CN103797112A - 用于异戊二烯生产的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明内容描述了由木质纤维素植物生物量使用腐生菌的基因工程菌株来生产异戊二烯的组合物和方法。

Description

用于异戊二烯生产的组合物和方法
相关申请
本申请要求享有2011年7月13日提交的美国临时申请第61/507,532号的优先权，该申请的全部内容通过引证在此全部并入本文。
提交的申请
本发明内容涉及由使用腐生菌的基因工程菌株的木质纤维素植物生物量来生产异戊二烯的组合物和方法。
背景技术
在橡胶和某些塑料的生产中，异戊二烯是一种重要的化学前体。根据一些估计，在2008年，生产了大约800,000吨的异戊二烯。在化学工业中所使用的几乎所有的异戊二烯都是由石油衍生得到的，但是，在自然界中，这些异戊二烯是由许多植物产生的。据估计，植物每年向大气层中散发大约1000亿千克的异戊二烯。尽管这样，很少有“绿色”来替代石油化工生产的异戊二烯。最有前景的替代技术，使用许多基因修饰的微生物来将有机物转化为异戊二烯。目前，这些生物体的大多数可以使用单糖作为底物用于异戊二烯的生物合成。这样的糖在自然界的数量是非常有限的。另外，同样的单糖还可用来作为动物饲料或者人类食品。与此同时，根据能源部门(DOE)了解到，木质纤维素生物量是地球上最大的可持续碳资源。每年，美国可将相同来源的十亿吨纤维素生物量转换为生物燃料。现在，需要一种通过木质纤维素生物量来生产异戊二烯的方法。
发明概述
在一些实施方案中，本申请提供了培养的细胞，所述细胞通过使用单糖和二糖或者复杂的碳水化合物，产生了异戊二烯，其中复杂的碳水化合物包括，但不限于，纤维素、淀粉、半纤维素和甲壳素。在一些实施方案中，所述细胞具有编码连接到一种启动子上的异戊二烯合成酶的异源核酸。
在一些实施方案中，上述细胞在一种生长培养基中进行培养，所述生长培养基包括来自海水的矿物盐、类似氯化铵的无机氮源、肽、蛋白质、来自酵母提取物和蛋白胨的维生素和氨基酸、碳源(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉或者纤维素)、以及来自玉米芯的半纤维素。
在一些实施方案中，所述细胞包含一种编码异戊二烯合成酶的异源核酸，并且所述异戊二烯合成酶可操作的连接到tac启动子上。在生长培养基上，在异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(缩写为IPTG)存在下，这些细胞开始产生异戊二烯。
在一些实施方案中，所述细胞包含一种编码异戊二烯合成酶的异源核酸，所述异戊二烯合成酶可操作的连接到ce19A启动子上。在生长培养基上，在仅有纤维素、半纤维素或者果胶存在下，这些细胞产生异戊二烯。
在一些实施方案中，编码异戊二烯合成酶的异源核酸设计为与S.degradans的密码子使用相匹配，并且合成性地构建。
附图说明
附图1是MEP/DOXP途径示意图。下列的缩写应用在附图1中：Pur-丙酮酸；G3P-甘油-3-磷酸(glyceraldehyde3-phosphate)；DXS-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase)；DXP-脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate)；DXR-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductase)；MEP-2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(2-C-methylerythritol4-phosphate)；CMS-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合成酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase)；CDP-ME-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase)；CMK-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase)；CDP-MEP-2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate)；MCS-2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合成酶(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase)；MEcPP-2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclopyrophosphate)；HD S-(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸合成酶((E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate synthase)；HMB-PP-(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸((E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate)；HDR-(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸还原酶((E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase)；IPP-异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate)；DMAPP-二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate)。
附图2显示了优化的用于在S.degradans中的表达的颤杨异戊二烯合成酶基因的管核苷酸序列(SEQ ID NO：1).
附图3显示了优化的用于在S.degradans中的表达的野葛异戊二烯合成酶基因的寡核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
附图4显示的是优化的用于在S.degradans中的表达的的花生异戊二烯合成酶基因的寡核苷酸序列(SEQ IS NO：3)。
附图5显示的是质粒Pmmb503EH的示意图。
附图6显示的是质粒pZym-IPTG的示意图。
附图7是用于显示在发酵罐顶部空间内的异戊二烯浓度随着时间变化的线形图。
附图8显示了在纤维素诱导性构建体中应用的ce19A启动子区域的序列(SEQ ID NO：4)。
附图9显示了用于扩增ce19A启动子区域的引物的序列(SEQID NOs：5(PromD)and6(PromR))。Mlul和EcoRI限制性内切酶位点显示在下壳体。
附图10显示了质粒pZym-Cel的示意图。
发明内容
本发明中描述的组合物和方法，有效地利用了腐生菌Sharophagus degradans(S.degradans)2-40本身的能力从而使在木质纤维素生物量中发现的几乎所有的复杂多糖产生代谢变化。通过改变在生物体中的类异戊二烯生物合成途径，在下述公开的内容中构建了一种利用植物衍生的生物量作为主要碳源的S.degradans异戊二烯生产菌株。
活的生物体利用了两种主要的类异戊二烯生物合成途径：a)甲羟戊酸途径或者HMG-CoA还原酶途径，以及b)非甲羟戊酸途径或者2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸/脱氧木酮糖-5-磷酸途径(2-C-methyl-D-erythritol4-phosphate/1-deoxy-D-xylulose5-phosphate pathway，MEP/DOXP途径)(附图1)。通常情况下，甲羟戊酸途径存在于所有的高等真核生物中，以及很多的细菌中，而植物和一些原生动物则利用非甲羟戊酸途径。
Saccharophagus degradans的基因组已经通过测序并进行注释。基因组的注释清楚地显示了这种微生物唯一地利用了针对萜类生物合成的非甲羟戊酸途径。正如前面提到的，植物利用了相同的途径来合成异戊二烯。在S.degradans中用于这种烃类合成的位移缺少的关键因素是异戊二烯合成酶(IspS)。所述酶将使二甲基二磷酸转化为异戊二烯和二磷酸。多种高等植物(tracheophytes)的细胞含有异戊二烯合成酶。用于颤杨、葛根和花生异戊二烯合成酶的氨基酸序列是通过基因库获得。根据这些序列，来设计针对所有上述三种异戊二烯合成酶的寡核苷酸序列。所述的寡核苷酸序列被设计用来与10个在S.degradans中最高度表达的基因的密码子使用表相匹配。(附图2-4)编码上述异戊二烯合成酶的寡核苷酸序列的合成，使用了在IspS-编码序列的起始密码子上游的核糖体结合位点之后的EcoR1内切酶位点，并且使用了基因终止密码子之后的BamH1内切酶位点。合成异戊二烯合成酶的基因缺少存在于野生型版本中的基因中的信号肽编码区域。
在一些实施方案中，编码异戊二烯合成酶的任何异源核酸均可以引入到任意腐生菌中，包括S.degradans。此外，编码异戊二烯合成酶的异源核酸的任何变体可以引入到任何腐生菌中，包括S.degradans。异戊二烯合成酶氨基酸序列包括花生(落花生)异戊二烯合成酶(GenBank登录号：EZ721087.1)；颤杨(白杨)异戊二烯合成酶(GenBank登录号：721087.1)；葛根(葛藤)(野葛)异戊二烯合成酶(Uniprot登录号：UPI0000389580)。
这些氨基酸序列的任何变体可引入到腐生菌中，包括S.degradans。这些变体可具有与任何野生型异戊二烯合成酶在70-99％之间的序列同一性，只要它们具有合成异戊二烯的能力。
编码异戊二烯合成酶的异源核酸序列可包括任意的启动子，所述启动子允许异戊二烯合成酶的表达。其包括来自S.degradans基因的启动子。这些基因包括在美国申请号为2008-0293115的申请中描述的任意一个，其中上述美国申请的全部内容通过引证在此全部并入本文。
还可以使用来自其他生物体的启动子。这些启动子包括tac启动子和LacUV5启动子。所述LacUV5启动子能够在一种三重构型中应用。
编码异戊二烯合成酶的DNA序列可通过本领域众所周知的方法被克隆至任何合适的载体中，用于在完整的腐生菌或者在无细胞翻译系统中表达。
表达和克隆载体将可能包含一种选择性标记、一种编码蛋白质的基因，其中所述蛋白质对通过用所述载体转化的宿主细胞的生存或者生长是必要的。这种基因的存在可确保只有那些表达所述插入物的宿主细胞的生长。典型的选择基因编码蛋白质1)赋予针对抗生素或其他毒性物质的抗性，其他毒性物质例如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤等；2)补充营养缺陷型的缺陷；或者3)提供不能从复合型培养基获得的必不可少的营养物质，例如编码用于芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。所述标记可以是一种可有道德或者不可诱导的基因，并且通常将允许正向选择。所述标记的非限制性实施例，包括氨苄青霉素抗性标记(即，β-内酰胺酶)，四环素抗性标记，新霉素/卡那霉素抗性标记(即，新霉素磷酸转移酶)，二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，等等。恰当的选择性标记的选择将基于腐生菌，并且针对不同的腐生菌的适当的标记是本领域技术人员所能够理解的。
所述载体可包含一个或多个用于克隆或者表达的复制和遗传系统，一个或多个用于在腐生菌中选择的标记，例如抗生素抗药性，以及一个或多个表达表达盒。插入的编码序列可以通过常规方法进行合成，从天然来源中分离，或者制备为杂交种。连接至转录调控元件(例如启动子、增强子，和/或绝缘子)以及连接至其他氨基酸编码序列的编码序列可通过使用已建立的方法来实现。
用于腐生菌的表达载体通常包括一种复制起点(其中描述了染色体外扩增，如在克隆中的扩增，所述起点将是细菌起点)，位于来自异戊二烯编码序列上游的启动子，连同核糖体结合位点(针对原核表达，仅需要所述核糖体结合序列或者Shine-Dalgarno序列)，RNA剪切位点(如果所述异戊二烯合成酶DNA包含具有一个或多个内含子的基因组DNA)，聚腺苷酸化位点，以及转录终止序列。正如所指出的，本领域技术人员将会理解这些序列中的某些不需要在一些腐生菌中进行表达。一种用来与微生物使用的表达载体仅需要包含一种目标腐生菌所确认的复制起点，一种将在宿主中起作用的启动子，以及一种表现选择基因，例如编码蛋白质的基因，所述蛋白质赋予抗生素的耐药性或者提供一种营养缺陷性的需求。
腐生菌可被转化、转染、或者感染，如适当的通过任何合适的方法，包括电穿孔，氯化钙-、氯化锂-、醋酸锂/聚乙二醇锂-、磷酸钙-、DEAE-葡聚糖-、脂质体-介导的DNA导入，脂质体法，注射，显微注射，基因枪法，噬菌体感染，病毒感染，或者其它确定的方法。所述载体可整合到腐生菌基因组中或者维持与宿主细胞基因组分离。
此外，所述含有目的核酸的载体可在体外进行转录，并且通过众所周知的方法将得到的RNA导入到腐生菌中，例如，通过注射法。其中具有上文所述的导入的核酸的细胞还意味着包括这种细胞的后代。转染方法包括核转染，电穿孔，声孔效应，热冲击，磁转染，以及专用转染试剂(例如脂质体、Dojindo、GenePORTER、Hilymax、Fugene、jetPEI、Effectene或者DreamFect)。
携带有表达载体(即，转化或克隆)的腐生菌通过使用基于载体构建模式的标记进行选择。所述标记可以在相同或不同的DNA分子上，优选地是相同的DNA分子。在原核宿主中，所述转化可进行选择，例如通过抗氨苄青霉素、四环素、或其他抗生素的抗性。基于温度敏感性的特定产品的生产还可以作为适合的标记。
定义
在本文中所使用的，针对细胞的术语“转化”，“稳定转化”或“转基因”使的所述细胞具有一种非天然的(异源的)核酸序列，将该核酸序列导入到上述细胞的基因组中，或者作为一种附加体质粒，通过多代进行维持。
如本文所使用的，术语“表达”涉及利用基于一种基因的核酸序列产生的多肽的过程。所述过程同时包括转录和翻译。
在上下文中的将核酸序列插入到细胞中，所述“导入”指的是“转染”，或者“转化”，或者“转导”，并且包括关于核酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中所述真核序列可被掺入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体，或者线粒体的DNA)，转变成能独立复制的复制子，或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。
“一”，“一个”，以及“所述”包括复数，除非文中另有明确规定。
所述数字的范围包含定义所述范围的数字。
术语“变体”指的是蛋白质或者多肽，其中，与蛋白质或者肽的氨基酸序列相比，存在一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入，并且包括蛋白质或肽天然存在的等位基因变体或者可变的剪切变体。术语“变体”包括一个或多个氨基酸的替换，用相似的或者同源的氨基酸或者不同的氨基酸在肽序列中的替换。在多个方面中，其中氨基酸可被认为是相似的或者同源的。(Gunnar von Heijne，Sequence Analysis in Molecular Biology，p.123-39(Academic Press，New York，N.Y.1987.)优选的变体包括在一个或多个氨基酸位置上的丙氨酸取代。其他哟酸的取代包括保守性取代，所述保守性取代对蛋白质的整体静电荷、极性、或者疏水性具有很少的影响或没有影响。
所述保守性取代列入下表中。根据一些实施方案，SP1NT1和TMPRSS4多糖具有与优选的实施方案中的氨基酸序列至少80％，85％，88％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
保守性氨基酸取代
Figure BDA0000476362430000101
下表中列出氨基酸取代的其他方案：
原残基 取代
Ala Gly；Ser
Arg Lys
Asn Gln；His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Ala；Pro
His Asn；Gln
Ile Leu；Val
Leu Ile；Val
Lys Arg；Gln；Glu
Met Leu；Tyr；Ile
Phe Met；Leu；Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp；Phe
Val Ile；Leu
其他的变体能够由更少的保守性氨基酸取代构成，例如选择的残基在维持下述方面的作用上较为显著的不同：(a)在取代区域的多肽主链的结构，例如，作为面层或螺旋构象，(b)在靶位点上分子的电荷或者疏水性，或者(c)大量的侧链。T通常可预测所述的取代具有功能上的较为显著的作用是：(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一种氨基酸取代，或缺失或插入；(b)一种亲水性残基，例如，丝氨酰或苏氨酰，用(或通过)疏水性残基，例如，亮氨酰，异亮，苯丙，缬氨酰或丙氨酰进行取代；(c)半胱氨酸残基用(或通过)任何其它的残基进行取代；(d)具有正电荷侧链的残基，例如，赖氨酰，精氨酰或组氨酰，用(或通过)具有正电荷侧链的残基进行取代，例如，谷氨酰或天冬氨酰；或者(e)具有大量侧链的残基，例如苯丙氨酸，用(或通过)不具有这样的侧链的残基进行取代，例如甘氨酸。其他的变体包括那些设计为产生一种新的糖基化和/或磷酸化位点，或者那些设计为缺失了现有的糖基化和/或磷酸化位点。在糖基化位点，蛋白酶切割位点和/或半胱氨酸残基上，所述变体包括至少一个氨基酸取代。在连接体肽上的蛋白质或肽氨基酸序列之前或之后，所述变体还包括具有其他氨基酸残基的蛋白质和肽。术语“变体”还包括具有本发明的蛋白质/态的氨基酸序列的多肽，其中至少一个和多达25(例如，5、10、15、20)，或更多(例如，30、40、50、100)的其他氨基酸侧翼，不论是氨基酸序列的3’或者5’末端。
本发明在这里所提供的标题不是对本发明的各个方面或者本发明的实施方案的限制，其可通过参考涉及说明书的整体内容。
下述的实施例旨在对本发明的方法和组合物进行说明，而不是限制。对各种条件和参数的其他合适的修改和调整在治疗中通常会遇到，并且这些修改和调整对本领域技术人员而言是显而易见的，在本发明所述实施方案的实质和范围内。
实施例
下述实施例进一步支持，但非专指，本发明优选的实施方案。
实施例1：IPTG-诱导菌株(Zym-IPTG)
所得到合成的寡核苷酸序列分别用EcoRl和BamH1内切核酸酶进行酶切，并且克隆到pMMB503EH质粒的EcoR1和BamH1位点上(附图5)。将所得到的包含异戊二烯合成酶基因(附图6)的质粒电穿孔至S.degradans菌株2-40中。含有所述质粒细胞的选择是在琼脂上进行，所述琼脂上添加有50μg/mL的链霉素。产生的构建lspS编码序列处于tac启动子的转录调控下。在30℃下，表达了异戊二烯合成酶的S.degradans菌株在250mL的摇瓶中进行培养。在所描述的菌株中，通过将0.4mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至在指数期中的生长培养基中，对异戊二烯合成酶的表达进行诱导。在瓶中的对异戊二烯的检测和量化是通过使用RAE-106挥发性有机化合物检测器进行的。在摇瓶的上部空间内的异戊二烯也表现出“炼油厂”的味道。
为了更准确的评估上所描述的菌株的异戊二烯生产能力，使用了10L Bioflo发酵罐。在30℃下，进行细菌细胞的培养。2x2-40的培养基使用下述组成成分：
Instant Ocean的海盐-230g
酵母提取物-40g
酪蛋白蛋白胨-50g
氯化铵-10g
葡萄糖-100g
水-至10L
在发酵罐顶部空间的异戊二烯浓度用RAE-106检测器进行持续检测(附图7)。作为葡萄糖的替换物，1％(w/v)预先处理的玉米芯被用于作为主要的用于异戊二烯生产的碳源。
实施例2：纤维素诱导菌株(Zym-Cel)
I为了减少使用S.degradans基菌株的异戊二烯生产的成本，创建了一种新型纤维素诱导表达系统。所述系统中的关键要素是在编码内切-1，4-的ce19A基因启动子-S.degradans中的葡聚糖酶。使用qRT-PCR和深度测序技术，ce19A基因被确定为在S.degradans中的其他糖酶编码基因中最高的转录基因。
在任何纤维素和/或半纤维素——在生长培养基中包含的材料存在时，所述基因的转录是高度上调的。为了创建针对S.degradans的纤维素诱导的蛋白质表达系统，从ce19A上游的500-bp长度的碱基序列(附图8)进行PCR-扩增。得到的PCR片段(附图9)包括ce19A启动子，操纵基因区，以及核糖体结合位点。PCR引物包括MluI和EcoRI限制性内切酶位点。得到的PCR片段经MluI和EcoRI限制性内切核酸酶进行酶切，并且克隆至pMMB503EH质粒的MluI和EcoRI位点(附图5)。然后，将异戊二烯合成酶基因克隆到所得质粒的EcoRI和BamHI位点上(附图10)。

Claims (21)

1.一种腐生菌，所述腐生菌包括异戊二烯合成酶。
2.根据权利要求1所述的腐生菌，其中所述腐生菌是Saccharophagus degradans2-40。
3.根据权利要求1所述的腐生菌，其中所述异戊二烯合成酶选自由颤杨异戊二烯合成酶，野葛异戊二烯合成酶和花生异戊二烯合成酶所组成的组中。
4.根据权利要求1所述的腐生菌，其中所述腐生菌包含编码异戊二烯合成酶的异源核酸。
5.根据权利要求4所述的腐生菌，其中所述异源核酸可操作的连接到启动子上，所述启动子选自tac启动子和ce19A启动子。
6.根据权利要求4所述的腐生菌，其中所述异源核酸与
Saccharophagus degradans2-40密码子使用相匹配。
7.一种生产异戊二烯的方法，包括：
(a)提供含有异戊二烯合成酶的腐生菌；并且
(b)在含有碳源的培养基中培养所述腐生菌，从而生产异戊二烯。
8.根据权利要求7的方法，其中所述腐生菌是Saccharophagusdegradans2-40。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生长培养基进一步包括来自海水的矿物盐。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述生长培养基进一步包括无机氮源。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述碳源选自由葡萄糖，蔗糖，乳糖，淀粉，纤维素，半纤维素和玉米芯所组成的组中。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述异戊二烯合成酶选自由颤杨异戊二烯合成酶，野葛异戊二烯合成酶和花生异戊二烯合成酶所组成的组中。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述腐生菌包括编码异戊二烯合成酶的异源核酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所所述异源核酸可操作的连接到启动子上，该启动子选自tac启动子和ce19A启动子。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述异源核酸与Saccharophagus degradans2-40密码子使用相匹配。
16.一种生产细菌的方法，所述细菌在碳源存在下产生异戊二烯，包括：
(a)提供腐生菌；并且
(b)将编码异戊二烯合成酶的异源核酸诱导至所述腐生菌，
从而产生一种细菌，所述细菌可在碳源存在下产生异戊二烯。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述腐生菌是Saccharophagus degradans2-40。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述碳源选自由葡萄糖，蔗糖，乳糖，淀粉，纤维素，半纤维素和玉米芯所组成的组中。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述异戊二烯合成酶选自由颤杨异戊二烯合成酶，野葛异戊二烯合成酶和花生异戊二烯合成酶所组成的组中。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述异源核酸可操作的连接到启动子上，该启动子选自tac启动子和ce19A启动子。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述异源核酸与Saccharophagus degradans2-40密码子使用相匹配。
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