CN103789375A - 一种含纤维素原料的酶解方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含纤维素原料的酶解方法，该方法包括在水的存在下，将含纤维素原料与酶混合、酶解，得到酶解产物，其特征在于，所述酶解分为连续的多个酶解阶段进行，所述多阶段包括主酶解阶段和主酶解阶段以后的酶解阶段，在主酶解阶段中，向酶解罐中连续加入含纤维素原料以及酶，所述含纤维素原料的加入量以及酶的加入量使得经过该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为50-100g/L，并使经过该主酶解阶段得到的酶解产物依次连续流入主酶解阶段以后的酶解阶段的酶解罐中进行酶解，酶解终点的酶解产物中单糖的含量为大于或等于105g/L。本发明的方法有效地提高了原料的糖转化率和酶解效率，并大大缩短酶解周期。

Description

一种含纤维素原料的酶解方法

技术领域

本发明是涉及一种含纤维素原料的酶解方法。

背景技术

现有技术的由含纤维素原料，如秸秆制备乙醇的方法主要包括三个步骤：1、含纤维素原料的预处理，2、纤维素的酶解，3、糖的发酵制乙醇。

经过预处理后的含纤维素原料中的纤维素裸露出来，在与纤维素酶混合后被纤维素酶水解的反应通常称为酶解反应，又可以称为糖化反应，酶解的主要产物是单糖。纤维素在纤维素酶的作用下能够转化成葡萄糖，半纤维素在半纤维素酶的作用下能够转化成木糖等单糖，葡萄糖和木糖都可以用于发酵生产乙醇，比如酿酒酵母可以发酵葡萄糖制备乙醇，树干毕赤酵母可以发酵木糖制备乙醇。纤维素的非结晶结构是很容易被打破的，它可以完全降解成葡萄糖，然后由葡萄糖发酵成乙醇。

在传统的采用含纤维素原料的酶解方法中，酶解步骤通常采用间歇式操作，即将含纤维素原料和酶全部加入到一个酶解罐中并混合均匀，在适当的酶解条件下维持至酶解终点，得到酶解产物。所述传统的间歇式酶解方法的能耗较高，酶的作用效率低，酶解周期长，且设备利用率低。

发明内容

本发明的目的是克服现有的含纤维素原料的酶解方法单糖产率较低，酶的作用效率低，酶解周期长的缺陷，提供一种具有较高单糖产率，酶的作用效率较高，酶解周期较短的含纤维素原料的酶解方法。

本发明的发明人发现，现有技术的采用含纤维素原料的酶解方法中，含纤维素原料，如秸秆原料通常是以液浆的形式存在，在将浆液状的全部秸秆原料直接与酶混合时，会使酶浓度降低，使酶活力下降。再者，将经过预处理的秸秆与酶混合酶解的方法通常为将破碎的秸秆颗粒一次全部加入到酶与水的混合液中与酶液混合，进行酶解糖化反应，或者，先将所用反应物料——经预处理的秸秆颗粒于反应罐中与水混合，然后在酶解温度下，将酶直接加入到反应罐中反应。尽管上述混合是在搅拌条件下进行的，但是秸秆颗粒仍然不容易与酶混合均匀。因为，经过预处理后的秸秆粒度变小，颗粒以及碎屑状的秸秆颗粒很容易互相粘连和团聚，因此一次将全部秸秆完全与酶混合，仅有部分秸秆能与酶充分接触，由于秸秆之间的粘连和团聚也会有部分秸秆不能充分与酶接触，即使在搅拌下，也不能完全将秸秆打散。因此，酶解后纤维素转化为糖的转化率低。此外，由于一次将全部秸秆完全与酶混合，秸秆不能充分与酶接触，因此，酶解的周期较长。

为了实现上述目的，本发明提供了一种含纤维素原料的酶解方法，该方法包括在水的存在下，将含纤维素原料与酶混合、酶解，得到酶解产物，其中，所述酶解分为连续的多个酶解阶段进行，所述多阶段包括主酶解阶段和主酶解阶段以后的酶解阶段，在主酶解阶段中，向酶解罐中连续加入含纤维素原料以及酶，所述含纤维素原料的加入量以及酶的加入量使得经过该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为50-100g/L，并使经过该主酶解阶段得到的酶解产物依次连续流入主酶解阶段以后的酶解阶段的酶解罐中进行酶解，酶解终点的酶解产物中单糖的含量为大于或等于105g/L。

本发明的方法通过将含纤维素原料与酶连续进行混合，使连续加入的含纤维素原料都能与酶混合均匀并充分接触，并且在反应过程中，酶的浓度一直保持在较高的水平，因此，含纤维素原料能与酶充分反应，从而有效地提高了原料的糖转化率和酶解效率，并大大缩短了生产周期。例如，在其它的蒸汽爆破条件都相同的情况下，实施例1的单糖产率达38.15％，酶解周期为72小时，而对比例1的单糖产率仅为35.73％，酶解周期为88小时，单糖产率提高幅度高达6.77％，酶解周期缩短了16小时以上，并同时提高了设备利用率并降低了综合能耗。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

按照本发明，该方法包括在水的存在下，将含纤维素原料与酶混合、酶解，得到酶解产物，其中，所述酶解分为连续的多个酶解阶段进行，所述多阶段包括主酶解阶段和主酶解阶段以后的酶解阶段，在主酶解阶段中，向酶解罐中连续加入含纤维素原料以及酶，所述含纤维素原料的加入量以及酶的加入量使得经过该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为50-100g/L（5-10%），并使经过该主酶解阶段得到的酶解产物依次连续流入主酶解阶段以后的酶解阶段的酶解罐中进行酶解，酶解终点的酶解产物中单糖的含量为大于或等于105g/L（10.5%）。其中，该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量指从主酶解阶段的最后一个酶解罐中流出的酶解产物中单糖的含量；酶解终点的酶解产物中单糖的含量指经过主酶解阶段以及后续的酶解阶段后得到的最终的酶解产物中单糖的含量。

按照本发明，所述主酶解阶段为连续进行酶解的阶段，在该主酶解阶段中，向酶解罐中连续加入含纤维素原料以及酶，能够保证酶与纤维素原料的充分接触、混合，并保证经过主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖达到一定的浓度，从而利于酶解周期的优化。优选情况下，含纤维素原料的加入量以及酶的加入量使得经过该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为60-80g/L。

按照本发明，在主酶解阶段中，所述连续加入的含纤维素原料以及酶的加入量只要保证使得经过该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为50-100g/L（5-10%），更优选为60-80g/L（6.0-8.0%）即可，并且所述含纤维素原料的加入量可以根据生产能力而定，例如，可以为10-300千克/小时。

按照本发明，所述多阶段包括连续的多个酶解阶段，即，所述多阶段包括依次串联的多个酶解阶段的酶解罐（包括主酶解阶段和主酶解阶段以后的酶解阶段），即，所述连续的多个酶解阶段中的每个酶解阶段对应一个酶解罐，对于所述酶解罐的种类和数量没有特别的限制，可以是本领域中常用的各种酶解罐。它们的位置可以在高度相同的一个平面上或者高度不同的平面上，呈梯级式。本发明优选多个酶解罐在一个平面上串联连接。

按照本发明，所述主酶解阶段优选包括连续进行的2-3个酶解阶段，即，依次包括串联的两个或三个酶解罐；将含纤维素原料连续加入主酶解阶段的第一酶解阶段的酶解罐中。为了使所述主酶解阶段的酶解进行的更加充分，将酶分别连续加入到主酶解阶段的第一酶解阶段的酶解罐和与其串联的第二酶解阶段的酶解罐中，在所述第二酶解罐中加入酶的方式，优选，待第一酶解阶段得到的酶解产物流入第二酶解阶段的酶解罐后再连续向第二酶解阶段的酶解罐中加入酶。

按照本发明，对于主酶解阶段以后的酶解阶段的数量没有特别的限制，从充分酶解和生产周期的缩短以及设备的利用率等方面综合考虑，优选，所述主酶解阶段以后的酶解阶段包括依次串联的1-3个酶解罐。

按照本发明，在所述主酶解阶段中，所述串联的多个酶解阶段的酶解罐输送酶解产物的方式多为溢流方式，且每个酶解阶段的酶解程度也与纤维素原料以及酶的流量以及罐体积有关。

具体地，在所述主酶解阶段中，后一酶解阶段的酶解罐的物料入口和与其相邻的前一酶解阶段的酶解罐的物料出口相连通。每个酶解阶段的酶解罐的物料入口可以位于酶解罐的上部，与之对应，每个酶解阶段的物料出口可以位于酶解罐的下部；或者每个酶解阶段的酶解罐的物料入口也可以位于酶解罐的下部，与之对应，每个酶解罐的物料出口也可以位于酶解罐的上部。在所述主酶解解阶段中，从第一酶解阶段的酶解罐的物料入口连续加入含纤维素原料和酶，使含纤维素原料酶解，待第一酶解阶段的酶解产物从酶解罐的物料出口流出进入第二酶解阶段的酶解罐中，将酶连续加入第二酶解阶段的酶解罐中，从而与第一酶解阶段酶解的酶解产物混合，继续酶解，经第二酶解阶段酶解的酶解产物从第二酶解罐的物料出口流出选择性地进入第三酶解阶段的酶解罐中继续充分酶解，而后将酶解产物依次连续流入与之连通的后续酶解阶段的酶解罐中进行连续酶解，直至酶解完成的终点酶解产物从最后一个酶解阶段的酶解罐的物料出口流出。

此外，由于酶解产物粘度较大，流动性较差，因此，可以将后一酶解阶段的酶解罐的物料入口设置成比所述前一酶解阶段的酶解罐的物料入口稍低。另外，并可以通过泵送帮助粘稠的酶解产物顺利地流入到下一个酶解罐中。

所述酶解罐的结构及酶解罐的串联连接方式都是本领域公知的，在此不再赘述。每个罐中物料的初始装液量为每个酶解罐体积的50-70%；当物料的流入和流出达到平衡后，将每个罐的装液量调节到80%左右。

由于本发明仅涉及对酶解方式的改进，因此对用含纤维素的原料制备乙醇的方法的其它步骤没有特别的限制。

按照本发明，所述酶解使用的酶包括纤维素酶。所述纤维素酶可以通过各种方式获得，例如商购得到，或者通过使用产酶微生物分泌得到。

由于使用产酶微生物分泌得到的酶会含有各种副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克含纤维素原料的干重计，所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位，更优选为10-15酶活力单位。

例如，当优选以干重计的所述含纤维素原料的加入量为300-350千克/小时，更优选为310-330千克/小时，在所述主酶解阶段中，所述纤维素酶的加入总量为2.4×10⁶-7.0×10⁶酶活力单位/小时，更优选为3.0×10⁶-5.25×10⁶酶活力单位/小时（纤维素酶的加入总量包括主酶解阶段的向多个酶解罐，如第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纤维素酶的总量）。

按照本发明，优选情况下，在所述主酶解阶段中，为了在尽量短的时间内保证得到的酶解产物具有一定的单糖含量，连续向第一酶解阶段的酶解罐加入的酶占酶总加入量的50%-70%，向第二酶解阶段的酶解罐加入的酶占酶总加入量的30%-50%。因此，在上述含纤维素原料的加料量的前提下，连续加入第一酶解阶段的酶解罐的纤维素酶的加入量为1.2×10⁶-4.9×10⁶酶活力单位/小时，连续加入第二酶解阶段的酶解罐的纤维素酶的加入量为0.72×10⁶-3.5×10⁶酶活力单位/小时。

本发明所述纤维素酶的酶活力按照美国国家可再生能源实验室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）提供的标准方法——纤维素酶活力测定NREL LAP-006测定，所述纤维素酶的酶活力单位为在该标准方法规定的测定条件下，1分钟内将1克Whatman No.1滤纸转化为葡萄糖所需酶的微克数。

按照本发明，优选情况下，在所述主酶解阶段中，为了在尽量短的时间内保证得到的酶解产物具有一定的单糖含量，连续向第一酶解阶段的酶解罐加入的酶占酶总加入量的50%-70%，向第二酶解阶段的酶解罐加入的酶占酶总加入量的30%-50%。因此，在上述含纤维素原料的加料量的前提下，连续加入第一酶解阶段的酶解罐的纤维素酶的加入量为1.2×10⁶-4.9×10⁶酶活力单位/小时，连续加入第二酶解阶段的酶解罐的纤维素酶的加入量为0.72×10⁶-3.5×10⁶酶活力单位/小时。

优选情况下，所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶。因为半纤维素酶可以降解半纤维素成为溶于水的木糖，所以酶解使用的酶包括半纤维素酶，从而可以更充分地暴露纤维素，增加纤维素与纤维素酶的接触几率，以增加单糖产率。

本发明的方法还包括在主酶解阶段中，以每克含纤维素原料的干重计，所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。更优选情况下，将半纤维素酶分别连续加入第一酶解阶段的酶解罐和第二酶解阶段的酶解罐中，连续加入第一酶解阶段的酶解罐的半纤维素酶的加入量为0.66×10⁶-2.156×10⁶酶活力单位/小时，连续加入第二酶解阶段的半酶解罐的纤维素酶的加入量为0.396×10⁶-1.54×10⁶酶活力单位/小时。

由于本发明仅涉及对酶解方式的改进，因此对用含纤维素的原料制备乙醇的方法的其它步骤没有特别的限制。

其中，所述纤维素酶为复合酶，至少包括C₁型纤维素酶、Cx型纤维素酶和纤维二糖酶三种酶。

C₁酶可以使结晶的纤维素转变为非结晶的纤维素。

C_Ｘ型纤维素酶又分为C_Ｘ1型纤维素酶和C_Ｘ2型纤维素酶两种。C_Ｘ1型纤维素酶为内切型纤维素酶，可以从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1,4-糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖。C_Ｘ2型纤维素酶是一种外切型纤维素酶，可以从水合非纤维素分子的非还原端作用于β-1,4-糖苷键，逐一切断β-1,4-糖苷键生成葡萄糖。

纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。

本发明所述半纤维素酶的酶活力单位（U）为在50℃、pH=4.8条件下，每分钟分解浓度为1重量％木聚糖溶液产生1微克还原糖（以木糖计）所需的酶量。

本发明所述半纤维素酶的活力指每克半纤维素酶所具有的活力单位。所述半纤维素酶的活力利用半纤维素酶在50℃、pH为4.8的条件下水解1重量％木聚糖产生还原糖（以木糖计），所得还原糖与过量3,5—二硝基水杨酸（DNS）发生颜色反应，用分光光度计测得反应液550纳米的光吸收值与还原性糖（以木糖计）的生成量成正比关系测定。具体测定方法如下：

准确称取1.000克木聚糖，用0.5毫升pH=＝4.8的0.1摩尔/升乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，然后用去离子水定容到100毫升，得到1重量％木聚糖溶液；

称取30克四水合酒石酸钾钠放入500毫升锥形瓶内，加16克NaOH后，加50毫升去离子水，以5℃/分钟的速度水浴加热至固体物质溶解，加入1克3,5-二硝基水杨酸，至溶解，冷却至室温，用去离子水定容至100毫升，可得3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液；

将木糖80℃烘干至恒重，准确称取1.000克溶于1000毫升水中，加10毫克叠氮化钠防腐，得到1毫克/毫升的标准木糖溶液；

准确称取1.000克固体半纤维素酶或移取1毫升液体半纤维素酶原液，用0.5毫升pH=4.8的0.1摩尔乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，然后用去离子水定容到100毫升，得到稀释100倍的待测酶液；

分别将在50℃水浴加热60分钟的2毫升木糖梯度标准溶液（0.1毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.3毫克/毫升、0.4毫克/毫升和0..5毫克/毫升，所述木糖梯度标准溶液用去离子水与1毫克/毫升的标准木糖溶液混合制备）或去离子水（木糖空白对照），与2毫升DNS混合沸水浴5分钟，冷却，去离子水定容15毫升后，用分光光度计在550纳米下分别测定反应后木糖梯度标准溶液的光吸收值，以光吸收值为横坐标，木糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。由该标准曲线可得回归方程y＝=bx+a，其中，x为光吸收值，y为木糖浓度，a为所得直线方程的截距，b为所得直线方程的斜率；

取0.2毫升待测酶液与1.8毫升所述1重量%木聚糖溶液或pH＝=4.8的0.1摩尔/升乙酸－乙酸钠缓冲溶液（木聚糖空白对照），按照与上述木糖梯度标准溶液相同的步骤测试光吸收值。并按照下式计算半纤维素酶的活力：

式中x为待测酶液的光吸收值，b和a与木糖浓度对光吸收值的回归方程中的b和a一致，n为酶的稀释倍数，60表示为酶促反应的时间为60分钟，5为取样倍数（这里从1毫升待测酶液中取出了0.2毫升进行测试）。

根据上述方法可以测定出具体的半纤维素酶的活力，进而计算出半纤维素酶的用量。

按照本发明，所述酶解的温度可以为纤维素酶的任何最适作用温度，一般为45-55℃，更优选为48-52℃。所述酶解的时间只要保证经过主酶解阶段的酶解以及后续的酶解阶段的酶解后得到的酶解终点的酶解产物中单糖的含量为大于或等于105g/L（10.5%）即可，采用本发明的酶解方式后，以传统的单罐酶解方法相比，酶解周期能够缩短16小时以上。所述酶解周期理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解周期为56-80小时，更优选为64-72小时。所述酶解周期指从将酶与含纤维素原料混合时开始计算直至酶解终点的酶解产物中单糖浓度达到要求为止所用的时间。

为了保证酶具有最佳的反应活性，在将含纤维素原料与酶混合前，调节含纤维素原料的pH值为大于3小于7，优选为4.0-6.0，以使得含纤维素原料与酶混合后，酶具有最佳的反应活性。所述调节反应物料pH值的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法。如根据所得含纤维素原料的pH值，在该含纤维素原料中加入酸性物质或碱性物质。例如，所述酸性物质可以是硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种；所述碱性物质可以是氢氧化钠和/或氢氧化钾。

为了使酶与反应原料混合的更均匀，所述含纤维素原料的酶解优选在水存在条件下进行，因此，为了进料方便，更优选先向位于主酶解阶段首位的酶解罐中加入水，并连续加入含纤维素原料以及酶，以使含纤维素原料与水混合得到悬浮液，更利于位于主酶解阶段首位的酶解罐中的物料粘度的降低。对所加入的水的量没有特别限定，优选情况下，所述水的加入量与全部含纤维素原料的重量比为1:1-3。

所述含纤维素原料可以是各种农作物的秸秆、草本植物的茎杆等，如玉米秸秆、稻草、小麦秸秆、高粱秆等。由于秸秆的主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，为了在酶解时能使纤维素酶和半纤维素酶充分与秸秆中的纤维素和半纤维素接触进行充分酶解，在酶解之前优选还对含纤维素原料进行预处理以将纤维素、半纤维素和木质素分离开。

所述含纤维素原料的预处理方法可以是本领域技术人员公知的方法，例如，酸处理方法和/或蒸汽爆破方法。所述酸处理方法包括将含纤维素原料与酸混合以溶解木质素而使之与纤维素和半纤维素分离。所述用于溶解含纤维素原料中的木质素的酸的种类为本领域技术人员所公知，如：所述酸可以是本领域常规的各种酸，如，选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种；所述酸的用量和浓度没有特别限定，可以根据需要溶解的含纤维素原料中木质素的量控制酸的用量和浓度。

所述蒸汽爆破方法包括将含纤维素原料与水混合后进行蒸汽爆破或者直接将含纤维素原料置于蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破。由于蒸汽爆破方法更有利于破坏含纤维素原料中纤维素、半纤维素和木质素之间的网状结构，使纤维素能够被充分分离出来，有利于纤维素酶在纤维素表面的作用，提高纤维素的水解率及糖的产率。因此，本发明优选所述含纤维素原料的预处理方法为蒸汽爆破方法，所述含纤维素原料优选为蒸汽爆破的含纤维素原料和/或酸处理的含纤维素原料。

采用现有技术常规的蒸汽爆破条件进行的蒸汽爆破都能达到本发明的发明目的，例如，所述蒸汽爆破的温度为160-200℃，所述蒸汽爆破的压力为0.6-1.6兆帕，所述蒸汽爆破压力的维持时间为3-10分钟。更优选所述蒸汽爆破的温度为160-180℃，所述蒸汽爆破的压力为0.6-1.0兆帕，所述蒸汽爆破压力的维持时间为4-8分钟。

由于含纤维素原料中可能会含有沙石杂质以及铁杂质，对蒸汽爆破设备会造成损害，因此本发明的制备乙醇的方法，可以包括在蒸汽爆破之前对含纤维素原料进行除石除铁常规操作，比如以“风送”含纤维素原料并磁铁吸引的方法进行除石除铁。沙石由于质量大，不能被风送到蒸汽爆破设备中，铁杂质由于磁铁的吸引也不会随原料进入蒸汽爆破设备中，从而可以完成除石除铁。此外，由于含纤维素原料本身容易缠结而堵塞设备管路，因此，在进入蒸汽爆破设备前，优选使所述含纤维素原料的大小为0.5-3厘米×0.2-1厘米×0.2-1厘米，更优选使所述含纤维素原料的大小为1-2厘米×0.4-0.6厘米×0.5-1厘米。

下面结合实施例对本发明进行更详细的说明。

下述实施例中，所使用的酶解罐是宜兴市制药设备厂生产的型号为φ2800×3500，ss304、容量为21500L的酶解罐，所使用的纤维素酶是诺维信酶制剂公司生产的牌号为NS50010的纤维素酶，本发明中所使用的半纤维素酶是诺维信酶制剂公司生产的牌号为NS50013的半纤维素酶。

实施例1

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

（1）含纤维素原料的预处理

将1000Kg没有杂质的玉米秸秆（含水量10重量％）切成不超过1.2厘米×0.5厘米×1.0厘米的小段，在180℃下维持1.0兆帕的压力5分钟，然后泄压，完成蒸汽爆破。共得到1800Kg蒸汽爆破产物（含水量为50重量％）。

所得固体蒸汽爆破产物中纤维素总重量和半纤维素总重量的测定：

取10克上述蒸汽爆破产物在45℃下烘干至恒重5克，称量300.0毫克该干燥后的蒸汽爆破产物，放置于重80克的100毫升干燥三角烧瓶内。向所述三角烧瓶内加入3.00毫升浓度为72重量％的硫酸溶液，搅拌1分钟。然后将三角烧瓶在30℃的水浴中放置60分钟，每隔5分钟搅拌一次以确保均匀水解。水解结束后，用去离子水使硫酸的浓度稀释到4重量％，然后用布氏漏斗过滤，共得到滤液84毫升。将20毫升滤液转移至干燥的50毫升的三角瓶中。使用2.5克碳酸钙调节该滤液的pH值至5.5，静置5小时，收集上层清液。用0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，所得滤液用BioradAminexHPX-87P高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC条件：进样量20微升；流动相为0.2微米滤膜过滤并且超声振荡脱气的HPLC超纯水；流速为0.6毫升/分钟；柱温80-85℃；检测器温度80-85℃；检测器为折光率检测器；运行时间为35分钟。以0.1-4.0毫克/毫升浓度范围的D-（+）葡萄糖和0.1-4.0毫克/毫升浓度范围D-（+）木糖作为标准样品。HPLC分析得到蒸汽爆破产物酸水解液中葡萄糖浓度为2.7毫克/毫升，计算可得1克所述蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.224克的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破产物中纤维素重量的1.11倍，即1克所述蒸汽爆破产物中含纤维素0.202克，则1800Kg蒸汽爆破产物中共含纤维素363Kg。HPLC分析得到蒸汽爆破产物酸水解液中木糖浓度为0.67毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.057克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破产物中半纤维素重量的1.14倍，即1克所述蒸汽爆破产物中含半纤维素0.048克，则1800Kg蒸汽爆破产物中共含半纤维素87Kg。

（2）酶解

所述酶解分多阶段进行，所述多阶段包括连续进行的主酶解阶段以及主酶解阶段以后的酶解阶段，所述主酶解阶段包括依次串联的2个酶解阶段的酶解罐，后续酶解阶段包括依次串联的3个酶解阶段的酶解罐，5个酶解罐之间都是依次串联。

先将步骤（1）取样测试后剩余的蒸汽爆破产物与水以1.42：1的重量比进行混合，调节混合物的pH值为5，然后在搅拌条件下，将调节pH值后所得的混合物以42.58Kg/小时的速度连续加入到第一酶解阶段的酶解罐中，同时以1.25×10⁵酶活力单位/小时的速度向第一酶解阶段的酶解罐中加入纤维素酶，所述第一酶解阶段的酶解罐的酶解温度保持在52℃，后续酶解阶段的酶解罐中的酶解温度于此相同，经第一酶解阶段的酶解产物从所述第一酶解阶段的酶解罐的出口流出并流入到第二酶解阶段的酶解罐中，从与所述第二酶解阶段的酶解罐的流入口相连的酶加入口向所述第二酶解阶段的酶解罐中连续加入纤维素酶，纤维素酶加入速度为6.25×10⁴酶活力单位/小时，以每克含纤维素原料的干重计，在第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纤维素酶的用量为15酶活力单位，经第二酶解阶段的酶解产物从所述第二酶解阶段的酶解罐的流出口流出，以此完成主酶解阶段，将主酶解阶段第二酶解阶段的酶解罐中流出的酶解产物取样（主酶解阶段的时长为每罐12小时），进行过滤，将20毫升滤液转移至干燥50毫升的三角瓶中，静置5小时，收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，按照上述步骤（1）所述高效液相条件，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为75g/L（7.5%）。

经主酶解阶段酶解的酶解产物接着依次连续流入到后续的三个串联的酶解罐，酶解完全的酶解产物从最后一个酶解罐中流出，整个酶解周期经历了72小时，将酶解完全的最终酶解产物进行过滤，按照上述方法测定计算出经后续阶段的酶解完全的最终酶解产物中葡萄糖含量为112g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为343.34Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共309.32Kg，按照下式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

纤维素转化率=100%×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量

单糖产率=100%×酶解得到的葡萄糖重量/秸秆干重

对比例1

本对比例说明酶解含纤维素原料的参比方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素原料，不同的是，在酶解步骤（2）中将步骤（1）取样测试后剩余的蒸汽爆破产物一次全部加入到含水的酶解罐中，然后与酶混合均匀（全部蒸汽爆破产物与水的重量比为1.42：1），酶解时间为88小时；并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在酶解步骤（2）中，将调节pH值后所得的混合物以47.89Kg/小时的速度连续加入到第一酶解阶段的酶解罐中，同时以9.4×10⁴酶活力单位/小时的速度向第一酶解阶段的酶解罐中加入纤维素酶，加入到第二酶解罐的纤维素酶加入速度为4.7×10⁴酶活力单位/小时，以每克含纤维素原料的干重计，在第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纤维素酶的用量为10酶活力单位，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为60g/L（6.0%），（主酶解阶段的时长为每罐12小时），整个酶解过程经历了64小时，酶解完全的最终酶解产物中葡萄糖含量为110.8g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为339.63Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共305.97Kg，并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在酶解步骤（2）中，将调节pH值后所得的混合物以45.08Kg/小时的速度连续加入到第一酶解阶段的酶解罐中，同时以1.06×10⁵酶活力单位/小时的速度向第一酶解阶段的酶解罐中加入纤维素酶，加入到第二酶解罐的纤维素酶加入速度为5.3×10⁴酶活力单位/小时，以每克含纤维素原料的干重计，在第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纤维素酶的用量为12酶活力单位，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为65g/L（6.5%），（主酶解阶段的时长为每罐12小时），整个酶解过程经历了68小时，酶解完全的最终酶解产物中葡萄糖含量为111.5g/L，从得到的完全酶解的最终酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为341.68Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共307.82Kg，并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在酶解步骤（2）中，将调节pH值后所得的混合物以41.43Kg/小时的速度连续加入到第一酶解阶段的酶解罐中，同时以6.5×10⁴酶活力单位/小时的速度向第一酶解阶段的酶解罐中加入纤维素酶，加入到第二酶解罐的纤维素酶加入速度为3.2×10⁴酶活力单位/小时，以每克含纤维素原料的干重计，在第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纤维素酶的用量为8酶活力单位，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为52g/L（5.2%），（主酶解阶段的时长为每罐12小时），整个酶解过程经历了74小时，酶解完全的最终酶解产物中葡萄糖含量为110.11g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为337.53Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共304.09Kg，并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在酶解步骤（2）中，先将步骤（1）取样测试后剩余的蒸汽爆破产物与水以1.42：1的重量比进行混合，调节混合物的pH值为6，所述第一酶解阶段的酶解罐的酶解温度保持在55℃，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为65g/L，（主酶解阶段的时长为每罐12小时），整个酶解过程经历了78小时，酶解完全的酶解产物中葡萄糖含量为108.2g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为331.69Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共298.82Kg，并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例6

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在本实施例中使用3个串联连接的酶解罐，主酶解阶段包括两个酶解罐，后续酶解阶段包括一个酶解阶段，先将步骤（1）取样测试后剩余的蒸汽爆破产物与水以1.42：1的重量比进行混合，调节混合物的pH值为5，然后在搅拌条件下，将调节pH值后所得的混合物以54.74Kg/小时的速度连续加入到第一酶解阶段的酶解罐中，同时以1.8×10⁵酶活力单位/小时的速度向第一酶解阶段的酶解罐中加入纤维素酶，从与所述第二酶解阶段的酶解罐的流入口相连的酶加入口向所述第二酶解阶段的酶解罐中连续加入纤维素酶，纤维素酶加入速度为9.1×10⁴酶活力单位/小时，以每克含纤维素原料的干重计，在第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纤维素酶的用量为17酶活力单位，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为62g/L（6.2%），（主酶解阶段的时长为每罐12小时），经主酶解阶段酶解的酶解产物接着依次流入到后续酶解阶段的1个的酶解罐，酶解完全的酶解产物从该酶解罐中流出，整个酶解过程经历了56小时，经后续阶段的酶解完全的酶解产物中葡萄糖含量为107g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为328.23Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共295.70Kg，并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例7

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

按照实施例1的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在本实施例中使用5个串联连接的酶解罐，主酶解阶段包括3个酶解罐，后续的酶解阶段包括2个酶解罐，先将步骤（1）取样测试后剩余的蒸汽爆破产物与水以1.42：1的重量比进行混合，调节混合物的pH值为5，然后在搅拌条件下，将调节pH值后所得的混合物以38.32Kg/小时的速度连续加入到第一酶解阶段的酶解罐中，同时以7.5×10⁴酶活力单位/小时的速度向第一酶解阶段的酶解罐中加入纤维素酶，经第一酶解阶段的酶解产物进入第二酶解罐进行第二酶解阶段的酶解，从与所述第三酶解阶段的酶解罐的流入口相连的酶加入口向所述第三酶解阶段的酶解罐中连续加入纤维素酶，纤维素酶加入速度为3.75×10⁴酶活力单位/小时，以每克含纤维素原料的干重计，在第一酶解罐和第三酶解罐中加入的纤维素酶的用量为10酶活力单位，第三酶解罐进行第三酶解阶段的酶解，以此完成主酶解阶段，经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为72g/L，经主酶解阶段酶解的酶解产物接着依次流入到后续酶解阶段的2个的酶解罐，酶解完全的酶解产物从最后一个酶解罐中流出，整个酶解过程经历了80小时，经后续阶段的酶解完全的酶解产物中葡萄糖含量为109.52g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为335.72Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共302.45Kg，并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

实施例8

本实施例用于说明本发明的含纤维素原料的酶解方法。

（1）含纤维素原料的预处理

将1000Kg没有杂质的玉米秸秆（含水量10％）切成不超过1.5厘米×0.4厘米×1.0厘米的小段，将秸秆段水浸5分钟后（秸秆与水的重量比为1：25），并在190℃下维持1.25兆帕的压力3分钟，然后泄压，完成蒸汽爆破。共得到1925Kg蒸汽爆破产物（含水量为53.25重量％）。

按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解蒸汽爆破产物的方法，得到蒸汽爆破产物酸水解液中葡萄糖浓度为2.52毫克/毫升，计算可得1克所述蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.209Kg的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破产物中纤维素重量的1.11倍，即1克所述蒸汽爆破产物中含纤维素0.189克，则1925Kg蒸汽爆破产物中共含纤维素363Kg。HPLC分析得到蒸汽爆破产物酸水解液中木糖浓度为0.64毫克/毫升，计算可得1克所述蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.052克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破产物中半纤维素重量的1.14倍，即1克所述蒸汽爆破产物中含半纤维素0.045克，则1925Kg蒸汽爆破产物中共含半纤维素87Kg。

按照与实施例1相同的方法进行酶解步骤（2），不同的是，在向主酶解阶段的第一酶解罐加入纤维素酶的同时还连续加入半纤维素酶，待第一酶解罐中的酶解产物开始流入第二酶解阶段的酶解罐中时，将纤维素酶连续加入该第二酶解阶段的酶解罐中的同时还连续加入半纤维素酶，连续加入第一酶解罐和第二酶解罐中的纤维素酶的加入量与实施例1的相同，连续加入第一酶解罐的半纤维素酶的加入量为48750酶活力单位/小时，连续加入第二酶解阶段的酶解罐的半纤维素酶的加入量为24375酶活力单位/小时；以每克含纤维素原料的干重计，连续加入第一酶解罐和第二酶解罐中的所述半纤维素酶的用量为5酶活力单位。按照与上述步骤（1）所述高效液相条件，得出经主酶解阶段的酶解产物中的葡萄糖含量为72g/L（7.2%）。

并按照实施例1步骤（1）所述高效液相条件，经后续阶段的酶解完全的酶解产物中葡萄糖含量为155g/L，从得到的完全酶解的酶解产物的总体积计算出所述酶解产物中的葡萄糖为343.34Kg。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共309.31Kg，测定并计算出酶解产物中的木糖共74.66Kg，所述酶解得到的木糖的重量除以1.14，即蒸汽爆破产物中被酶解的半纤维素的重量共65.49Kg；并按照下述公式计算纤维素、半纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

纤维素转化率=100%×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量

半纤维素转化率＝100%×被酶解的半纤维素的重量/半纤维素的总重量

单糖产率=100%×（酶解得到的葡萄糖重量＋酶解得到的木糖重量）/秸秆干重

对比例2

本对比例说明酶解含纤维素原料的参比方法。

按照实施例8的方法酶解含纤维素的原料，不同的是，在酶解步骤（2）中将步骤（1）取样测试后剩余的蒸汽爆破产物一次全部加入到含水的酶解罐中，然后与酶混合均匀（全部蒸汽爆破产物与水的重量比为1.7：1），酶解时间为80小时；并按照实施例8的方法和公式计算计算纤维素、半纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。

表1

从上表1中的数据可以看出，采用本发明的含纤维素原料的酶解方法得到的单糖的产率明显高于由参比方法，且酶解周期显著缩短。

Claims (10)

1.一种含纤维素原料的酶解方法，该方法包括在水的存在下，将含纤维素原料与酶混合、酶解，得到酶解产物，其特征在于，所述酶解分为连续的多个酶解阶段进行，所述多阶段包括主酶解阶段和主酶解阶段以后的酶解阶段，在主酶解阶段中，向酶解罐中连续加入含纤维素原料以及酶，所述含纤维素原料的加入量以及酶的加入量使得经过该主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为50-100g/L，并使经过该主酶解阶段得到的酶解产物依次连续流入主酶解阶段以后的酶解阶段的酶解罐中进行酶解，酶解终点的酶解产物中单糖的含量为大于或等于105g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含纤维素原料的加入量以及酶的加入量使得经过所述主酶解阶段得到的酶解产物中的单糖含量为60-80g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多阶段包括依次串联的多个酶解阶段的酶解罐；主酶解阶段包括依次串联的2-3个酶解罐，将含纤维素原料连续加入主酶解阶段的第一酶解阶段的酶解罐中，将酶分别连续加入主酶解阶段的第一酶解阶段的酶解罐和与其串联的第二酶解阶段的酶解罐中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述主酶解阶段以后的酶解阶段包括依次串联的1-3个酶解罐。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，连续向主酶解阶段的第一酶解阶段的酶解罐加入的酶占酶总加入量的50-70%，连续向第二酶解阶段的酶解罐加入的酶占酶总加入量的30-50%。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，酶解使用的酶包括纤维素酶，以每克含纤维素原料的干重计，所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位。

7.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶，以每克含纤维素原料的干重计，所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶解的温度为45-55℃，所述酶解的pH值为4-6。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述含纤维素原料为蒸汽爆破的含纤维素原料和/或酸处理的含纤维素原料。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述含纤维素原料为秸秆。