CN103783255B

CN103783255B - 一种从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法

Info

Publication number: CN103783255B
Application number: CN201410038891.XA
Authority: CN
Inventors: 李向红; 俞健; 刘永乐; 王发祥; 王建辉; 赵静斌; 王小东
Original assignee: Changsha University of Science and Technology
Current assignee: Changsha University of Science and Technology
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2034-01-27
Also published as: CN103783255A

Abstract

本发明提供了一种从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法，以瓜蒌子提油副产物为原料，通过粉碎机粉碎过筛后分别以pH8.0~8.5的3%~5% NaCl溶液和0.05~0.1mol/L的NaOH溶液二次抽提，实现瓜蒌子中蛋白质的高效提取。该方法的主要步骤是：瓜蒌子提油副产物→粉碎→脱脂→抽滤、自然干燥→粉碎→过筛→第一次提取→离心→沉淀部分第二次提取→离心→合并上清液→透析→干燥。该方法原料选用瓜蒌子提油副产物，变废为宝，提高了原料附加值，具有明显的经济效益和环境效益；采用两次提取，最大可能的提取出不同性质蛋白质，提取率高达80%以上。该提取工艺操作简单，易得，成本低，适于大规模工业化提取。

Description

一种从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种瓜蒌子提油副产物中蛋白质的高效提取方法。

技术背景

瓜蒌子主要产于山东、四川、安徽等地，具有润肺化痰，滑肠通便等药用价值。瓜蒌子富含油脂、甾醇、三萜、苷类等物质，其中含脂肪油约为26%，不饱和脂肪酸约占67%，包括瓜楼酸、油酸、亚油酸、亚麻油酸，因此许多研究着重于瓜蒌子油的超临界CO₂萃取及其性质分析。瓜蒌子提油副产物中含有30%左右的蛋白质及钙、铁、铜、锌等无机元素，而目前大部分时候是将其副产物作为废弃物，对其中很有价值的成份未能充分提取利用，造成巨大资源浪费和环境污染。因此，高效提取瓜蒌子提油副产物中的蛋白质，具有技术含量高，附加值高的特点，具有明显的经济效益和社会效益，研究开发前途广泛。李赤翎等采用了碱法和盐法分别对石油醚提油后的瓜蒌子中的蛋白质进行提取，得率很低，最优工艺的提取率也仅17%左右；提取所用碱液浓度高（2%），过多的废液排放会造成环境污染；提取温度较高（70℃），有可能导致蛋白质变性，影响到蛋白质的功能性质。（参考文献：李赤翎，夏闻，俞建，等. 瓜蒌籽粗蛋白的提取研究, 食品科技，2010，35（1）：218-219）。

发明内容

针对现有瓜蒌子蛋白提取技术中提取率低、提取碱液浓度高等缺陷，本发明提出了一种从瓜蒌子提油副产物中蛋白质的高效提取方法，其提取工艺简单，蛋白质提取率高。

本发明的技术路线为：瓜蒌子提油副产物→粉碎→脱脂→抽滤、自然干燥→粉碎→过筛→第一次提取→沉淀部分第二次提取→脱色、离心→上清液合并→透析→干燥。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：

（1）粉碎：将瓜蒌子提油副产物粉碎并过100目-200目筛，得粉碎后的原料；

（2）脱脂：在所述粉碎后的原料中按质量体积比加入5~10倍体积的正己烷，搅拌1~1.5小时，得脱脂产物；

（3）抽滤：将所述脱脂产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过100目-200目筛，得过筛后的产物；

（4）第一次提取：在所述过筛后的产物中按质量体积比加入5~10倍体积的pH 8.0~8.5的4%~6% NaCl溶液，均质后于20℃~25℃搅拌提取1 h-2h，搅拌过程中控制pH稳定于8.0~8.5；搅拌提取后采用冷冻离心机于0℃-4℃，8000~10000 r/min离心15 min ~20 min，得上清液a和沉淀；

（5）第二次提取：在所述沉淀中按质量体积比加入5~10倍体积的0.05~0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于20℃~25℃搅拌提取1 h-2h；提取后采用冷冻离心机于0℃-4℃，8000~10000 r/min离心15 min ~20 min，取上清液b；

（6）脱色、离心：将上清液b调节pH值至6.5~7.0后脱色，脱色温度20℃~25℃，脱色时间为1.5~2 h，脱色后离心去除脱色剂；

（7）上清液合并：将上清液a与上清液b合并；

（8）透析、干燥：以截留分子量1000 Da的透析袋在4℃-6℃透析12 h -24 h，干燥。

步骤（1）所用瓜蒌子提油副产物优选为超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物，副产物中蛋白质含量在20%-40%，超临界二氧化碳萃取瓜蒌子油的操作温度为40℃-50℃。

步骤（6）所述脱色剂优选为活性炭。

步骤（8）所述干燥优选采用冷冻干燥或喷雾干燥。

下面对本发明做进一步补充说明：

步骤（1）所用原料为超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物，副产物中蛋白质含量在30%左右，而且超临界二氧化碳萃取瓜蒌子油的操作温度在42℃左右，对瓜蒌子中蛋白质的性质影响较小。

步骤（2）所述的脱脂是将粉碎后的副产物按质量体积比加入5~10倍的正己烷恒速搅拌1~1.5小时，充分浸提副产物中的残留脂类、部分色素等物质。提油后的瓜蒌子渣中还残余一部分脂肪及大量的色素，这些物质的存在会影响到蛋白质的提取及所提蛋白的纯度和性质，因此有必要进一步脱脂。

步骤（3）所述的抽滤、自然干燥并粉碎过筛是将正己烷抽提后的副产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过100目筛，可减少提取时蛋白质分散到溶剂中的阻力，提高提取率。

步骤（4）所述的第一次提取方法是将过筛后的副产物粉按质量体积比加入5~10倍体积的pH 8.0~8.5的4~6% NaCl溶液，均质后于20~25℃搅拌提取1h左右，期间采用pH计监测其pH值，并用稀碱液调节pH值，使其稳定于8.0~8.5，同时保证体系中的盐浓度在4~6%，能最大程度的将副产物中水溶性的清蛋白、盐溶性的球蛋白和部分弱碱溶性的蛋白质提取出来。

步骤（5）所述的第二次提取是将第一次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10~20倍0.05~0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于20~25℃搅拌提取1 h左右，pH值达到12左右，能将副产物中残留的碱溶性蛋白提取出来。

步骤（6）所述的脱色是将第二次提取所得的上清液调节pH值至6.5~7.0后采用活性炭脱色，脱色温度20~25℃，脱色时间为1.5~2 h。碱溶后的上清液中溶出了大量副产物中的色素，将提取液的pH值从碱性调节至6.5~7.0一方面可以提高活性炭脱色效果，另一方面未达到瓜蒌子蛋白的等电点，避免蛋白质沉淀析出。

本发明以瓜蒌子提油副产物为原料，经粉碎、脱脂、抽滤、两次抽提、脱色、透析以及干燥等工序高效提取分离得到瓜蒌子蛋白质，整个提取程序简化，条件温和，采用的NaCl抽提液和NaOH溶液简单易得，成本低廉，有利于工业化推广；提取过程采用不同抽提液分两次抽提，并借助高速均质、离心等辅助手段，能最大可能的提取出不同性质的瓜蒌子蛋白质，提取率高；高速离心后上清液经活性炭脱色除去色素等杂质，经透析除去残留NaCl和NaOH，可直接用于后续瓜蒌子蛋白质系列产品的研究及开发。该提取工艺的主要指标有：瓜蒌子提油副产物中蛋白质提取率≥80%，远远高于现有提取技术；蛋白质纯度≥90%。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

（1）原料选用瓜蒌子提油副产物，变废为宝，提高了原料附加值，具有明显的经济效益和环境效益；

（2）采用pH 8.0~8.5的NaCl溶液和NaOH溶液按优化条件分两次提取，最大可能的提取出不同性质蛋白质，提取率高达80%以上。

（3）该提取工艺操作简单，条件温和，提取试剂常规易得，成本低廉，适于大规模工业化提取。

具体实施方式：

下面结合具体实施例来进一步解释和说明本发明，但是本发明的保护范围不仅仅限定在实施例所列举的范围。实施例中所述百分含量除特别说明外均指质量百分含量。

实施例1：

以超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物原料，采用粉碎机粉碎并过100目筛后按质量体积比加入5倍的正己烷恒速搅拌1.5小时，正己烷抽提后的副产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过100目筛；将过筛后的副产物粉按质量体积比加入10倍体积的pH 8.0的4% NaCl溶液，均质后于20℃搅拌提取1 h，期间采用pH计监测其pH值，并用稀碱液调节pH值，使其稳定于8.0；提取后采用冷冻离心机于4℃，8000 r/min离心20 min，取上清液；将第一次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10倍0.05 mol/L的 NaOH溶液，均质后于20℃搅拌提取1 h；提取后采用冷冻离心机于4℃，8000 r/min离心20 min，取上清液；第二次提取所得的上清液调节pH值至6.5后采用活性炭脱色，脱色温度20℃，脱色时间为1.5 h。脱色后4000 r/min离心15 min去除活性炭；将第一次提取的上清液与活性炭脱色的第二次提取液合并后以截留分子量1000 Da的透析袋在4℃透析24 h，再采用冷冻干燥后于4℃贮藏备用。以本方法提取瓜蒌子提油副产物中的蛋白质，提取率≥80%，纯度≥90%。

实施例2：

以超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物原料，采用粉碎机粉碎并过200目筛后按质量体积比加入10倍的正己烷恒速搅拌1小时，正己烷抽提后的副产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过100目筛；将过筛后的副产物粉按质量体积比加入5倍体积的pH 8.5的6% NaCl溶液，均质后于25℃搅拌提取1 h，期间采用pH计监测其pH值，并用稀碱液调节pH值，使其稳定于8.5；提取后采用冷冻离心机于4℃， 10000 r/min离心15 min，取上清液；将第一次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入5倍0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于25℃搅拌提取1 h；提取后采用冷冻离心机于4℃，10000 r/min离心15 min，取上清液；第二次提取所得的上清液调节pH值至7.0后采用活性炭脱色，脱色温度25℃，脱色时间为2 h。脱色后4000 r/min离心20 min去除活性炭；将第一次提取的上清液与活性炭脱色的第二次提取液合并后以截留分子量1000 Da的透析袋在4℃透析24 h，再采用喷雾干燥后于4℃贮藏备用。以本方法提取瓜蒌子提油副产物中的蛋白质，提取率≥80%，纯度≥90%。

对比例1：

以超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物原料，采用粉碎机粉碎并过100目筛后按质量体积比加入5倍的正己烷恒速搅拌1.5小时，正己烷抽提后的副产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过100目筛；将过筛后的副产物粉按质量体积比加入10倍体积的水溶液，均质后于20℃搅拌提取1 h，提取后采用冷冻离心机于4℃，8000 r/min离心20 min，取上清液；将第一次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10倍pH 7.0的4% NaCl溶液，均质后于20℃搅拌提取1 h，期间采用pH计监测其pH值，使其稳定于7.0；提取后采用冷冻离心机于4℃，8000 r/min离心20 min，取上清液；将第二次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10倍0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于20℃搅拌提取1 h；提取后采用冷冻离心机于4℃，8000 r/min离心20 min，取上清液；将第三次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10倍70%的乙醇，均质后于20℃搅拌提取1 h；提取后采用真空抽滤取滤过液；第三次提取所得的上清液调节pH值至6.5后采用活性炭脱色，脱色温度20℃，脱色时间为1.5 h。脱色后4000 r/min离心15 min去除活性炭；将第一、二和四次提取的溶液与活性炭脱色的第三次提取液合并后以截留分子量1000 Da的透析袋在4℃透析24 h，再采用冷冻干燥后于4℃贮藏备用。以本方法提取瓜蒌子提油副产物中的蛋白质，提取率约为48%，纯度≥75%。

对比例2：

以超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物原料，采用粉碎机粉碎并过200目筛后按质量体积比加入10倍的正己烷恒速搅拌1小时，正己烷抽提后的副产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过200目筛；将过筛后的副产物粉按质量体积比加入10倍体积的pH 7.0的4% NaCl溶液，均质后于25℃搅拌提取1 h，期间采用pH计监测其pH值，并用稀碱液调节pH值，使其稳定于7.0；提取后采用冷冻离心机于4℃， 10000 r/min离心15 min，取上清液；将第一次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10倍0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于25℃搅拌提取1 h；提取后采用冷冻离心机于4℃，10000 r/min离心15 min，取上清液；第二次提取所得的上清液调节pH值至7.0后采用活性炭脱色，脱色温度25℃，脱色时间为2 h。脱色后4000 r/min离心20 min去除活性炭；将第一次提取的上清液与活性炭脱色的第二次提取液合并后以截留分子量1000 Da的透析袋在4℃透析24 h，再采用喷雾干燥后于4℃贮藏备用。以本方法提取瓜蒌子提油副产物中的蛋白质，提取率约为47%，纯度约为78%。

对比例3：

以超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物原料，采用粉碎机粉碎并过200目筛后按质量体积比加入10倍的正己烷恒速搅拌1小时，正己烷抽提后的副产物采用真空抽滤，抽滤后的滤饼自然干燥后粉碎过200目筛；将过筛后的副产物粉按质量体积比加入10倍体积的0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于25℃搅拌提取1 h；提取后采用冷冻离心机于4℃， 10000 r/min离心15 min，取上清液；将第一次提取后所得的沉淀按沉淀质量加入10倍pH 8.0的4% NaCl溶液，均质后于25℃搅拌提取1 h；提取后采用冷冻离心机于4℃，10000 r/min离心15 min，取上清液；第一次提取所得的上清液调节pH值至6.5后采用活性炭脱色，脱色温度25℃，脱色时间为2 h。脱色后4000 r/min离心20 min去除活性炭；将第二次提取的上清液与活性炭脱色的第一次提取液合并后以截留分子量1000 Da的透析袋在4℃透析24 h，再采用喷雾干燥后于4℃贮藏备用。以本方法提取瓜蒌子提油副产物中的蛋白质，提取率约为36.5%，纯度约为75.3%。

对比例1采用了传统的分步提取法，即水洗提取清蛋白，中性盐溶液提取球蛋白，碱溶液和乙醇溶液分别提取碱溶性和醇溶性蛋白，但是提取率也仅48%左右，蛋白纯度仅75%左右，说明传统的分步提取法不能达到高效提取瓜蒌子蛋白的目的；对比例2采用中性盐溶液结合碱液提取瓜蒌子蛋白，提取率也不高；对比例3中先碱提再pH 8.0的盐溶液提取，提取率更低。说明提取瓜蒌子蛋白适合采用弱碱性的盐溶液第一次提取再结合碱液二次提取才可显著提高提取率；其次，对于提取瓜蒌子蛋白来说，调节 NaCl溶液到pH8.0~8.5是达到高效提取的重要条件，这些与瓜蒌子组成蛋白的结构和性质有关。

Claims

1.一种从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（5）第二次提取：在所述沉淀中按质量体积比加入5~10倍体积的0.05~0.1 mol/L的 NaOH溶液，均质后于20℃~25℃搅拌提取1 h-2h；搅拌提取后采用冷冻离心机于0℃-4℃，8000~10000 r/min离心15 min ~20 min，取上清液b；

（7）上清液合并：将上清液a与上清液b合并；

2.根据权利要求1所述从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤（1）所用瓜蒌子提油副产物为超临界二氧化碳提油之后的瓜蒌子副产物，副产物中蛋白质含量在20%-40%，超临界二氧化碳萃取瓜蒌子油的操作温度为40℃-50℃。

3.根据权利要求1所述从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤（6）所述脱色剂为活性炭。

4.根据权利要求1所述从瓜蒌子提油副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤（8）所述干燥采用冷冻干燥或喷雾干燥。