CN103789236B - 协助寄主植物缓解干旱胁迫的抗逆菌株h4-1l - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种协助寄主植物缓解干旱胁迫的抗逆菌株H4-1L，属于植物保护技术领域。H4-1L菌株在LB培养液28℃180rpm振荡培养12-16小时，再6000rpm离心10min，用灭菌水重悬浮并且稀释成活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL的菌剂。温室条件在辣椒和黄瓜移栽时用109CFU/mL？的菌剂灌根处理，20mL/株，移栽1周内正常浇水2次，1周后开始进行干旱处理。相对于对照组，菌株H4-1L处理能够提高辣椒和黄瓜抗旱能力，根长分别增加30.8%和25.3%，鲜重增加26.6%和44.4%，叶绿素含量增加82.9%和20.7%，根系活力增加56.0%和49.6%。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及一株能够协助寄主植物缓解干旱胁迫的抗逆菌株H4-1L。
背景技术
当植物蒸腾速率超过水分吸收速率或土壤缺乏植物可利用的水分时，植物发生干旱胁迫。干旱胁迫是田间条件下存在最广泛的一种作物生长逆境。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的1／3，我国干旱、半干旱地区约占国土面积的1／2。同时其他半湿润甚至湿润地区也常会有周期性、季节性或临时性的干旱。特别是2011年我国长江中下游五省大旱，据报道约造成农作物受灾面积3705.1千公顷，其中绝收面积166.8千公顷；直接经济损失149.4亿元。
目前，在干旱条件下，除了力所能及的调度灌溉水以外，人们主要依靠以下几种途径来缓解干旱对农业生产造成的危害：一化学调控方法：一些能促进水分调节、渗透调节、气孔调节和光合调节等一系列生理生化机制的化学物质能增强植物的代谢活性，提高其抗旱性，但是无论哪一种化学调节剂都存在经济成本问题以及对于环境，土壤的副作用；二基因工程：近年来，利用基因工程技术改进植物体内干旱应答基因产物水平已成为培育抗逆性新品种的一种手段，至今，已有不少植物已成功导入相关抗旱基因且抗旱程度也有所提高，如水稻、烟草、棉花等，但是，利用基因工程培育抗旱品种在蔬菜方面的研究较少；另外，在长期的进化过程中，植物自身也建立起了在面对干旱胁迫时的应答反应，但是植物自身调节抗旱能力有限，不足以应对持续干旱带来的胁迫压力。
自上个世纪七十年代植物根围促生细菌(Plant Growth-promoting rhizobacteria，PGPR)这个概念提出以来，已经在不同寄主植物上，不同的生态环境中分离得到多种促生菌。这些微生物在促进植物生长、抑制病害发生、调节根围微生态结构各个方面得到了广泛的应用，也为人类挽回了巨大的经济损失。其中一些品种已经进行商业化生产。近几年，有越来越多的学者开始不只是关注 PGPR 促生抗病方面的能力，而是将注意力转移到这些有益微生物在协助植物抗逆的作用上来，包括耐盐胁迫、耐干旱胁迫等。Glick等人报道，具有ACC（1-氨基环丙烷-1羧酸）脱氨酶活性的菌株能够降低植物根部乙烯含量，促进植物根部伸长。Barea 和Brown也证明根部接种产IAA（吲哚乙酸）的菌株能够显著增加植物的干重和根长。
综上所述，通过筛选和开发一些具有独特代谢途径的植物根围促生细菌来协助寄主植物缓解干旱胁迫带来的压力，在气候条件不断恶化的大背景下，具有很好的意义与开发前景。
发明内容
本发明的目的是：在蔬菜的生产当中，提供能够协助寄主植物有效缓解干旱胁迫压力的抗逆菌株H4-1L，从而帮助寄主植物应对由于气候条件改变带来的干旱逆境，在一定程度上保证蔬菜的安全生产。
本发明的技术解决方案是：协助寄主植物缓解干旱胁迫的抗逆菌株H4-1L，为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），与2013年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.8517。
其中，所述的保藏号为CGMCC No.8517的恶臭假单胞菌株H4-1L在协助辣椒和黄瓜缓解干旱胁迫中应用于菌剂，其中恶臭假单胞菌株H4-1L的活菌浓度为1×109-1010 CFU/ml。
其中，所述的以保藏号为CGMCC No.8517的恶臭假单胞菌株H4-1L为有效成分的菌剂的生产方法是：H4-1L菌株在LB培养液28℃ 180 rpm振荡培养12-16小时，再6000 rpm离心10 min，用灭菌水重悬浮并且稀释成活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。
其中，上述菌剂在协助寄主植物抗旱时的应用方法是：温室条件在辣椒和黄瓜移栽时用1×109-1×1010CFU/mL的菌剂灌根处理，20mL/株，移栽1周内正常浇水2次，20mL/次，1周后开始不再浇水进行干旱处理。
本发明的有益效果表现在：它是专门针对植物生长中所遇到的干旱逆境所开发，能够通过自身的代谢过程产生具有生物活性的代谢物质ACC（1-氨基环丙烷-1羧酸）脱氨酶和IAA（吲哚乙酸），从而促进植物根部伸长，增强根系活力，抵御干旱胁迫带来的压力；相比于化学调控等方法，具有成本低、无毒无害对环境及人畜友好等优点，能够协助植物度过由于气候条件等原因造成的干旱逆境；结果表明：相对于对照组，菌株H4-1L处理能够提高辣椒和黄瓜抗旱能力，具体生理指标如下：根长分别增加30.8%和25.3%，鲜重增加26.6%和44.4%，叶绿素含量增加82.9%和20.7%，根系活力增加56.0%和49.6%。
具体实施方式
1、菌株来源：采用稀释涂板法分离自江苏省淮安市武墩镇黄瓜温室采集的根围土样品中，菌株编号为H4-1L。
2、菌株的筛选依据：通过以下两种方法检测筛选菌株产IAA和ACC脱氨酶活性
IAA活性检测：将分离纯化后的菌株H4-1L接种于含有L-色氨酸（100mg·L-1）的LB液体培养基中，30℃、180r·min-1条件下摇床培养1d；取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液（50mLφ＝35％的HClO4 ＋1mL 0.5mol·L-1 FeCl3），将加入50μL IAA（50mg·L-1）的比色液作为阳性对照；白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30min后观察，颜色变红表示能够产IAA。
ACC脱氨酶活性检测：将菌株H4-1L接种到DFa培养液中：KH2PO4 4g·L-1 ,Na2HPO4 6g·L-1, MgSO4·7H2O 0.2g·L-1, 葡萄糖2g, 葡萄糖酸2g, 柠檬酸2g, ACC终浓度为3mmol·L-1，pH 7.2，30℃、180r·min-1条件下摇床培养1d；以不接菌株的培养液做对照，检测培养液在600nm下的吸光值，根据吸光值判断菌株是否能够在以ACC为唯一氮源的培养液中生长。
表1，菌株筛选信息
注：1：+代表参试菌株培养后与对照相比产生明显红色；2：菌株接种到ACC作为唯一氮源的培养液中培养24h后以未接种的培养液为对照检测吸光值，表中数值为三次重复实验的平均值。
3、菌株鉴定：通过16S rDNA序列比对，菌株H4-1L与恶臭假单胞菌株（Genebank登录号CQ303714.1）序列相似性100%；另外菌株H4-1L革兰氏染色反应阴性，在LB培养基上形成1-3mm菌落，呈圆形、边缘不整齐，白色，表面光滑；与《常用细菌学鉴定手册》中假单胞菌Pseudomonas的特性一致；故鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。
4、温室实验：温室实验中所选用的黄瓜和辣椒品种分别为“新津优1 号”和“大禹牛角王”，所用基质购自淮安市柴米河农业科技有限公司；首先用穴盘育苗，待苗长出3-4片真叶后移栽到盆钵中，温室条件为：温度30℃，光照时间16h，黑暗时间8h；每个处理组3次重复，每个重复24株植株；对照组1不接种菌株，每隔三天浇水20mL/盆；对照组2不接种菌株，移栽1周内正常浇水2次，20mL/次，1周后开始进行干旱处理；H4-1L处理组处理方式如下：移栽时用109CFU/mL 的菌剂灌根处理，20mL/盆，移栽1周内正常浇水2次，20mL/次，1周后开始进行干旱处理；
温室实验植株移栽后第21天分别检测各处理组根长、鲜重、叶绿素含量、根系活力以及叶片相对电导势，检测方法参照《植物生理学实验指导》。
表2，温室实验结果
Claims (2)
1.协助寄主植物缓解干旱胁迫的抗逆菌株H4-1L，为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），于2013年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.8517；其特征是：所述的保藏号为CGMCC No.8517的恶臭假单胞菌株H4-1L在协助辣椒和黄瓜缓解干旱胁迫中应用于菌剂，其中恶臭假单胞菌株H4-1L的活菌浓度为1×109-1010 CFU/ml。
2.根据权利要求1所述的协助寄主植物缓解干旱胁迫的抗逆菌株H4-1L，其特征是：以保藏号为CGMCC No.8517的恶臭假单胞菌株H4-1L为有效成分的菌剂的生产方法是：H4-1L菌株在LB培养液28℃ 180 rpm振荡培养12-16小时，再6000 rpm离心10 min，用灭菌水重悬浮并且稀释成活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。
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