（Ⅰ）至（Ⅴ）中的至少一种：（Ⅰ）抑制血管内皮细胞增殖和/或迁移；（Ⅱ）抑制血管生成；（Ⅲ）抑制肿瘤生长；（Ⅳ）治疗癌症；（Ⅴ）治疗血管生成相关的疾病。