CN103787902A - 苄基取代的苯胺类化合物及其应用 - Google Patents
苄基取代的苯胺类化合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种如式Ⅰ所示苄基取代苯胺类化合物或其在药物学上可接受的盐：其中，R1独立选自：-COOH、-CONH2、H、-COOR5（R5为甲基或乙基），-CN、-OH和-NH2COCH3；R2和R3分别独立选自：C6-C10的芳基、C3-C6的环烷烃以及C1～C3的饱和烷基或不饱和烷基；R4独立选自：-H、乙基和乙酰基。本发明的化合物及其药物学上可接受的盐可用作法尼基转移酶抑制剂或用于制备预防或治疗与法尼基转移酶相关疾病的药物，具有良好的成药前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种苄基取代的苯胺类化合物及其应用。
背景技术
翻译后修饰(Post-translational modification，PTM)对蛋白的成熟具有重要的意义，这些翻译后修饰包括乙酰化，烷基化，甲基化以及异戊二烯化等。异戊二烯化则由法尼基转移酶催化完成。
法尼基转移酶(farnesyltransferase，FTase)是一种能够进行翻译后修饰的锌离子金属酶，能够催化使法尼基焦磷酸酯(farnesyl pyrophosphate，FPP)中的法尼基(十五个碳的类异戊二烯)转移到Ras蛋白碳末端的一个四肽结构上，这一四肽结构为CAAX(C：半胱氨酸，A：脂肪族氨基酸，X：甲硫氨酸，谷氨酸或丙氨酸)，法尼基则连接在半胱酸酸的硫原子上。当Ras蛋白被法尼基化后，则碳末端连接的十五个碳的类异戊二烯使Ras蛋白的疏水性增加，使得Ras蛋白能够更加容易的固定于细胞膜，细胞中的信号通路才能正常进行，细胞才能正常的生长、增殖、分化。
Ras蛋白的突变使Ras蛋白酶持续的活化状态，细胞增殖失控，导致肿瘤的形成。在90%的胰腺癌，50%结肠癌和30%肺癌中已经发现突变的Ras蛋白(宋艳，周湘，李慧芳，陆涛，以Ras信号转导通路为靶点的抗肿瘤抑制剂的研究进展，中南药学，2009，7(4)，293-296)。
因此，研究法尼基转移酶抑制剂成为了药物学家们关注的焦点。
发明内容
本发明综合运用计算机药物设计、药物化学、分子生物学方法和技术，设计并合成了一系列苯氨类化合物，其中一些化合物具有显著的法尼基转移酶抑制活性，具备良好的成药前景。
本发明目的在于，提供一种如式Ⅰ所示苄基取代的苯胺类化合物或其在药物学上可接受的盐：
其中，R1独立选自：-COOH、-CONH2、H、-COOR5，R5为甲基或乙基，-CN、-OH和-NH2COCH3；R2和R3分别独立选自：C6-C10的芳基、C3-C6的环烷烃以及C1～C3的饱和烷基或不饱和烷基；R4独立选自：-H、乙基和乙酰基。
在本发明优选的实施方式中，R1独立选自：-COOH、-CONH2、H、-COOR5，R5为甲基或乙基，-CN、-OH和-NH2COCH3；R2独立选自：2-氟苄基、环已亚甲基、奈亚甲基；R3独立选自：2-氟苄基、环已亚甲基、奈亚甲基、乙基、异丙基；R4独立选自：-H、乙基和乙酰基。
在本发明优选的实施方式中，所述苄基取代的苯胺类化合物为如下化合物（1）～（15）：
本发明的另一方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐。
优选地，在所述的药物组合物还可以包括：合适的稀释剂或填料：例如糖类如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；合适的纤维素制剂或钙磷酸盐（例如磷酸三钙或磷酸氢钙）；合适的粘结剂：例如淀粉糊，玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉等。
如果需要，还可增加崩解剂和/或以抵抗胃液的合适包衣剂等。本发明提供的药物组合物可制成多种剂型，以口服或注射方式给药。
本发明的另一方面是一种法尼基转移酶抑制剂，其包含本发明的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面是本发明的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐作为法尼基转移酶抑制剂的应用。
本发明的另一方面是本发明的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备法尼基转移酶抑制剂中的应用。
本发明的另一方面是本发明的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗与法尼基转移酶相关疾病的药物中的应用。
附图说明
图1作为对照的阳性化合物替吡法尼的IC50。
具体实施方式
下面详述本发明苄基取代的苯胺类化合物的合成方法。
其主要步骤是：以3，4-二羟基苯甲醛为起始原料，首先将其5位卤代(式Ⅱ所示化合物)，然后将此溴卤代中间体的4位羟基引入芳基或环烷基等(式Ⅲ所示化合物)，再将此单羟基中间体的3位引入不同的芳基、环烷基或烷基等(式Ⅳ所示化合物)，最后能过苯胺衍生物(式Ⅴ所示化合物)中的胺基和以上中间体中的醛反应，生成希夫碱，再用硼氢化钠还原得到部分目标物(式Ⅵ所示化合物)，最后在式Ⅵ所示化合物中的氮原子上引入烷基、烷氧基、不饱和烯烃或-COR’得到目标化合物(式Ⅰ所示化合物)。
其中，R1～R5的定义与前文所述相同。
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，这些实施例仅用于说明本发明及更好地理解本发明的内容，其不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1
4-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(1)
化合物1的合成路线如下所示：
3-乙氧基-4-羟基-5-溴苯甲醛的合成(1.1)
将3-乙氧基-4-羟基苯甲醛(6.64g，40.0mmol)溶于乙酸(80mL)中，充分溶解。然后将液溴(2.46mL)逐滴加入到反应液中，滴加结束后，常温反应3小时，出现浑浊。TLC监测反应结束后，抽滤得固体，将所固体用50%乙醇水溶液重结晶，得目标化合物1.1为7.8g，产率80%。
3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苯甲醛的合成(1.2)
将化合物1.1(3.0g，12.3mmol)和邻氟苄溴(2.31g，12.3mmol)溶于DMF(5mL)中，并加入碳酸钾(2.04g，14.75mmol)，100度反应4小时，反应结束后用乙酸乙酯和水萃取，分离有机相，并用水和卤水分别洗涤，最用有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕色目标化合物1.2为2.81g，产率65%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.88(s，1H)，7.75(d，1H，J=2.0Hz)，7.59-7.54(m，2H)，7.46-7.40(m，1H)，7.25-7.21(m，2H)，5.22(s，2H)，4.19(q，2H，J=7.2Hz)，1.40(t，3H，J=7.2Hz)。
4-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(1)
将化合物1.2(445mg，1mmol)和对氨基酚(131mg，1.2mmol)溶于乙醇(5mL)中，磁力搅拌，60度反应4小时，待原料完全转化完后，分批加入硼氢化钠(38mg，1mmol)，4小时后反应结束。将粗品溶于水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水MgSO4干燥，柱分离(PE/EA=3/1，v/v)，得产品为白色固体为220mg，产率49%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.44(s，1H)，7.60-7.56(m，1H)，7.45-7.40(m，1H)，7.25-7.20(m，2H)，7.13(s，1H)，7.08(s，1H)，6.53(d，2H，J=8.8Hz)，6.44(d，2H，J=8.8Hz)，5.63(t，1H，J=6.0Hz)，5.02(s，2H)，4.05(q，2H，J=7.2Hz)，3.18(d，2H，J=7.2Hz)，1.35(t，3H，7.2Hz)。
HRMS(ESI)calcd for C22H21BrFNO3[M+H]+446.0767，found446.0757。
实施例2
4-(3,4-二(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(2)
化合物2的合成路线如下所示：
化合物2.1的合成如化合物1.1所示，不同之处在于将合成1.1过程中用到的3-乙氧基-4-羟基苯甲醛替换为3,4-二羟基苯甲醛；化合物2.2的合成如化合物1.2所示，不同之处在于将化合物1.1替换为化合物2.1；化合物2的合成如化合物1合成所示，不同之处在于将化合物1.2替换为化合物2.2。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.43(s，1H)，7.59-6.44(m，10H)，6.53(d，2H，J=8.4Hz)，6.45(d，2H，J=8.4Hz)，5.66(t，1H，J=6.0Hz)，5.20(s，2H)，4.99(s，2H)，4.15(d，2H，J=6.0Hz)。
HRMS(ESI)calcd for C27H22BrF2NO3[M+H]+526.0829，found526.0834。
实施例3
4-(3-环已亚甲氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(3)
化合物3的合成路线如下所示：
化合物3.1的合成：
将化合物2.1(300mg，1.39mmol)溶于DMF(3.0mL)中，并加入碳酸氢钠(174mg，2.07mmol)和碘化钾(69mg，0.414mmol)，向混合液中加入邻氟苄溴(519mg，2.76mmol)后，磁力搅拌，40度反应过夜，TLC跟踪原料转化。粗品溶于水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水MgSO4干燥，浓缩。产物经硅胶柱层析分离(DCM/PE=9/1，v/v)，得产物为白色固体为270mg，产率60%。
化合物3.2的合成条件如化合物1.2的合成条件，不同之处在于使用两个不同的反应物，即化合物3.1和环已基甲基溴；化合物3的合成参见化合物1的合成，不同之处在于将合成化合物1时用到的底物1.2替换为3.2，产物168mg，产率68%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.43(s，1H)，7.59-6.44(m，10H)，6.53(d，2H，J=8.4Hz)，6.45(d，2H，J=8.4Hz)，5.66(t，1H，J=6.0Hz)，5.20(s，2H)，4.99(s，2H)，4.15(d，2H，J=6.0Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ161.9，159.5，153.3，148.9，143.1，141.7，139.3，131.6，130.9，130.8，124.8，124.75，124.5，124.3，122.7，116.1，115.8，115.6，114.2，112.5，74.1，67.8，67.77，56.5，47.3，37.7，29.6，26.4，25.8，19.0。
HRMS(ESI)calcd for C27H30BrFNO3[M+H]+514.1393，found514.1383。
实施例4
4-(3-(萘-2-亚甲基)-4-(2-氟苄基)-5-溴苄胺基)苯酚(4)
合成方法参见实施例3，不同之处在于将合成化合物3.2时用到的环乙基甲基溴替换为萘-2-亚甲基溴，产物为白色固体，产率56%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.43(s，1H)，8.02-7.87(m，4H)，7.62-7.49(m，4H)，7.40-7.32(m，2H)，7.21-7.08(m，3H)，6.52(d，2H，J=8.8Hz)，6.45(d，2H，J=8.8Hz)，5.65(t，1H，J=6.0Hz)，5.33(s，2H)，5.06(s，2H)，4.15(d，2H，J=6.0Hz)。
HRMS(ESI)calcd for C31H26BrFNO3[M+H]+558.1080，found558.1074。
实施例5
4-(3-烯丙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(5)
合成方法参见实施例3，不同之处在于将合成化合物3.2时用到的环乙基甲基溴替换为烯丙基溴，产物为白色固体，产率56%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.21(s，1H)，7.60-7.20(m，4H)，7.14(s，1H)，7.12(s，1H)，6.53(d，2H，J=8.8Hz)，6.45(d，2H，J=8.8Hz)，6.10-6.00(m，1H)，5.62(t，1H，J=6.0Hz)，5.43(dd，1H，J=17.2Hz，J=1.6Hz)，5.28(dd，J=10.8Hz，J=1.2Hz)，5.03(s，2H)，4.60(d，2H，J=5.2Hz)，4.12(d，2H，J=6.0Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ162.0，159.6，152.6，149.0，143.3，141.7，139.3，133.6，131.8，131.77，131.0，130.9，124.8，124.79，124.4，124.2，123.2，118.1，117.3，116.1，115.8，115.6，114.2，113.3，69.6，67.9，67.8，47.3。
HRMS(ESI)calcd for C23H22BrFNO3[M+H]+458.0767，found458.0763。
实施例6
4-(3-异丙氧基-4-(2-氟苄氧基-5-溴)苄胺基)苯酚(6)
合成方法参见实施例3，不同之处在于将合成化合物3.2时用到的环乙基甲基溴替换为异丙基溴，产物为白色固体，产率67%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.42(s，1H)，7.60-7.20(m，4H)，7.11(s，1H)，7.08(s，1H)，6.53(d，2H，J=8.8Hz)，6.45(d，2H，J=8.8Hz)，5.64(t，1H，J=6.0Hz)，5.00(s，2H)，4.64-4.58(m，1H)，4.13(d，2H，J=4.8Hz)，1.27(d，6H，J=6.0Hz)。
HRMS(ESI)calcd for C23H24BrFNO3[M+H]+460.0924，found460.0924。
实施例7
4-(3-乙氧基-4-(已基亚甲氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(7)
合成方法参见实施例1，不同之处在于将合成化合物1.2时用到的邻氟苄溴替换为环已基甲基溴，产物为白色固体，产率44%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.40(s，1H)，7.09(s，1H)，7.01(s，1H)，6.51(d，2H，J=8.8Hz)，6.42(d，2H，J=8.8Hz)，5.59(t，1H，J=6.4Hz)，4.08(d，2H，J=6.0Hz)，4.00(q，2H，J=7.7Hz)，3.68(d，2H，J=6.0Hz)，1.84-1.81(m，2H)，1.70-1.61(m，4H)，1.31(t，3H，J=7.2Hz)，1.25-1.03(m，5H)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ152.7，148.7，143.9，141.5，138.4，122.7，116.8，115.9，113.9，112.7，78.1，64.4，47.1，38.3，29.6，26.4，25.6，14.9。
HRMS(ESI)calcd for C22H29BrNO3[M+H]+434.1331，found434.1324。
实施例8
4-(3-乙氧基-4-(萘基-2-亚甲氧基)-5-溴苄胺基)苯酚(8)
合成方法参见实施例1，不同之处在于将合成化合物1.2时用到的邻氟苄溴替换为萘-2-亚甲基溴，产物为白色固体，产率53%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.45(s，1H)，7.99-7.94(m，5H)，7.71-7.69(m，1H)，7.55-7.53(m，2H)，7.16(s，1H)，7.11(s，1H)，6.55(d，2H，J=8.8Hz)，6.46(d，2H，J=8.8Hz)，5.65(t，1H，J=6.0Hz)，5.12(s，2H)，5.15-4.07(m，4H)，1.38(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ152.9，148.8，143.4，141.6，139.1，135.1，133.1，133.0，128.2，128.1，127.9，127.3，126.7，126.6，126.5，122.8，117.2，116.0，114.1，112.7，74.5，64.6，47.2，15.0。
HRMS(ESI)calcd for C26H25BrNO3[M+H]+478.1018，found478.1008。
实施例9
N-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯胺(9)
合成方法参见实施例1，不同之处在于将合成化合物1时用到的对氨基酚替换为苯胺，产物为白色固体，产率56%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.59-7.55(m，1H)，7.44-7.39(m，1H)，7.24-7.19(m，2H)，7.12(s，1H)，7.08(s，1H)，7.07-7.03(m，2H)，6.58-6.51(m，3H)，6.24(t，1H，J=6.0Hz)，5.02(s，2H)，4.20(d，2H，J=6.4Hz)，4.05(q，2H，J=6.8Hz)，1.34(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ161.6，159.1，152.5，148.4，142.8，138.3，131.4，130.5，130.4，128.8，124.3，123.9，123.8，122.2，116.8，116.0，115.3，115.1，112.3，112.2，67.3，67.2，64.1，45.7，14.5。
HRMS(ESI)calcd for C22H22BrFNO2[M+H]+430.0818，found430.0814。
实施例10
4-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯甲腈(10)
合成方法参见实施例1，不同之处在于将合成化合物1时用到的对氨基酚替换为对氨基苯甲腈，产物为白色固体，产率43%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.61-7.56(m，1H)，7.47-7.40(m，3H)，7.28-7.20(m，3H)，7.10(d，2H，J=8.8Hz)，6.67(d，2H，J=8.8Hz)，5.03(s，2H)，4.30(d，2H，J=6.0Hz)，4.09-4.03(m，2H)，1.35(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ161.6，159.1，152.6，151.8，143.1，136.9，133.4，131.42，131.38，130.5，130.45，124.3，124.26，123.9，123.7，122.3，120.5，116.9，115.3，115.1，112.3，112.2，96.2，67.3，67.27，64.2，44.9，14.5。
HRMS(ESI)calcd for C23H21BrFN2O2[M+H]+477.0590，found477.0587。
实施例11
4-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯甲酸甲酯(11)
合成方法参见实施例1，不同之处在于将合成化合物1时用到的对氨基酚替换为对氨基苯甲酸甲酯，产物为白色固体，产率32%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.65(d，2H，J=8.8Hz)，7.60-7.56(m，1H)，7.45-7.39(m，1H)，7.25-7.21(m，2H)，7.20-7.09(m，3H)，6.64(d，2H，J=8.8Hz)，5.03(s，2H)，4.30(d，2H，J=6.0Hz)，4.06(q，2H，J=6.8Hz)，1.35(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ166.7，162.1，159.6，153.1，152.9，152.8，143.5，137.7，131.9，131.8，131.4，130.9，124.8，124.4，124.3，122.8，117.4，116.8，115.8，115.6，112.8，111.8，67.8，67.7，64.7，51.7，45.6，45.5，15.0。
HRMS(ESI)calcd for C24H24BrFNO4[M+H]+510.0692，found510.0689。
实施例12
4-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)苯甲酸(12)
化合物12由化合物11通过氢氧化锂水解得到，产率86%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.67(d，2H，J=8.8Hz)，7.60-7.56(m，1H)，7.45-7.40(m，1H)，7.25-7.20(m，2H)，7.10(d，2H，J=9.2Hz)，7.03(m，1H)，6.61(d，2H，J=8.8Hz)，5.03(s，2H)，4.39(d，2H，J=6.0Hz)，4.06(q，2H，J=6.8Hz)，
1.35(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ168.0，162.1，159.6，153.1，152.6，143.5，137.9，131.9，131.8，131.6，131.0，130.9，124.8，124.7，124.4，124.3，122.8，118.1，117.4，115.8，115.6，112.8，111.7，67.8，67.7，64.7，45.6，15.0。
HRMS(ESI)calcd for C23H22BrFNO4[M+H]+496.0536，found496.0533。
实施例13
4-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄胺基)乙酰苯胺(13)
合成方法参见实施例1，不同之处在于将合成化合物1时用到的对氨基酚替换为4-氮乙酰苯胺，产物为白色固体，产率38%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.52(s，1H)，7.60-7.56(m，1H)，7.44-7.39(m，1H)，7.25-7.19(m，4H)，7.12(s，1H)，7.08(s，1H)，6.51(d，2H，J=8.8Hz)，6.07(t，1H，J=6.0Hz)，5.02(s，2H)，4.18(d，2H，J=6.0Hz)，4.05(q，2H，J=6.8Hz)，1.95(s，3H)，1.34(t，3H)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ167.7，162.1，159.6，153.0，145.0，143.3，138.9，131.9，131.8，131.0，130.9，129.4，124.8，124.7，124.5，124.3，122.8，121.3，117.3，115.8，115.6，112.8，112.7，67.8，67.7，64.7，46.6，24.2，15.0。
HRMS(ESI)calcd for C24H24BrFN2O3Na[M+Na]+509.0852，found509.0845。
实施例14
N-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄基)-N-乙酰基对羟基苯胺(14)
化合物14的合成：
将化合物1(890mg，2.00mmol)溶于乙醇(10.0mL)中，再加入乙酸酐(204mg，2.00mmol)，反应过夜，TLC跟踪原料转化。反应结束后，将有机相旋干，粗品溶于150.0mL水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水MgSO4干燥，将产物进行柱分离得白色产物为593mg，产率61%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.66(s，1H)，7.56-7.52(m，1H)，7.45-7.39(m，1H)，7.24-7.20(q，2H)，6.97-6.94(d，3H)，6.82(s，1H)，6.75(d，2H，J=8.8Hz)，5.04(s，2H)，4.71(s，2H)，4.00(q，2H，J=6.8Hz)，1.80(s，3H)，1.33(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ170.3，162.1，159.7，157.2，152.9，143.6，136.2，134.2，131.93，131.90，131.0，130.9，129.5，124.73，124.70，124.3，124.2，123.9，117.2，116.3，115.8，115.6，113.45，67.71，67.68，64.6，51.6，22.8，14.9。
HRMS(ESI)calcd for C24H23BrFNO4Na[M+Na]+510.0692，found510.0689。
实施例15
N-(3-乙氧基-4-(2-氟苄氧基)-5-溴苄基)-N-乙基对羟基苯胺(15)
化合物15的合成：
将氢化锂铝(76mg，2.00mmol)在冰浴下溶于THF(8mL)中，再称取化合物14(243mg，0.5mmol)加入混合液中，将温度升至常温，反应过夜，TLC跟踪原料转化。反应结束后，将有机相旋干，粗品溶于水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水MgSO4干燥，将产物进行柱分离得到白色产物为64mg，产率27%。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.61(s，1H)，7.60-7.56(m，1H)，7.45-7.40(m，1H)，7.25-7.20(m，2H)，6.98(s，1H)，6.95(s，1H)，6.63-6.57(m，4H)，5.03(s，2H)，4.29(s，2H)，4.02(q，2H，J=6.8Hz)，3.30(q，2H，J=6.8Hz)，1.33(t，3H，J=6.8Hz)，1.06(t，3H，J=6.8Hz)。
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ162.1，159.6，153.1，149.6，143.2，141.7，138.4，131.9，131.8，131.0，130.9，124.8，124.7，124.4，124.3，122.5，117.3，116.2，115.9，115.8，115.6，112.3，67.8，67.7，64.6，54.3，46.1，15.0，12.4。
HRMS(ESI)calcd for C24H26BrFNO3[M+H]+474.1080，found474.1076。
本发明提供的化合物对法尼基转移酶体外抑制活性效果：
1.FTase的诱导表达
1.1预培养
取30 μl保存的pRSFDuet-FNTαβ-BL21(此菌株来自Professor Gerrit J.K.Praefcke)菌液接种到5mL卡那抗性LB培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，230rpm摇床培养过夜。
1.2扩大培养
取3.0mL过夜培养的菌液接种至500mL灭菌的LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，37℃、230rpm摇床培养。
1.3诱导表达
恒温培养至OD600为0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，以及ZnCl2至终浓度为0.5mM，16℃，230rpm诱导16h。
1.4收集菌体
菌液4℃下4000rpm离心20min，将上清培养基倒掉，用无菌水将菌体重新悬起，再次以10000rpm转速离心10min，弃上清，菌体沉淀于-80℃保存。
2.FTase的纯化
2.1超声破碎
用20mL裂解缓冲液(50mM Tris,200mM NaCl,50μM ZnCl2,5mM MgCl2,1mMβ-巯基乙醇,20mM咪唑,pH7.7)将菌体悬起，在冰浴上超声破碎5次(300W，工作5秒，间隔10秒，工作30次)。破碎后得到的细胞匀浆在4℃下10000rpm离心30min，上清待与树脂结合。
2.2蛋白纯化
Ni-NTA层析柱预处理：放掉乙醇后，水洗3-4次，结合NiSO420min，水洗3-4次，用洗脱缓冲液平衡。
将上一步中的蛋白上清液与预处理过的Ni柱树脂结合4h，重新装入层析柱中，待蛋白液流完后，用80mL的洗脱缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液,200mM NaCl,50μM ZnCl2,5mM MgCl2,1mMβ-巯基乙醇,20mM咪唑,pH7.7)分四次流过层析柱，尽量将杂蛋白洗掉，然后加入大约10ml洗脱缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液,200mM NaCl,50μM ZnCl2,5mM MgCl2,1mMβ-巯基乙醇,200mM咪唑,pH7.7)，使其缓慢流出，控制流速约10秒每滴，分管收集。将蛋白装入MD34-14透析袋中，在4℃层析柜中用透析缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液,200mM NaCl,50μM ZnCl2,5mM MgCl2,1mMβ-巯基乙醇,pH7.7)分两次透析，每次4-5h，之后用微孔浓缩管浓缩至1ml左右。将蛋白放于4℃暂时保存，用于SDS-PAGE检测蛋白分子量和纯度。取样之后，加入20%甘油，于-80℃保存。
2.3SDS-PAGE电泳检测蛋白浓度和纯度
将收集的各样品取10μl，加入等量的加样缓冲液，在煮样器上100℃煮十分钟，4000rpm离心2min。按照实验方法中胶的制备方法制备好SDS-PAGE凝胶，装好电泳系统，加入电泳缓冲液后，按照胶孔选择上样体积，一般为10μl，连接好电极，以90V电压进行电泳，溴酚蓝进入分离胶后改为120V电压，当溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳。卸下胶板，剥离胶放入染色液中染色2-3h，加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上脱色。至完全脱净后，用凝胶成像系统记录实验结果，纯度为75.4%。
2.4Bradford法测蛋白浓度
用Bradford测蛋白浓度的方法，首先绘制标准曲线，做两组平行。
振荡混匀后，室温放置5-10min，以蛋白含量为横坐标，吸光值（A595）为纵坐标，绘制标准曲线。
将浓缩后的蛋白稀释20倍，取2μl，加入198μl染色液，读吸光值。
测得蛋白浓度为35mg/ml，共1ml。
3.法尼基转移酶活测定
法尼基转移酶活的测定方法主要是根据David L.Pompliano的方法进行。将底物N-丹磺酰-GCVLS(一种修饰的多肽，GCVLS代表氨基酸序列)用DMSO溶成1mM，法尼基焦磷酸酯（FPP）用检测缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液,20μM ZnCl2,10mMMgCl2,5mM二硫苏糖醇,0.02%吡喃葡萄糖苷，pH7.5)稀释成10μM。法尼基转移酶用透析缓冲液稀释成不同浓度梯度(25μM,20μM,10μM,5μM,2.5μM)。
根据表1的反应体系，利用BioTek-Synergy2酶标仪进行酶活测试实验。反应总体系为50μl，首先将检测缓冲液加入到384孔板孔中，再加入N-丹磺酰-GCVLS(一种修饰的多肽，GCVLS代表氨基酸序列)和不同浓度的酶，最后加入法尼基焦磷酸酯起始反应。反应开始之后，在激发340nm，发射505nm处每隔30秒检测一次荧光吸收强度的变化，检测整个反应过程为10分钟。得到荧光随时间的变化曲线，进而确定最佳的酶活条件。
表1 法尼基转移酶（Ftase）测活体系
| 测试缓冲液 | N-丹磺酰-GCVLS(1mM) | 法尼基焦磷酸酯(10μM) | 法尼基转移酶 |
| 44.4μl | 0.1μl | 5μl | 0.5μl |
4.法尼基转移酶抑制剂（FTT）的筛选
4.1阳性替吡法尼的IC50
将阳性化合物用DMSO溶解成5mM的母液，再稀释成浓度梯度（50μM,25μM,10μM,5μM,2μM,1μM,0.5μM,0.1μM,0.05μM）。根据要加的孔数计算好所需缓冲液，N-丹磺酰-GCVLS和法尼基转移酶（终浓度0.2μM）的量，预混，用排枪加入到384孔板中，再分别加入0.1μl浓度梯度的阳性替吡法尼，室温孵育10分钟，加入底物法尼基焦磷酸酯，读数。每个实验设3个平行，以DMSO为空白，得到替吡法尼的IC50图（附图1）。
4.2初筛
经酶活测试后，选择合适的酶浓度（0.2μM）进行抑制剂的筛选。将化合物用DMSO稀释，以10μM进行初筛，替吡法尼为阳性对照。反应体系如表2：
表2 化合物筛选体系
| 测试缓冲液 | N-丹磺酰-GCVLS(1mM) | 化合物（10μM） | FTase | FPP(10μM) |
| 44.2μl | 0.1μl | 0.2μl | 0.5μl | 5μl |
5实验结果
从实验结果如下表3所示。
通过活性测试结果分析可知，R1为羟基时,化合物的活性较高,推测可能与酶活性中心的锌离子作用，但并未得到证实，有待于进一步研究；R3、R4为两个疏水性的基团，和酶的疏水口袋作用，通过测试结果可以猜测疏水口袋的大小和六元的芳香环或环烷烃较匹配（如环已基）。
化合物1-15对FTase的IC50
Claims (8)
1.一种如式Ⅰ所示苄基取代的苯胺类化合物或其在药物学上可接受的盐：
其中，R1独立选自：-COOH、-CONH2、H、-COOR5（R5为甲基或乙基）、-CN、-OH和-NH2COCH3；R2和R3分别独立选自：C6-C10的芳基、C3-C6的环烷烃以及C1～C3的饱和烷基或不饱和烷基；R4独立选自：-H、乙基和乙酰基。
2.如权利要求1所述的苄基取代的苯胺类化合物或其在药物学上可接受的盐，所述苄基取代的苯胺类化合物为如下化合物（1）～（15）：
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐。
4.一种法尼基转移酶抑制剂，其包含权利要求1或2所述的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐。
5.一种如权利要求1或2所述的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐作为法尼基转移酶抑制剂的应用。
6.一种如权利要求1或2所述的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备法尼基转移酶抑制剂中的应用。
7.一种如权利要求1或2所述的苄基取代的苯胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗与法尼基转移酶相关疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述与法尼基转移酶相关疾病是前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌。
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