一种治疗帕金森综合症的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种治疗帕金森综合症的药物组合物及其制备方法。
背景技术
帕金森综合症(Parkinsonism,PD)又称震颤麻痹,是中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病,可分为继发性和症状性帕金森综合征,继发性帕金森综合症常发生于其它一些神经系统疾病(脑炎、脑血管病、肿瘤等)或毒物、药物之后,临床表现是静止性震颤、肌肉僵直、步态和姿势障碍以及运动迟缓。运动迟缓包括起动缓慢,冻结、小步、慌张步态,自发动作减少,写字过小、坐位起立困难、发音困难、构音障碍和吞咽困难等。一般姿势不稳是晚发的症状。在病程的中晚期,帕金森病的非运动症状如抑郁、便秘、睡眠障碍、认知损害等可能严重影响患者的生活质量。
对于帕金森症的治疗药物包括复方左旋多巴制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂、抗胆碱能制剂和金刚烷胺等;部分患者可考虑神经核团毁损术或脑深部电刺激手术。目前的治疗药物主要是改善症状,不能延缓病情的发展,很多研究发现,虽然多巴胺类替代疗法疗效显著,但应用过早,或长期应用,或用量较大,反而可能促进自身的多巴胺能神经细胞的萎缩和产生多巴胺的功能丧失,使病情进行性加重。因此,现在一般不主张早期应用多巴胺类制剂,也不主张大量应用。另外,治疗帕金森病的药物多数存在较多的副作用,长期应用的患者多数出现幻觉、异动症、低血压、胃部不适、严重心衰、心律失常、精神病、运动障碍等不良反应,并且长期应用还可以出现“剂末现象”和“剂量高峰多动症”等特殊问题,同时很多合并症如冠心病、低血压、糖尿病、青光眼、胃病等均因为不良反应限制了西药的应用。还有巴胺类替代疗法对帕金森综合症往往疗效较差,甚至无效,所以,积极寻找其它安全有效的治疗办法,改善患者生存质量,尤其是早期轻型患者,能代替巴胺类制剂的又无不良反应的药物以及重症患者提高巴胺类制剂疗效、增加其疗效持续时间、减轻其不良反应的增效减毒,改善患者生存质量的药物是现代帕金森病药物研究和开发的重点。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有技术的不足,提供一种组成简单,配方新颖的治疗帕金森综合症的药物组合物,该药物组合物具有成本低、疗效好、无毒副作用、不易产生耐受性、服用及携带方便、普遍适用于帕金森综合症患者等特点。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,该制备方法操作简单,可适用于工业化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种治疗帕金森综合症的药物组合物,它是由以下重量份数比的原料组成:熟地黄10~50份,天麻10~50份,刺五加15~35份,木瓜15~35份,全蝎3~15份。
优选地,所述的各原料的重量份数比为:熟地黄20~40份,天麻20~40份,刺五加20~30份,木瓜20~30份,全蝎5~10份。
优选地,熟地黄30份,天麻30份,刺五加25份,木瓜25份,全蝎6份。
优选地,熟地黄35份,天麻35份,刺五加30份,木瓜28份,全蝎8份。
一种制备上述任一药物组合物的方法,它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入8~10倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入6~8倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
本发明所述的药物组合物在制备治疗帕金森综合症药物中的应用。
本发明的药物组合物可以根据制药领域的常规方法制备成任何一种药剂学上所述的剂型;药物组合物可以通过口服、吸入或肠外给药等方式施用于患者。所述的药剂学上的剂型包括:口服给药时使用的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、糖浆、口服液等;在肠外给药时使用的冻干粉针及注射液等。
为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。
本发明所述药物组合物熟地黄、天麻、刺五加、木瓜和全蝎为2010版《中国药典》第一部收载的中药或其炮制品。熟地黄为生地黄炮制之品,甘、微温,归肝、肾经,具有补血滋阴,益精填髓的作用;天麻为兰科多年生草本植物天麻的块茎,甘平,归肝经,具有平肝熄风止痉的作用;刺五加为五加科五加属的落叶灌木,味辛、微苦、性微温。归脾、肾、心经,具有祛风湿,又能补肝肾,强筋骨的作用;木瓜为蔷薇科木瓜,味酸、涩,性温,具有舒筋活络、化湿和脾的作用;全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎的干燥体,辛平、有毒,归肝经,具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛的作用。
本发明的有益效果是:
配方新颖,组成简单,通过药学实验证明对帕金森综合症患者具有较好的临床疗效,配方中各味主药价格均较为便宜,整体成本低廉,制备方法操作简单,而且可适用于工业化生产;本发明配方中全蝎存在毒性,通过本发明的配伍后可以降低其毒副作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1:
称取原料熟地黄10g,天麻10g,刺五加15g,木瓜15g,全蝎3g,加入辅料淀粉100g制粒,硬脂酸镁5g,糊精100g、微晶纤维素100g,均匀制得颗粒,压片,得到片剂。
实施例2:
称取原料熟地黄20g,天麻20g,刺五加20g,木瓜20g,全蝎5g,加入辅料淀粉120g制粒,硬脂酸镁5g,糊精110g、微晶纤维素110g,均匀制得颗粒,压片,得到片剂。
实施例3:
称取原料熟地黄30g,天麻30g,刺五加25g,木瓜25g,全蝎6g,加入辅料淀粉150g制粒,硬脂酸镁5g,糊精150g、微晶纤维素150g,均匀制得颗粒,压片,得到片剂。
实施例4:
称取原料熟地黄35g,天麻35g,刺五加30g,木瓜28g,全蝎8g,加入辅料淀粉200g制粒,硬脂酸镁6g,糊精200g、微晶纤维素200g,均匀制得颗粒,压片,得到片剂。
实施例5:
称取原料熟地黄40g,天麻40g,刺五加30g,木瓜30g,全蝎10g,加入辅料淀粉350g制粒,硬脂酸镁10g,糊精300g、微晶纤维素300g,均匀制得颗粒,压片,得到片剂。
实施例6:
称取原料熟地黄50g,天麻50g,刺五加35g,木瓜35g,全蝎15g,加入辅料淀粉400g制粒,硬脂酸镁10g,糊精350g、微晶纤维素300g,均匀制得颗粒,压片,得到片剂。
实施例7:
称取原料熟地黄10g,天麻10g,刺五加15g,木瓜15g,全蝎3g,加入辅料淀粉100g制粒,硬脂酸镁5g,糊精100g、微晶纤维素100g,均匀制得颗粒,装入胶囊,得到胶囊剂。
实施例8:
称取原料熟地黄20g,天麻20g,刺五加20g,木瓜20g,全蝎5g,加入辅料淀粉120g制粒,硬脂酸镁5g,糊精110g、微晶纤维素110g,均匀制得颗粒,装入胶囊,得到胶囊剂。
实施例9:
称取原料熟地黄30g,天麻30g,刺五加25g,木瓜25g,全蝎6g,加入辅料淀粉150g制粒,硬脂酸镁5g,糊精150g、微晶纤维素150g,均匀制得颗粒,装入胶囊,得到胶囊剂。
实施例10:
称取原料熟地黄35g,天麻35g,刺五加30g,木瓜28g,全蝎8g,加入辅料淀粉200g制粒,硬脂酸镁6g,糊精200g、微晶纤维素200g,均匀制得颗粒,装入胶囊,得到胶囊剂。
实施例11:
称取原料熟地黄40g,天麻40g,刺五加30g,木瓜30g,全蝎10g,加入辅料淀粉350g制粒,硬脂酸镁10g,糊精300g、微晶纤维素300g,均匀制得颗粒,装入胶囊,得到胶囊剂。
实施例12:
称取原料熟地黄50g,天麻50g,刺五加35g,木瓜35g,全蝎15g,加入辅料淀粉400g制粒,硬脂酸镁10g,糊精350g、微晶纤维素300g,均匀制得颗粒,装入胶囊,得到胶囊剂。
实施例13:
称取原料熟地黄10g,天麻10g,刺五加15g,木瓜15g,全蝎3g,按照常规工艺加入辅料淀粉,制备成丸剂。
实施例14:
称取原料熟地黄20g,天麻20g,刺五加20g,木瓜20g,全蝎5g,按照常规工艺加入辅料淀粉,制备成丸剂。
实施例15:
称取原料熟地黄30g,天麻30g,刺五加25g,木瓜25g,全蝎6g,按照常规工艺加入辅料淀粉,制备成注射液。
实施例16:
称取原料熟地黄35g,天麻35g,刺五加30g,木瓜28g,全蝎8g,按照常规工艺加入辅料淀粉,制备成注射液。
实施例17:
称取原料熟地黄40g,天麻40g,刺五加30g,木瓜30g,全蝎10g,按照常规工艺加入辅料淀粉,制备成颗粒剂。
实施例18:
称取原料熟地黄50g,天麻50g,刺五加35g,木瓜35g,全蝎15g按照常规工艺加入辅料淀粉,制备成颗粒剂。
实施例19:
称取原料熟地黄10g,天麻10g,刺五加15g,木瓜15g,全蝎3g.
一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入8倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入6倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
实施例20:
称取原料熟地黄20g,天麻20g,刺五加20g,木瓜20g,全蝎5g。
一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入10倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入8倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
实施例21:
称取原料熟地黄30g,天麻30g,刺五加25g,木瓜25g,全蝎6g。
一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入9倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入7倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
实施例22:
称取原料熟地黄35g,天麻35g,刺五加30g,木瓜28g,全蝎8g。
一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入8~10倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入6~8倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
实施例23:
称取原料熟地黄40g,天麻40g,刺五加30g,木瓜30g,全蝎10g。
一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入8~10倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入6~8倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
实施例24:
称取原料熟地黄50g,天麻50g,刺五加35g,木瓜35g,全蝎15g。
一种治疗帕金森综合症的药物组合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
S1:按组分及重量比称取各原料,备用;
S2:将上述药物均匀混合,加入8~10倍药材量的水浸泡0.5~1小时,随后煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣备用;
S3:将S2步骤中的药渣再加入6~8倍药材量的水煎煮1~1.5小时,过滤得到水煎液,药渣弃去;
S4:将S2步骤中的水煎液与S3步骤中的水煎液合并后浓缩成浸膏,然后将浸膏真空干燥得到干膏,将干膏粉碎,加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂。
下面通过具体的药学实验来验证本发明的有益效果:
下述实验所述的本发明药物组合物,其剂量配比及煎煮方式按照实施例21的记载方式进行。
一、本发明药物对单侧黑质纹状体通路损毁致帕金森病样大鼠模型的影响
1.实验材料
1.1药物与试剂
熟地黄、天麻、刺五加、木瓜、全蝎均购于成都杏林春国医馆,经成都中医药大学药学院生药学教授鉴定符合国家药典规定;6-羟多巴胺(6-OHDA)、高香草酸(HVA)、硫代巴比妥酸(TBA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、辛烷磺酸钠盐(OSA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)、多巴胺(DA)、二羟基苯甲胺(DHBA)、高氯酸、甲醇、酪胺酸羟化酶抗体。美多芭,上海罗氏制药有限公司生产。
1.2实验动物
SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物许可证号:川实动管质SCXK(川)2008-24。
1.3实验仪器
SN-2N型动物脑立体定位仪、紫外可见分光光度计、高效液相色谱仪、碳18反相色谱柱、T21型高速冷冻离心机、Image-proplus图象采集及分析系统。
2实验方法
将6-OHDA溶于0.9%生理盐水中(含0.1%抗坏血酸),大鼠以10%水合氯醛麻醉,脑立体定位仪定位,平颅头位,右侧为健侧,左侧进行四点注射,四点分别为:前囟前(AP)0.5-1.0mm,中线旁开(ML)3.0mm,自颅骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一点,及平前囟,中线旁开(ML)3.0mm,自颅骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一点,每点注射6-OHDA2μl(3μg/μl)。对照组(假手术)注射等量生理盐水。将大鼠称重编号后随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、本发明高、中、低剂量组。假手术组和模型组均给予10ml/kg/天的剂量连续灌胃4周;阳性对照组给予美多芭100mg/kg/天的剂量连续灌胃4周;本发明药物组合物按生药计算1.25g/kg/天、2.5g/kg/天、5g/kg/天的剂量连续灌胃4周。在给药2周和4周时,分别测定阿朴吗啡诱导的各组大鼠的旋转行为,测定时间40min。计算每只大鼠用药后旋转圈数下降率。计算方法:下降率=(用药前旋转圈数-用药后旋转圈数)/用药前旋转圈数×100%。
数据以“均数±标准差”表示,各组数据呈正态分布进行单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐时采用t检验,方差不齐时采用t’检验。
3实验结果
3.1各药物组对本发明药物对模型大鼠旋转行为的影响
对于单侧的黑质纹状体通路损毁模型,同侧的黑质-纹状体通路破坏,纹状体内的神经元失去多巴胺能神经的支配,其多巴胺受体处于一种超敏状态,当给予外源性的多巴胺受体激动剂如阿朴吗啡后,动物损伤侧的反应就强于健侧而无法保持平衡,并向健侧旋转,旋转的频率大致与黑质内的多巴胺能神经元的受损程度一致。本研究给药前、给药后2周及4周,分别对大鼠进行了旋转行为测定,对每只大鼠分别进行给药后自身旋转次数下降率的计算,对模型组与其它各组下降率(%)作t检验。实验结果显示模型组大鼠较对照组旋转圈数明显增高,本发明药物各剂量组都明显减少大鼠旋转次数。(结果见表1)。
表1各药物组对本发明药物对模型大鼠旋转行为的影响
注:与模型组比较,*P<0.05;**P<0.01
3.2各药物组对模型大鼠皮层过氧化脂质的影响
给药4周后,将大鼠断头处死,取脑皮层测定脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量。结果表明模型组大鼠与正常对照组相比,皮层MDA的含量明显升高,而本发明药物组则可显著降低MDA的水平。(结果见表2)
表2各药物组对模型大鼠皮层过氧化脂质的影响
注:与模型组比较,*P<0.05;**P<0.01
二、本发明药物对单侧黑质纹状体通路损毁致帕金森病样大鼠模型的影响
1.实验材料
1.1药物与试剂
熟地黄、天麻、刺五加、木瓜、全蝎均购于成都杏林春国医馆,经成都中医药大学药学院生药学教授鉴定符合国家药典规定;美多芭(规格:0.25g),上海罗氏制药有限公司生产。1.2实验动物
ICR小鼠,雄性,SPF级,体重18±2g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物许可证号:川实动管质SCXK(川)2008-24。
2实验方法
将大鼠称重编号后随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、本发明高、中、低剂量组。小鼠随机分组,正常对照组小鼠在给予0.9%生理盐水单次腹腔注射(0.3ml/只)前,给予蒸馏水连续灌胃(0.3ml/只)3周;模型组小鼠给予槟榔碱(25mg/kg)或氧化震颤素(0.15mg/kg)单次腹腔注射前蒸馏水连续灌胃(0.3ml/只)3周;药物预实验后,我们对本发明药物组颗粒用药组小鼠造模前连续灌胃3周,本发明药物组合物剂量分别为1.25g/kg/天、2.5g/kg/天、5g/kg/天;美多芭组(阳性对照药组)小鼠在造模前1天,美多芭50mg/kg/天的剂量灌胃。
记录每只小鼠自给予槟榔碱后至产生肉眼明显可见的肌肉震颤所需时间为震颤潜伏期,震颤产生后至消失所需时间为震颤持续时间。记录每只小鼠自给予氧化震颤素后至产生肉眼明显可见的肌肉震颤所需时间为震颤潜伏期,震颤产生后至消失所需时间为震颤持续时间。
数据以“均数±标准差”表示,各组数据呈正态分布进行单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐时采用t检验,方差不齐时采用t’检验。
3实验结果
3.1各药物组对槟榔碱致小鼠震颤行为的影响
模型组小鼠在给予槟榔碱腹腔注射后,出现明显的震颤、流涎、躁动不安等行为,其震颤持续的时间明显高于对照组。本发明药物给药组小鼠在腹腔注射槟榔碱后,震颤、流涎、躁动不安等症状较模型组减轻,震颤持续时间较模型组显著缩短。(结果见表3)。
表3各药物组对槟榔碱致小鼠震颤行为的影响
注:与模型组比较,*P<0.05;**P<0.01
3.2各药物组对氧化震颤素致小鼠震颤行为的影响
模型组小鼠在给予氧化震颤素腹腔注射后,出现明显的震颤行为,其震颤持续的时间明显高于对照组。本发明药物给药组小鼠在腹腔注射氧化震颤素后,震颤、流涎、躁动不安等症状较模型组减轻,震颤持续时间较模型组显著缩短。(结果见表4)
表4各药物组对氧化震颤素致小鼠震颤行为的影响
注:与模型组比较,*P<0.05;**P<0.01
三、本发明药物对帕金森病模型小鼠黒质—纹状体多巴胺含量的影响
1.实验材料
1.1药物与试剂
熟地黄、天麻、刺五加、木瓜、全蝎均购于成都杏林春国医馆,经成都中医药大学药学院生药学教授鉴定符合国家药典规定。美多芭,上海罗氏制药有限公司生产。
1.2实验动物
ICR小鼠,雄性,SPF级,体重18±2g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物许可证号:川实动管质SCXK(川)2008-24。
2实验方法
模型采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射法(40mg·kg-1·d-1,1次/d,连续7天)建立帕金森病小鼠模型。注射后4h后检测小鼠的自主活动次数和转棒时间,选自主活动次数和转棒时间均下降小鼠为造模成功小鼠。将大鼠称重编号后随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、本发明高、中、低剂量组。正常对照组和模型组小鼠在给予0.9%生理盐水灌胃(0.3ml/只),连续灌胃7天。本发明药物组合物剂量分别为1.25g/kg/天、2.5g/kg/天、5g/kg/天,美多芭组(阳性对照药组)小鼠在造模前1天,美多芭50mg/kg/天的剂量灌胃,连续灌胃7天。给药结束后,快速断头取脑,冰浴下分离黒质-纹状体,立即-80℃冰箱内保存待测。高效液相色谱法检测多巴胺(DA)及其代谢产物高香草酸(HVA)、二羟苯乙酸(DOPAC)的含量。
数据以“均数±标准差”表示,各组数据呈正态分布进行单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐时采用t检验,方差不齐时采用t’检验。
3实验结果
模型组小鼠DA、HVA、DOPAC含量明显低于正常组(P<0.05),通过本发明药物组合物治疗后能不同程度升高其含量。(结果见表5)。
表5各药物组对帕金森病模型小鼠黒质—纹状体多巴胺含量的影响
注:与模型组比较,*P<0.05;**P<0.01。
四、本发明药物对帕金森病模型小鼠酪氨酸羟化酶(TH)神经元数量的影响
1.实验材料
1.1药物与试剂
熟地黄、天麻、刺五加、木瓜、全蝎均购于成都杏林春国医馆,经成都中医药大学药学院生药学教授鉴定符合国家药典规定。美多芭,上海罗氏制药有限公司生产。
1.2实验动物
ICR小鼠,雄性,SPF级,体重18±2g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物许可证号:川实动管质SCXK(川)2008-24。
2实验方法
模型采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射法(40mg·kg-1·d-1,1次/d,连续7天)建立帕金森病小鼠模型。注射后4h后检测小鼠的自主活动次数和转棒时间,选自主活动次数和转棒时间均下降小鼠为造模成功小鼠。将大鼠称重编号后随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、本发明高、中、低剂量组。正常对照组和模型组小鼠在给予0.9%生理盐水灌胃(0.3ml/只),连续灌胃7天。本发明药物组合物剂量分别为1.25g/kg/天、2.5g/kg/天、5g/kg/天,美多芭组(阳性对照药组)小鼠在造模前1天,美多芭50mg/kg/天的剂量灌胃,连续灌胃7天。给药结束后,并按大鼠编号逐一加以标记,用多聚甲醛水溶液灌流固定脑组织,取出脑黑质,用含蔗糖的磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡,常规石蜡包埋,连续冠状切片(片厚5um),按过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)两步法进行免疫组化染色。脱脂、水化后,经过热修复,滴加兔抗鼠TH单克隆抗体(一抗,1:1200),4℃过夜;加羊抗兔IgG(二抗),37℃孵育15min(各步骤间均以PBS冲洗);3,3’-二氨基联苯胺(DAB)显色5min。镜检,脱水,透明,封固。每只大鼠随机选取3张切片镜下(×200)观察,用图像分析系统进行TH免疫染色阳性细胞计数。
数据以“均数±标准差”表示,各组数据呈正态分布进行单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐时采用t检验,方差不齐时采用t’检验。
3实验结果
模型组小鼠的TH阳性细胞数较正常对照组显著减少;经过本发明药物组合物治疗后TH阳性细胞数显著增加。(结果见表6)
表6各药物组用药后对TH阳性神经元数的影响
注:与模型组比较,*P<0.05;**P<0.01
五、本发明药物的急性毒性试验
选取SPF级40只昆明小鼠,体重18-22g,雌雄各半,编号后随机分为空白对照和本发明药物组,每组20只。空白对照组常规饲养,本发明药物组自由饮水,禁食12小时后灌服水煎液,日剂量按20g/kg/d灌胃给药。连续给药3天后选取10只检查血常规、处死小鼠后观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺的变化情况,连续给药7天后将剩余的小鼠做相同的血常规,处死小鼠后观察相同的指标变化情况。实验结果表明,给药3天和7天后小鼠血常规、心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺均无异常病理变化。
综上述实验表明,本发明药物组合物对帕金森综合症具有较好的治疗作用,未见明显的毒副反应。