CN103764833A - 糖的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种糖的制造方法，其能够利用含有纤维素的原料效率良好地制造糖，并且生产率优异。本发明的糖的制造方法具有下述工序(1)和工序(2)。工序(1)：在碱性化合物的存在下，对含有纤维素的原料在相对于该含有纤维素的原料的干燥重量而言的水分量为40质量％以下的条件下进行粉碎处理，从而得到含有纤维素的粉碎物的工序。工序(2)：利用酶对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物进行糖化处理的工序。

Description

糖的制造方法

技术领域

本发明涉及糖的制造方法。

背景技术

近年来，考虑到对环境问题的配合等，而进行了如下尝试：利用含有纤维素的生物质(biomass)材料来制造糖，并利用发酵法等将其转化为乙醇或乳酸等。在利用纤维素酶等酶对含有纤维素的生物质材料进行处理、使该纤维素糖化而制造糖的方法中，作为其前处理工序，进行使该纤维素的晶体结构发生非晶化的处理是有用的。例如，作为前处理工序，公开了使用氯化锂／二甲基乙酰胺等纤维素溶剂来使纤维素发生非晶化的前处理工序(专利文献1)。

另一方面，作为纤维素的糖化方法，已知：使用特定的纤维素酶的方法(专利文献2)；使用过氧化氢对纤维素或半纤维素进行热水处理后进行酶处理的方法(专利文献3和4)等。

作为利用含有纤维素的原料来制造糖的方法，已知以下方法：利用填充有棒(rod)的振动磨机对含有纤维素的原料进行处理，制备出降低了纤维素I型结晶度的非晶化纤维素，然后使纤维素酶和／或半纤维素酶作用于该非晶化纤维素而进行糖化(专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006223152号公报

专利文献2：日本特开2003—135052号公报

专利文献3：日本特开2007—74992号公报

专利文献4：日本特开2007—74993号公报

专利文献5：日本特开2009—171951号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，专利文献1～4中记载的方法在糖化效率、生产率上并不令人满意。专利文献5中记载的方法虽然能够达成优异的糖化效率，但是要求使糖化效率进一步提高。

本发明的课题在于，提供一种糖的制造方法，其能够利用含有纤维素的原料效率良好地制造糖，并且生产率优异。

用于解决课题的手段

本发明人等发现：在碱性化合物的存在下且水分量为一定量以下的条件下，对含有纤维素的原料进行粉碎处理，从而可以解决上述课题。

即，本发明提供一种糖的制造方法，其具有下述工序(1)和工序(2)。

工序(1)：在碱性化合物的存在下，对含有纤维素的原料在相对于该含有纤维素的原料的干燥重量而言的水分量为40质量％以下的条件下进行粉碎处理，从而得到含有纤维素的粉碎物的工序。

工序(2)：利用酶对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物进行糖化处理的工序。

发明的效果

根据本发明的糖的制造方法，在特定条件下对含有纤维素的原料进行粉碎处理后进行酶处理，由此可提高借助该酶处理的纤维素的糖化效率，从而可以利用含有纤维素的原料效率良好地制造糖。

具体实施方式

[糖的制造方法]

本发明的糖的制造方法具有下述工序(1)和工序(2)。

工序(1)：在碱性化合物的存在下，对含有纤维素的原料在相对于该含有纤维素的原料的干燥重量而言的水分量为40质量％以下的条件下进行粉碎处理，从而得到含有纤维素的粉碎物的工序。

工序(2)：利用酶对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物进行糖化处理的工序。

<工序(1)>

工序(1)是在碱性化合物的存在下对含有纤维素的原料在相对于该含有纤维素的原料的干燥重量而言的水分量为40质量％以下的条件下进行粉碎处理而得到含有纤维素的粉碎物的工序。

在工序(1)中，在水分量为规定量以下的条件下将含有纤维素的原料(以下有时称为“原料纤维素”。)与碱性化合物一起粉碎，由此可以使碱性化合物均匀地分散于该含有纤维素的原料中。此外，通过在水分量为规定量以下的条件下进行粉碎处理，从而可以对含有纤维素的原料有效地进行粉碎。其结果，可以使纤维素非晶化、小粒径化，并且可以进一步利用碱性化合物的作用而使其脱木质素化、脱半纤维素化。

(含有纤维素的原料)

含有纤维素的原料的种类并无特别限制，可列举：从落叶松、沼杉等针叶树，油棕、扁柏等阔叶树所得到的各种木材；利用木材所制造的木浆、利用棉籽周围的纤维所得到的棉籽绒浆等浆类；报纸、瓦楞纸板、杂志、高级纸等纸类；蔗渣(甘蔗的压榨后的渣滓)、棕榈空果穗(EFB)、稻草、玉米茎等植物茎／叶／果穗类；谷壳、棕榈壳、椰子壳等植物壳类；藻类等。

在上述原料中，从提高糖化效率的观点、获得容易性和原料成本的观点出发，优选为选自浆类、纸类、从针叶树或阔叶树所得到的木材、以及植物茎类、植物叶类、植物果穗类、藻类中的1种以上，更优选为选自木材、植物茎类、植物叶类和植物果穗类中的1种以上，进一步优选为选自蔗渣、EFB、油棕(树干部)中的1种以上，更进一步优选为蔗渣。

在本发明所使用的含有纤维素的原料中，综纤维素含量优选为20质量％以上、更优选为40质量％以上、进一步优选为45质量％以上、更进一步优选为50质量％以上。另外，在本发明中，综纤维素的含量是指纤维素和半纤维素的总含量。

从提高粉碎效率和降低结晶度等观点出发，含有纤维素的原料中的水分量相对于原料纤维素的干燥重量为40质量％以下、优选为35质量％以下、更优选为30质量％以下。水分量的下限相对于原料纤维素为0质量％，但由于难以使含有纤维素的原料中的水分量为0质量％，因此该水分量相对于原料纤维素的干燥重量优选为0.01质量％以上、更优选为0.1质量％以上、进一步优选为1质量％以上。此外，该水分量相对于原料纤维素的干燥重量优选为0.01～40质量％、更优选为0.1～35质量％、进一步优选为1～30质量％。

另外，在含有纤维素的原料中的水分量超过40质量％时，可以利用公知的方法使该含有纤维素的原料干燥(以下，有时称为“干燥处理”。)，从而将其水分量调整为相对于含有纤维素的原料的干燥重量为40质量％以下，然后再加以使用。

含有纤维素的原料中的水分量可以使用市售的红外线水分计等来测定，具体而言，可以利用实施例中记载的方法来测定。

(碱性化合物)

作为在工序(1)中所使用的碱性化合物，优选无机碱性化合物，可列举选自碱金属或碱土金属的氢氧化物、氧化物及硫化物中的1种以上无机碱性化合物。

作为碱金属或碱土金属的氢氧化物，可列举氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等。此外，作为碱金属或碱土金属的氧化物，可列举氧化钠、氧化钾、氧化镁、氧化钙等；作为碱金属或碱土金属的硫化物，可列举硫化钠、硫化钾、硫化镁、硫化钙等。

在上述的碱性化合物中，更优选使用碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，进一步优选使用碱金属氢氧化物，更进一步优选使用氢氧化钠或氢氧化钾。这些碱性化合物可以单独使用或者组合使用两种以上。

在将含有纤维素的原料中的综纤维素全部假定为纤维素的情况下，相对于构成该纤维素的脱水葡萄糖单元(以下，有时称为“AGU”。)，工序(1)中所使用的碱性化合物的量优选为0.01倍摩尔以上、更优选为0.05倍摩尔以上、进一步优选为0.1倍摩尔以上；并且优选为10倍摩尔以下、更优选为8倍摩尔以下、进一步优选为5倍摩尔以下、更进一步优选为1.5倍摩尔以下。此外，相对于构成含有纤维素的原料中的综纤维素的脱水葡萄糖单元，该碱性化合物的量优选为0.01～10倍摩尔、更优选为0.05～8倍摩尔、进一步优选为0.1～5倍摩尔、更进一步优选为0.1～1.5倍摩尔。若碱性化合物的使用量为0.01倍摩尔以上，则在后述的工序(2)中糖化效率提高。此外，若该使用量为10倍摩尔以下，则从碱性化合物的中和和／或洗涤容易性的观点、以及碱性化合物的成本的观点出发是优选的。

向含有纤维素的原料中添加碱性化合物的方法并无特别限定，可以在含有纤维素的原料中一次性添加碱性化合物，也可以分次添加该碱性化合物。在一次性添加碱性化合物时，从使该碱性化合物均匀地分散于含有纤维素的原料中的观点出发，优选：在将碱性化合物添加于含有纤维素的原料后进行搅拌混合，或者一边搅拌含有纤维素的原料一边添加碱性化合物而进行混合。

碱性化合物的添加可以在进行后述的粉碎处理的装置中进行，也可以在另一进行搅拌和混合的装置中进行。

上述进行搅拌和混合的装置只要是能够将碱性化合物分散于原料纤维素中的装置，则并无特别限定。例如可列举：螺条式混合机、桨叶式混合机、圆锥行星螺杆型混合机、在粉体、高粘度物质、树脂等的混炼中使用的捏合机等混合机。其中，更优选水平轴型桨叶式混合机，具体而言，进一步优选具有切碎机叶片的水平轴型桨叶式混合机即Lodige Mixer(中央机工株式会社制造；使用特征性的犁状铲的混合机，能够设置切碎机叶片)、犁铧式混合机(Ploughshare Mixer)(太平洋机工株式会社制造；具有借助单独形状的铲翼的浮游式扩散混合和借助多段式切碎机叶片的高速剪切分散这两个功能的混合机)。

在添加碱性化合物时的形态并无特别限制，从粉碎效率的观点出发，优选在原料纤维素中以固体状态添加碱性化合物。在以固体状态添加碱性化合物时，从制造时的处置性的观点、以及使碱性化合物均匀地分散于含有纤维素的原料中的观点出发，碱性化合物优选为丸状、粒状或粉末状。另外，碱性化合物为固体状态并不是指不含有水分，而是也可以因空气中的水分的吸湿等而含有水分。

(水分量)

工序(1)在相对于原料纤维素的干燥重量而言的水分量为40质量％以下的条件下进行。若该水分量相对于原料纤维素的干燥重量为40质量％以下，则会提高含有纤维素的原料的粉碎效率、以及含有纤维素的原料与碱性化合物的混合、渗透、扩散性，会效率良好地进行工序(2)的糖化处理。水分量的下限为0质量％。

从降低纤维素的结晶度、提高生产率和糖化效率的观点出发，工序(1)中的水分量相对于原料纤维素的干燥重量优选为0.1质量％以上、更优选为0.5质量％以上、进一步优选为1质量％以上、更进一步优选为5质量％以上、更进一步优选为7质量％以上，并且优选为35质量％以下、更优选为30质量％以下、进一步优选为25质量％以下、更进一步优选为20质量％以下、更进一步优选为15质量％以下。此外，工序(1)中的水分量相对于原料纤维素的干燥重量优选为0.1～35质量％、更优选为0.5～35质量％、进一步优选为1～30质量％、更进一步优选为1～25质量％、更进一步优选为5～25质量％、更进一步优选为7～20质量％、更进一步优选为7～15质量％。

工序(1)的粉碎处理时的水分量是指相对于原料纤维素的干燥重量而言的水分量，可以通过干燥处理等来降低原料纤维素以及碱性化合物中所含的水分量，或者可以通过在粉碎处理时添加水等来调整为规定的水分量。

(含氮化合物)

此外，从提高糖化效率的观点出发，优选在含氮化合物的存在下进行工序(1)或后述的工序(2)、以及在含氮化合物的存在下进行工序(1)和工序(2)。通过使用含氮化合物而提高糖化效率的理由尚不明确，但可推测其原因在于进行了含有纤维素的原料的小粒径化、纤维素的低分子量化、比表面积的增加、非晶化及木质素等夹杂物的除去。

在本发明的制造方法中，从进一步提高糖化效率的观点出发，优选在含氮化合物的存在下进行工序(1)。

在本发明中，“含氮化合物”是指在工序(1)中除了用作上述碱性化合物的化合物以外的、含有1个以上氮原子的化合物。作为含氮化合物，可列举选自氨、胺、氨或胺与酸的加成盐、以及季铵盐中的1种以上的含氮化合物。

作为上述胺，可列举：甲胺、丁胺、2一乙基己胺、月桂胺、硬脂胺等伯胺；二甲胺、二丁胺、二辛胺、二硬脂胺等仲胺；三甲胺、三乙胺、月桂基二甲胺、二硬脂基甲胺等叔胺；吡咯烷、哌啶、吗啉等环状胺，乙二胺、六亚甲基二胺、二亚乙基三胺、哌嗪等多元胺；乙醇胺、三乙醇胺、2一氨基一2一甲基丙醇、三羟甲基氨基甲烷等羟胺。

此外，还可列举：吡啶、吡咯、喹啉、咪唑等芳香族胺；胍、脒等。

作为形成与上述氨或胺的加成盐的酸，可列举：盐酸、磷酸、硫酸等无机酸；醋酸、丙酸、月桂酸、硬脂酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、己二酸、富马酸、柠檬酸等有机酸。水也可以作为酸的一种来与氨相作用，从而可生成羟铵。

作为氨或胺与酸的加成盐，可优选列举：辛基氯化铵、月桂基氯化铵、鲸蜡基氯化吡啶等伯铵盐、仲铵盐、叔铵盐；氯化铵、羟铵等无机铵盐。其中，从提高糖化效率的观点、以及提高纤维素原料的粉碎效率的观点出发，优选具有烷基的伯铵盐、具有烷基的仲铵盐、具有烷基的叔铵盐、和无机铵盐，更优选无机铵盐，进一步优选氯化铵。

另外，从提高糖化效率的观点出发，上述烷基优选为碳数1以上、更优选为碳数6以上。此外，优选为碳数30以下、更优选为碳数22以下。此外，从提高糖化效率的观点出发，上述烷基优选为碳数1～30、更优选为碳数6～22。

作为上述季铵盐，可列举：四甲基氯化铵、四丙基氯化铵、四丁基羟铵、辛基三甲基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、辛基二甲基苄基氯化铵、二甲基二烯丙基氯化铵、烷基苄基二甲基氯化铵、氯化胆碱等。其中，从提高糖化效率的观点、以及提高粉碎效率的观点出发，优选月桂基三甲基氯化铵、烷基苄基二甲基氯化铵、四甲基氯化铵、和二甲基二烯丙基氯化铵。

此外，本发明中使用的含氮化合物可以为聚合物。作为该聚合物，可列举：具有胺部位的聚合物、具有胺部位的聚合物与酸的加成盐、以及具有季铵盐部位的聚合物。“胺部位”中的氮原子可以是伯氮原子、仲氮原子、叔氮原子中的任一种。此外，“具有胺部位的聚合物与酸的加成盐”是指具有至少一个在上述胺部位加成上述酸而成的结构的聚合物。

作为上述聚合物的具体例，可列举：二烯丙基二甲基氯化铵聚合物、二烯丙基甲基胺盐酸盐-二氧化硫共聚物等烯丙基胺聚合物；二甲基氨基乙基(甲基)丙烯酸酯聚合物、三甲基铵基乙基(甲基)丙烯酸酯聚合物等(甲基)丙烯酸酯聚合物；聚(4一乙烯基吡啶)、乙烯基甲基氯化咪唑啉等芳香族胺聚合物；聚乙烯亚胺等。其中，从提高糖化效率的观点、以及提高粉碎效率的观点出发，优选为选自二甲基二烯丙基氯化铵聚合物和二烯丙基胺盐酸盐-二氧化硫共聚物中的1种以上。另外，这些聚合物可以单独使用或者组合使用两种以上。

从提高糖化效率的观点出发，上述聚合物的重均分子量(Mw)优选为100,000以下、更优选为1,000～50,000。另外，上述聚合物的重均分子量是利用实施例中记载的方法所测得的值。

基于以上情况，从提高糖化效率的观点、以及提高粉碎效率的观点出发，作为含氮化合物，优选为选自具有烷基的伯铵盐、具有烷基的仲铵盐、具有烷基的叔铵盐、无机铵盐、季铵盐、具有胺部位的聚合物、具有胺部位的聚合物与酸的加成盐、以及具有季铵盐部位的聚合物中的1种以上，更优选为选自氯化铵、四甲基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、烷基苄基二甲基氯化铵、二甲基二烯丙基氯化铵、二甲基二烯丙基氯化铵的聚合物、以及二烯丙基胺盐酸盐-二氧化硫共聚物中的1种以上。

在将含有纤维素的原料中的综纤维素全部假定为纤维素的情况下，相对于构成该纤维素的脱水葡萄糖单元(AGU)，工序(1)或工序(2)中的含氮化合物的使用量以氮原子换算计优选为0.001倍摩尔以上、更优选为0.002倍摩尔以上、进一步优选为0.005倍摩尔以上。此外，优选为1倍摩尔以下、更优选为0.5倍摩尔以下、进一步优选为0.3倍摩尔以下、更进一步优选为0.2倍摩尔以下。此外，工序(1)或工序(2)中的含氮化合物的使用量以氮原子换算计优选为0.001～1倍摩尔、更优选为0.002～0.5倍摩尔、进一步优选为0.005～0.3倍摩尔、更进一步优选为0.005～0.2倍摩尔。若含氮化合物的使用量为0.001倍摩尔以上，则糖化效率会提高。此外，若该使用量为10倍摩尔以下，则从提高纤维素原料的粉碎效率的观点出发是优选的。

另外，在本发明中，当在含氮化合物的存在下进行工序(1)和工序(2)两者时，上述的含氮化合物的使用量是指工序(1)和工序(2)中的含氮化合物的总使用量。

在工序(1)或工序(2)中，添加含氮化合物时的形态并无特别限制，从粉碎效率的观点、制造时的处置性的观点、以及使含氮化合物均匀地分散的观点出发，优选在含有纤维素的原料中或纤维素粉碎物中以固体、液体或水溶液的状态添加含氮化合物。

含氮化合物的添加方法并无特别限定，可以与工序(1)中使用的碱性化合物或工序(2)中使用的酶同时添加，也可以分别添加。此外，可以一次性添加含氮化合物，也可以分次添加含氮化合物。在一次性添加的情况下，从使含氮化合物均匀地分散于含有纤维素的原料中或纤维素粉碎物中的观点出发，优选在含有纤维素的原料中或纤维素粉碎物中添加含氮化合物后进行搅拌混合、或者边搅拌边添加含氮化合物而进行混合。

(粉碎处理)

粉碎处理是使含有纤维素的原料小粒径化，且使碱性化合物、或者碱性化合物和含氮化合物尽可能均匀地分散于该含有纤维素的原料中的操作。在使用固体状态的碱性化合物的情况下，还利用粉碎处理同时进行碱性化合物的粉末化。

粉碎处理可以使用公知的粉碎机来进行。所使用的粉碎机并无特别限制，只要是能够使含有纤维素的原料小粒子化，并且能够使碱性化合物、或者碱性化合物和含氮化合物尽可能地分散于含有纤维素的原料中的装置即可。

作为粉碎机的具体例，可列举：高压压缩辊磨机、辊旋转磨机等辊磨机；环辊式磨机、滚柱轴承环磨机(roller race mill)或球跑轨磨(ball racemill)等立式辊磨机(vertical roller mills)；滚筒球磨机(rolling ball mill)、振动球磨机、振动棒磨机、振动管磨机、行星式球磨机或者离心流动化磨机等容器驱动介质磨机；塔式粉碎机、搅拌槽式磨机、流通槽式磨机或者环形磨机等介质搅拌式磨机；高速离心辊磨机、角轧机(angmill)等压密剪切磨机；乳钵、石磨、胶体磨(Masscolloider)、摩擦粉碎机(Fret mill)、轮碾机(edge runner mill)、切碎机(knife mill)、针磨机(pin mill)、绞磨机(cutter mill)等。其中，从含有纤维素的原料的粉碎效率和生产率的观点出发，优选为容器驱动式介质磨机或介质搅拌式磨机，更优选为容器驱动式介质磨机，进一步优选为选自振动球磨机、振动棒磨机和振动管磨机中的振动磨机，更进一步优选为振动棒磨机。

作为粉碎方法，可以是间歇式、连续式中的任一种。

作为粉碎中使用的装置和介质的材质，并无特别的限制，例如可列举铁、不锈钢、氧化铝、氧化锆、碳化硅、氮化硅、玻璃等，从纤维素的结晶度降低效率的观点出发，优选为铁、不锈钢、氧化锆、碳化硅、氮化硅，进而从工业上的利用的观点出发，优选为铁或不锈钢。

在所使用的装置为振动磨机且介质为棒的情况下，从含有纤维素的原料的粉碎效率的观点出发，棒的外径优选为0.1mm以上、更优选为0.5mm以上，并且优选为100mm以下、更优选为50mm以下。此外，从含有纤维素的原料的粉碎效率的观点出发，棒的外径优选为0.1～100mm、更优选为0.5～50mm的范围。若棒的大小在上述的范围，则可以有效地使含有纤维素的原料小粒子化，并且使得棒的碎片等混入而污染纤维素的风险变小。

根据振动磨机的机种不同，棒的填充率的优选范围也不同，棒的填充率优选为10％以上、更优选为15％以上，并且优选为97％以下、更优选为95％以下、进一步优选为90％以下、更进一步优选为80％以下。此外，棒的填充率优选为10～97％、更优选为10～95％、进一步优选为15～90％、更进一步优选为15～80％。若填充率在该范围内，则纤维素与棒的接触频率提高，并且可以在不妨碍介质的运动的情况下提高原料纤维素的粉碎效率。在此，填充率是指相对于振动磨机的搅拌部的容积而言的棒的表观体积。

粉碎处理时的温度并无特别限定，从操作成本和抑制原料纤维素的劣化的观点出发，优选为一100℃以上、更优选为0℃以上、进一步优选为5℃以上，并且优选为200℃以下、更优选为150℃以下、进一步优选为100℃以下。此外，从与上述同样的观点出发，优选为一100～200℃、更优选为0～150℃、进一步优选为5～100℃。

粉碎时间只要按照使粉碎后的含有纤维素的原料发生小粒子化的方式进行适当调整即可。粉碎时间根据所使用的粉碎机、所使用的能量等而发生变化，通常为1分钟～12小时，从降低含有纤维素的原料的粒径的观点、以及能源成本的观点出发，优选为2分钟以上、更优选为5分钟以上，并且优选为6小时以下、更优选为3小时以下、进一步优选为2小时以下。此外，从与上述同样的观点出发，优选为2分钟～6小时、更优选为5分钟～3小时、进一步优选为5分钟～2小时。

通过按照以上方式进行工序(1)，从而得到含有纤维素的粉碎物。

(熟化工序)

此外，在进行工序(1)后，从进一步促进借助碱性化合物的作用而引起的木质素或半纤维素的键的水解、即木质素的脱离、半纤维素的脱离而提高糖化效率的观点出发，优选的是：在工序(2)之前、优选在进行后述的中和工序和洗涤工序的情况下为在中和工序和洗涤工序之前，具有如下工序：对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物在相对于该含有纤维素的粉碎物而言的水分量为50～10000质量％的条件下进行熟化的工序(以下，有时称为“熟化工序”。)。可认为：通过将含有碱性化合物的含纤维素的粉碎物在规定的水分条件下进行熟化，从而促进借助碱性化合物的作用所引起的木质素的脱离、半纤维素的脱离，从而进一步提高糖化效率。

在本发明的制造方法中，熟化工序可以通过例如如下方式来进行：在工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物中添加水并混合，一边根据需要进行加热，一边在一定时间的期间内进行搅拌或静置。

从使水均匀地分散于含有纤维素的粉碎物中的观点出发，优选的是：在将水添加于含有纤维素的粉碎物中后进行搅拌混合，或者一边搅拌含有纤维素的粉碎物一边添加水并进行混合。

水的添加方法并无特别限定，可以一次性添加，也可以分次添加。

从进一步促进借助碱性化合物的作用所引起的木质素或半纤维素的键的水解、即木质素的脱离、半纤维素的脱离而提高糖化效率的观点出发，熟化工序中的水分量相对于含有纤维素的粉碎物优选为50质量％以上、更优选为100质量％以上、进一步优选为200质量％以上、更进一步优选为230质量％以上，并且从制造成本的减少的观点出发，优选为10000质量％以下、更优选为8000质量％以下、进一步优选为5000质量％以下、更进一步优选为4000质量％以下、更进一步优选为3500质量％以下。此外，从上述观点出发，熟化工序中的水分量相对于含有纤维素的粉碎物优选为50～10000质量％、更优选为100～8000质量％、进一步优选为200～5000质量％、更进一步优选为230～3500质量％。

另外，相对于含有纤维素的粉碎物的水分量，是指相对于从含有纤维素的粉碎物中除去碱性化合物后的干燥原料的质量％。

进行熟化的装置并无特别的限定。作为其具体例，可列举在上述碱性化合物的搅拌和混合中所使用的装置。

从促进木质素和半纤维素的脱离而提高糖化效率的观点出发，熟化温度优选为0℃以上、更优选为20℃以上、进一步优选为50℃以上、更进一步优选为80℃以上，从抑制来自半纤维素的成分的过度分解、以及降低制造成本的观点出发，优选为250℃以下、更优选为200℃以下、进一步优选为150℃以下、更进一步优选为100℃以下。

从与上述同样的观点出发，熟化温度优选为0℃以上且250℃以下、更优选为20℃以上且200℃以下、进一步优选为50℃以上且150℃以下、更进一步优选为80℃以上且100℃以下。此外，从简化制造设备、降低制造成本的观点出发，优选为0～100℃、更优选为20～100℃、进一步优选为50～100℃、更进一步优选为80～100℃。

另外，可以在熟化工序时进行使剩余的水分蒸发的操作以使得供于后述的工序(2)的溶液中的含有纤维素的粉碎物达到适当的浓度。例如可列举出通过在熟化时使其成为开放体系而同时进行水分的蒸发的方法等。

从促进木质素和半纤维素的脱离而提高糖化效率的观点出发，熟化时间优选为0.01小时以上、更优选为0.1小时以上、进一步优选为0.5小时以上、更进一步优选为1小时以上，从抑制来自半纤维素的成分的过度分解、以及降低制造成本的观点出发，优选为24小时以下、更优选为18小时以下、进一步优选为12小时以下、更进一步优选为6小时以下。从上述观点出发，熟化时间优选为0.01～24小时、更优选为0.1～18小时、进一步优选为0.5～12小时、更进一步优选为1～6小时。

此外，为了除去在工序(1)中使用的碱性化合物、含氮化合物、含有纤维素的原料中所含的夹杂物，而在工序(2)之前、且在进行熟化工序的情况下为优选在该熟化工序之后，具有以下所示的中和工序、洗涤工序。

(中和工序)

在本发明的制造方法中，从提高后述的工序(2)中的糖化效率的观点出发，优选在工序(2)之前具有如下工序：用酸对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物进行中和的工序(以下，有时将其称为“中和工序”)。

作为所使用的酸，可列举：盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸等无机酸；醋酸、柠檬酸等有机酸，从提高生产率、糖化效率以及糖的收率的观点出发，更优选使用选自盐酸、醋酸、硫酸、硝酸和磷酸中的1种以上，进一步优选使用选自盐酸、醋酸和硫酸中的1种以上。

此外，在使用盐酸、硫酸等无机酸的情况下，对于在中和工序中所生成的盐的糖化反应的不良影响少，因此，从提高糖的收率的观点出发，也进一步更优选。

中和工序可以通过在含有纤维素的粉碎物中添加适量的酸并进行搅拌来进行。中和工序可以通过例如如下方式来进行：将含有纤维素的粉碎物按照其浓度达到0.1～50质量％的方式分散在水中后，一边注意因中和热所致的过度的发热，一边适量添加0.01～37％的盐酸、0.01～75％的硫酸等酸直至pH达到中性附近、优选达到pH4～8、更优选达到pH4～7为止。此时，优选适度地搅拌悬浮液而使其均匀化。

(洗涤工序)

从除去工序(1)所使用的碱性化合物、含氮化合物、含有纤维素的原料中所含的夹杂物，提高工序(2)中的糖化效率的观点出发，在工序(2)之前可以具有将工序(1)中得到的含有纤维素的粉碎物用水进行洗涤的工序(以下，有时将其称为“洗涤工序”)。

含有纤维素的粉碎物的洗涤可以通过例如如下方法等来进行：将含有纤维素的粉碎物按照其浓度达到0.1～50％的方式分散在离子交换水中，利用离心分离器使固体成分沉淀并分离，使其按照达到相同程度的浓度的方式再次分散在离子交换水中，通过重复洗涤，将进行离心分离的这一操作进行至pH达到中性附近、优选达到pH4～8、更优选达到pH4～7为止。

对于上述中和工序和洗涤工序而言，可以仅进行其中的任一个工序，也可以在进行中和工序后再进行洗涤工序。此外，从提高工序(2)中所得的糖的收率的观点出发，还可以仅进行使用了无机酸的中和工序。

<工序(2)>

工序(2)是利用酶对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物进行糖化处理的工序。

由于工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物被非晶化、小粒径化，以及脱木质素化、脱半纤维素化，因而通过利用酶对其进行处理，可以效率良好地得到葡萄糖或木糖这样的单糖，纤维二糖、纤维三糖、木二糖(xylobiose)、木三糖(xylotriose)这样的低聚糖等的混合物。若考虑到在糖化处理后用于乙醇发酵、乳酸发酵中的情况等，则优选分解至单糖。

从提高糖化效率的观点出发，作为在工序(2)中使用的酶，可列举纤维素酶、半纤维素酶。

在此，纤维素酶是指使纤维素的β—1，4—葡聚糖的糖苷键发生水解的酶，其是被称作葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶或纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶等的酶的总称。此外，半纤维素酶是指使半纤维素发生水解的酶，其是被称作木聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)等的酶的总称。作为本发明中使用的纤维素酶、半纤维素酶，包括：市售的纤维素酶制剂，来自动物、植物、微生物的纤维素酶、半纤维素酶。

作为纤维素酶的具体例，可列举：Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)等来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶制剂，来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-N145(FERM P-19727)株的纤维素酶、或者来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-N252(FERM P-17474)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-N115(FERM P-19726)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-N440(FERM P-19728)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-N659(FERMP-19730)等各菌株的纤维素酶，以及来自绿色木霉(Trichoderma viride)、棘孢曲霉(Aspergillus acleatus)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、耐热梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium)、约休梭状芽孢杆菌(Clostridium josui)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、纤维素分解酶(Acremonium celluloriticus)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶混合物，来自极端嗜热球古菌(Pyrococcus horikoshii)的耐热件纤维素酶等。其中，从提高糖化效率的观点出发，优选来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、或特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶。

作为市售的纤维素酶制剂，例如可列举：Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)、TP60(明治制果株式会社制造、商品名)、CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)、Accellerase DUET(Genencor制、商品名)、或者Ultra Pro L(Novozymes公司制造、商品名)。其中，从提高糖化效率的观点出发，优选Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)、CellicCTec(Novozymes公司制造、商品名)、CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)，更优选CellicCTec(Novozymes公司制造、商品名)、CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)，进一步优选为CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)。

此外，作为纤维素酶的1种的β-葡糖苷酶的具体例，可列举：来自黑曲霉(Aspergillus niger)的β-葡糖苷酶(例如Novozyme188(Novozymes公司制造、商品名)、Megazyme公司制造的β-葡糖苷酶)、来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、青霉菌(Penicillium emersonii)的β-葡糖苷酶等。

此外，作为半纤维素酶的具体例，可列举：市售的半纤维素酶制剂；来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-N546(FERM P-19729)的木聚糖酶；除此之外还可列举：来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)、特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜碱芽胞杆菌(Bacillus alcalophilus)的木聚糖酶；以及来自嗜热真菌属(Thermomyces)、短梗霉属(Aureobasidium)、链霉菌属(Streptomyces)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、栖热袍菌属(Thermotoga)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、カルドセラム(Caldocellum)、高温单孢菌属(Thermomonospora)的木聚糖酶等。

作为市售的半纤维素酶制剂，例如可列举：CellicHTec(Novozymes公司制造、商品名)、CellicHTec2(Novozymes公司制造、商品名)、蔗糖酶(三菱化学食品株式会社制造、商品名)、Shearzyme500L(Novozymes公司制造、商品名)。其中，从提高糖化效率的观点出发，优选CellicHTec或CellicHTec2。

从提高糖化效率的观点出发，工序(2)中使用的酶优选为选自上述纤维素酶和半纤维素酶中的1种以上。

此外，工序(2)中使用的酶优选包含作为纤维素酶的1种的葡聚糖内切酶。从纤维素的糖化效率的观点出发，作为本发明中使用的葡聚糖内切酶，优选为选自来自木霉属(Trichoderma)的葡聚糖内切酶I(EGI)、和葡聚糖内切酶II(EGII)中的1种以上，这些酶可以通过异种宿主来表达。就通过异种宿主来表达的制备法而言，并无特别限制，可列举例如实施例记载的方法。

此外，本发明中使用的葡聚糖内切酶可以使用市售的纤维素酶制剂、对来自动物、植物、微生物的纤维素酶进行提纯后的制品。对于提纯方法，并无特别限制，可列举例如实施例记载的方法。作为提纯对象的纤维素酶，可列举例如上述的纤维素酶。在上述的纤维素酶中，优选使用来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)或特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶，例如Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)、TP一60(明治制果株式会社制造、商品名)、或Ultra ProL(Novozymes公司制造、商品名)。

从提高糖化效率和增加葡萄糖生成量的观点出发，工序(2)中使用的酶中的葡聚糖内切酶的配合比例在酶中的总蛋白量中优选为10质量％以上、更优选为14质量％以上、进一步优选为16质量％以上、更进一步优选为18质量％以上、更进一步优选为20质量％以上，并且优选为90质量％以下、更优选为75质量％以下、进一步优选为70质量％以下、更进一步优选为60质量％以下、更进一步优选为50质量％以下。此外，工序(2)中使用的酶中的葡聚糖内切酶的配合比例在酶中的总蛋白量中优选为10～90质量％、更优选为14～75质量％、进一步优选为16～70质量％、更进一步优选为18～60质量％、更进一步优选为20～50质量％。另外，葡聚糖内切酶的配合比例可以利用实施例中记载的方法来进行调整。

从进一步提高糖化效率的观点出发，工序(2)中使用的酶优选含有作为半纤维素酶的1种的木聚糖酶。作为工序(2)中使用的优选的木聚糖酶的具体例，可列举CellicHTec(Novozymes公司制造、商品名)、CellicHTec2(Novozymes公司制造、商品名)。

从提高糖化效率和增加还原糖量的观点出发，工序(2)中使用的酶中的木聚糖酶的配合比例在酶中的总蛋白量中优选为2质量％以上、更优选为3质量％以上、进一步优选为4质量％以上、更进一步优选为5质量％以上、更进一步优选为6质量％以上，并且优选为75质量％以下、更优选为50质量％以下、进一步优选为40质量％以下、更进一步优选为25质量％以下、更进一步优选为20质量％以下、更进一步优选为16质量％以下。此外，工序(2)中使用的酶中的木聚糖酶的配合比例在酶中的总蛋白量中优选为2～75质量％、更优选为2～50质量％、更优选为3～40质量％、进一步优选为4～25质量％、更进一步优选为5～20质量％、更进一步优选为6～16质量％。另外，木聚糖酶的配合比例可以利用实施例中记载的方法来进行调整。

在工序(2)中，利用酶对含有纤维素的粉碎物进行糖化处理时的处理条件可以根据该粉碎物中的纤维素的结晶度、所使用的酶的种类来进行适当选择。

例如，在以纤维素原料为基质的情况下，对于0.5～40％(w/v)、优选0.5～20％(w／v)的基质悬浮液，按照酶蛋白量相对于基质为0.04～600质量％或0.001～15％(v／v)的方式添加酶，在pH2～10的缓冲液中、在反应温度10～90℃下，使之以30分钟～5天、优选0.5～3天的反应时间进行反应，由此可以制造糖。

上述缓冲液的pH优选根据所使用的酶的种类进行适当选择，优选为pH3～7、更优选为pH4～6。此外，上述反应温度优选根据所使用的酶的种类进行适当选择，优选为20～70℃、更优选为40～60℃。

关于上述实施方式，本发明公开了以下的制造方法。

<1>一种糖的制造方法，其具有下述工序(1)和工序(2)。

工序(1)：在碱性化合物的存在下，对含有纤维素的原料在以下条件下进行粉碎处理，从而得到含有纤维素的粉碎物的工序，所述条件为：相对于该含有纤维素的原料的干燥重量而言的水分量为40质量％以下、优选为35质量％以下、更优选为30质量％以下、进一步优选为25质量％以下、更进一步优选为20质量％以下、更进一步优选为15质量％以下，且优选为0.1质量％以上、更优选为0.5质量％以上、进一步优选为1质量％以上、更进一步优选为5质量％以上、更进一步优选为7质量％以上，优选为0.1～35质量％、更优选为0.5～35质量％、进一步优选为1～30质量％、更进一步优选为1～25质量％、更进一步优选为5～25质量％、更进一步优选为7～20质量％、更进一步优选为7～15质量％。

工序(2)：利用酶对通过工序(1)所得的含有纤维素的粉碎物进行糖化处理的工序。

<2>根据上述<1>所述的糖的制造方法，其中，以固体状态添加碱性化合物。

<3>根据上述<1>或<2>所述的糖的制造方法，其中，相对于构成含有纤维素的原料中的综纤维素的脱水葡萄糖单元，碱性化合物的量为0.01倍摩尔以上、优选为0.05倍摩尔以上、更优选为0.1倍摩尔以上，且优选为10倍摩尔以下、更优选为8倍摩尔以下、更优选为5倍摩尔以下、进一步优选为1.5倍摩尔以下，并且为0.01～10倍摩尔、优选为0.05～8倍摩尔、更优选为0.1～5倍摩尔、进一步优选为0.1～1.5倍摩尔。

<4>根据上述<1>～<3>中任一项所述的糖的制造方法，其中，在工序(2)之前具有利用酸对通过工序(1)所得的含有纤维素的粉碎物进行中和的工序。

<5>根据上述<4>所述的糖的制造方法，其中，酸为无机酸或有机酸，优选为选自盐酸、醋酸、硫酸、硝酸和磷酸中的1种以上，更优选为选自盐酸、醋酸和硫酸中的1种以上。

<6>根据上述<4>或<5>所述的糖的制造方法，其中，酸为无机酸。

<7>根据上述<1>～<6>中任一项所述的糖的制造方法，其中，酶为选自纤维素酶和半纤维素酶中的1种以上。

<8>根据上述<1>～<7>中任一项所述的糖的制造方法，其中，酶包含葡聚糖内切酶，该葡聚糖内切酶的配合比例在酶中的总蛋白量中为10质量％以上、优选为14质量％以上、更优选为16质量％以上、进一步优选为18质量％以上、更进一步优选为20质量％以上，且为90质量％以下、优选为75质量％以下、更优选为70质量％以下、进一步优选为60质量％以下、更进一步优选为50质量％以下，并且为10～90质量％、优选为14～75质量％、更优选为16～70质量％、进一步优选为18～60质量％、更进一步优选为20～50质量％。

<9>根据上述<1>～<8>中任一项所述的糖的制造方法，其中，含有纤维素的原料为选自浆类、纸类、由针叶树或阔叶树所得到木材、植物茎类、植物叶类、植物果穗类、和藻类中的1种以上，优选为选自木材或植物茎类、植物叶类、植物果穗类中的1种以上，更优选为选自蔗渣、EFB和油棕(树干部)中的1种以上，进一步优选为蔗渣。

<10>根据上述<1>～<9>中任一项所述的糖的制造方法，其中，酶包含木聚糖酶，该木聚糖酶的配合比例在酶中的总蛋白量中为2质量％以上、优选为3质量％以上、更优选为4质量％以上、进一步优选为5质量％以上、更进一步优选为6质量％以上，且为75质量％以下、优选为50质量％以下、更优选为40质量％以下、进一步优选为25质量％以下、更进一步优选为20质量％以下、更进一步优选为16质量％以下，并且为2～75质量％、优选为2～50质量％、更优选为3～40质量％、更优选为4～25质量％、进一步优选为5～20质量％、更进一步优选为6～16质量％。

<11>根据上述<1>～<10>中任一项所述的糖的制造方法，其中，含有纤维素的原料中的综纤维素含量为20质量％以上、优选为40质量％以上、更优选为45质量％以上、进一步优选为50质量％以上。

<12>根据上述<1>～<11>中任一项所述的糖的制造方法，其中，碱性化合物为选自碱金属及碱土金属的氢氧化物、氧化物和硫化物中的1种以上，优选为碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，更优选为碱金属氢氧化物，进一步优选为氢氧化钠或氢氧化钾。

<13>根据上述<1>～<12>中任一项所述的糖的制造方法，其中，使用选自振动球磨机、振动棒磨机和振动管磨机中的振动磨机、优选使用振动棒磨机来进行工序(1)中的粉碎处理。

<14>根据上述<13>所述的糖的制造方法，其中，使用为下述的棒的填充率的振动棒磨机来进行工序(1)中的粉碎处理，所述棒的填充率为10％以上、优选为15％以上且为97％以下、优选为95％以下、更优选为90％以下、进一步优选为80％以下，并且为10～97％、优选为10～95％、更优选为15～90％、进一步优选为15～80％。

<15>根据上述<1>～<14>中任一项所述的糖的制造方法，其中，在工序(2)之前具有对通过工序(1)所得的含有纤维素的粉碎物用水进行洗涤的工序。

<16>根据上述<1>～<15>中任一项所述的糖的制造方法，其中，在工序(2)之前具有对通过工序(1)所得的含有纤维素的粉碎物在以下条件下进行熟化的工序，所述条件为：相对于该含有纤维素的粉碎物而言的水分量为50质量％以上、优选为100质量％以上、更优选为200质量％以上、进一步优选为230质量％以上，且为10000质量％以下、优选为8000质量％以下、更优选为5000质量％以下、进一步优选为4000质量％以下、更进一步优选为3500质量％以下，并且为50～10000质量％、优选为100～8000质量％、更优选为200～5000质量％、进一步优选为230～3500质量％。

<17>根据上述<16>所述的糖的制造方法，其中，熟化温度为0℃以上、优选为20℃以上、更优选为50℃以上、进一步优选为80℃以上，且为250℃以下、优选为200℃以下、更优选为150℃以下、进一步优选为100℃以下。

<18>根据上述<16>或<17>所述的糖的制造方法，其中，熟化时间为0.01小时以上、优选为0.1小时以上、更优选为0.5小时以上、进一步优选为1小时以上，且为24小时以下、优选为18小时以下、更优选为12小时以下、进一步优选为6小时以下，并且为0.01～24小时、优选为0.1～18小时、更优选为0.5～12小时、进一步优选为1～6小时。

<19>根据上述<1>～<18>中任一项所述的糖的制造方法，其中，在含氮化合物的存在下进行工序(1)或工序(2)。

<20>根据上述<19>所述的糖的制造方法，其中，在含氮化合物的存在下进行工序(1)。

<21>根据上述<1>～<18>中任一项所述的糖的制造方法，其中，在含氮化合物的存在下进行工序(1)和工序(2)。

<22>根据上述<19>～<21>中任一项所述的糖的制造方法，其中，含氮化合物为选自具有烷基的伯铵盐、具有烷基的仲铵盐、具有烷基的叔铵盐、无机铵盐、季铵盐、具有胺部位的聚合物、具有胺部位的聚合物与酸的加成盐、和具有季铵盐部位的聚合物中1种以上，优选为氯化铵、四甲基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、烷基苄基二甲基氯化铵、二甲基二烯丙基氯化铵、二甲基二烯丙基氯化铵的聚合物、和二烯丙基胺盐酸盐-二氧化硫共聚物中的1种以上。

<23>根据上述<19>～<22>中任一项所述的糖的制造方法，其中，相对于构成纤维素原料中的综纤维素的脱水葡萄糖单元，含氮化合物的使用量以氮原子换算计为0.001倍摩尔以上、优选为0.002倍摩尔以上、更优选为0.005倍摩尔以上，且为1倍摩尔以下、优选为0.5倍摩尔以下、更优选为0.3倍摩尔以下、进一步优选为0.2倍摩尔以下，并且为0.001～1倍摩尔、优选为0.002～0.5倍摩尔、更优选为0.005～0.3倍摩尔、进一步优选为0.005～0.2倍摩尔。

实施例

在以下的实施例中，在无特别说明的情况以及除了结晶度(％)以外的情况下，“％”是指“质量％”。作为含有纤维素的原料(原料纤维素)中的纤维素含量，使用的是综纤维素含量。

(1)含有纤维素的原料中的综纤维素含量的计算

用乙醇二氯乙烷混合溶剂(1∶1)对粉碎后的含有纤维素的原料进行索氏萃取6小时，将萃取后的样品在60℃下进行真空干燥。在所得的试样2.5g中添加水150mL、亚氯酸钠1.0g和醋酸0.2mL，在70～80℃下加热1小时。接着，重复进行3～4次添加亚氯酸钠和醋酸并进行加热这样的操作直至试样被脱色成白色为止。将白色的残渣用玻璃过滤器(1G—3)加以过滤，用冷水和丙酮进行洗涤后，在105℃下干燥至其重量达到恒定值为止，求出残渣重量。利用下述式计算出综纤维素含量，将其作为纤维素含量。

纤维素含量(质量％)＝[残渣重量(g)／含有纤维素的原料的采集量(g：以去掉碱性化合物后的干燥原料来进行换算)]×100

(2)脱水葡萄糖单元(AGU)摩尔数的计算

将含有纤维素的原料中的综纤维素全部假定为纤维素，根据下式计算出AGU摩尔数。

AGU摩尔数＝综纤维素重量(g)／162

(3)含有纤维素的原料的水分量的测定

含有纤维素的原料的水分量的测定使用了红外线水分计(株式会社KETT科学研究所制造、制品名“FD-610”)。在150℃下进行测定，以30秒内的重量变化率达到0.1％以下的点作为测定的终点。将所测得的水分量的值换算成相对于含有纤维素的原料的干燥重量而言的质量％。

(4)还原糖量和糖化率的测定

在实施例和比较例中，根据DNS法(“生物化学实验法还原糖的定量法”学会出版中心)，按照以下步骤进行了糖的定量。

在工序(2)的糖化处理结束后，利用离心分离对沉淀物和上清液进行分离。在DNS溶液(0.5％—3，5—二硝基水杨酸、30％—酒石酸钠钾四水合物、1.6％—氢氧化钠)1mL中添加适量的上清液，在100℃下加热显色5分钟，冷却后，在波长535nm下进行比色定量。根据以葡萄糖作为标准糖的校正曲线，对上清液中的还原糖量进行了定量。

由所得的还原糖量的值，求出糖化率、以及将含有纤维素的粉碎物1g糖化时所生成的还原糖量。利用下述的计算式计算出糖化率。

糖化率(％)＝上清中的还原糖量浓度(g／ml)／(含有纤维素的粉碎物浓度(g／ml(以除去碱性化合物后的干燥原料进行换算))×综纤维素含量(g／g-含有纤维素的原料)／0.9(葡萄糖的分子量／AGU的分子量))×100

(5)利用HPLC进行的葡萄糖和木糖生成量的定量

利用以下的方法对通过本发明的方法生成的糖进行了组成分析，求出葡萄糖生成量和木糖生成量(实施例14～30和比较例6)。

Dionex公司制造的DX500色谱系统；柱：CarboPac PAl(Dionex公司制造、商品名、4×250mm)、检测器：ED40脉冲电流分析检测器、洗脱液：使用了A液；100mM氢氧化钠溶液、B液；含有1M醋酸钠的100mM氢氧化钠溶液、C液；超纯水。利用注入时的起始浓度A液10％：C液90％、0～15分钟时A液95％：B液5％的线性梯度对糖进行了分析。作为标准样品，使用了0.01％(w／v)的葡萄糖(和光纯药工业株式会社制造)、木糖(和光纯药工业株式会社制造)、木二糖(和光纯药工业株式会社制造)、纤维二糖(生化学工业株式会社制造)。

(6)蛋白的定量

使用DC蛋白定量试剂盒(Bio Rad公司制造)，根据将牛血清白蛋白作为标准蛋白的校正曲线，计算出蛋白量。

(7)聚合物的重均分子量的测定

使用株式会社日立制作所制造的L-6000型高速液相色谱，在下述的条件下测定凝胶渗透色谱(GPC)，以聚乙二醇换算分子量的形式求出聚合物的重均分子量(Mw)。

<GPC测定条件>

柱：将Asahipak GS-220HQ(昭和电工株式会社制造、排斥极限分子量3,000)和Asahipak GS-620HQ(昭和电工株式会社制造、排斥极限分子量200万)两根连接，柱温：30℃

展开溶剂：0.4mol／1-氯化钠水溶液

试样浓度：0.5g／100ml、试样注入量：20μl、流速：1.0ml／分钟

检测器：差示折射计(昭和电工株式会社制造；Shodex RISE-61)

实施例1—1

(干燥处理)

将蔗渣(甘蔗的压榨后的渣滓、综纤维素含量71.3质量％、结晶度29％、水分量7.0质量％)置于减压干燥机(ADVANTEC东洋株式会社制造、商品名“VO-320”)中，以氮气流通下的条件减压干燥2小时，得到综纤维素含量71.3质量％、结晶度29％、水分量2.0质量％的干燥蔗渣。

(工序(1))

将所得的干燥蔗渣100g和粒径0.7mm的粒状的氢氧化钠(东曹株式会社制造、商品名“Tosoh Pearl”)4.4g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于0.25摩尔的量)投入到间歇式振动磨机(中央化工机株式会社制造、商品名“MB-1”：容器总容积3.5L、作为介质而使用13根φ30mm、长218mm、剖面形状为圆形的SUS304制棒，棒填充率57％)中，粉碎处理1小时，从而得到含有纤维素的粉碎物。

(中和工序)

将工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物150mg(以除去碱性化合物后的干燥原料进行换算、以下相同)投入到带盖的螺管(株式会社Maruemu制、No.5，φ27×55mm)中，用1N—HCl进行了中和。

再添加水和100mM醋酸缓冲液0.3ml，定容至3ml，调节pH至5.0。

(工序(2))

在中和后的含有纤维素的粉碎物(以除去碱性化合物后的干燥原料换算计，相当于150mg、以下相同)中添加纤维素酶酶标准品CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)以使酶蛋白量达到1.5mg(酶使用量：10mg／g-含有纤维素的原料)，一边震荡搅拌，一边在50℃下进行24小时的糖化处理。工序(2)的糖化处理时的溶液中的含有纤维素的原料浓度为5质量％。

反应结束后，利用离心分离对沉淀物和上清液进行分离，利用上述的DNS法对游离于上清液的还原糖量进行定量，求出糖化率、以及使含有纤维素的粉碎物1g糖化时所生成的还原糖量。将结果示于表1。

实施例1—2

在工序(1)中的粉碎处理时添加水分，使相对于干燥蔗渣而言的水分量为10质量％，除此以外，利用与实施例11同样的方法进行糖的制造。结果示于表1。

实施例1—3

在工序(1)中的粉碎处理时添加水分，使相对于干燥蔗渣而言的水分量为20质量％，除此以外，利用与实施例1—1同样的方法进行糖的制造。结果示于表1。

实施例1—4

在工序(1)中的粉碎处理时添加水分，使相对于干燥蔗渣而言的水分量为30质量％，除此以外，利用与实施例1—1同样的方法进行糖的制造。结果示于表1。

比较例1—1

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和工序，除此以外，利用与实施例11同样的方法进行了糖的制造。结果示于表1。

比较例1—2

在工序(1)中的粉碎处理时添加水分，使相对于干燥蔗渣而言的水分量为50质量％，除此以外，利用与实施例11同样的方法进行糖的制造。结果示于表1。

[表1]

表1

*CTec2：纤维素酶酶标准品CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)

实施例1—5

使作为碱性化合物的氢氧化钠的使用量为4.4g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于0.25摩尔的量)，使粉碎处理时间为2小时，除此以外，利用与实施例1-1同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—6

使作为碱性化合物的氢氧化钠的使用量为8.8g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于0.5摩尔的量)，除此以外，利用与实施例15同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—7

使作为碱性化合物的氢氧化钠的使用量为17.6g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于1.0摩尔的量)，除此以外，利用与实施例1—5同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—8

代替氢氧化钠而使用氢氧化钾24.7g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于1.0摩尔的量)来作为碱性化合物，除此以外，利用与实施例1—7同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—9

代替蔗渣而使用棕榈空果穗(EFB)来作为含有纤维素的原料，并且使作为碱性化合物的氢氧化钠的使用量为15.2g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于1.0摩尔的量)，除此以外，利用与实施例1—7同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—10

代替蔗渣而使用油棕(树干部)来作为含有纤维素的原料，并且使作为碱性化合物的氢氧化钠的使用量为14.0g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于1.0摩尔的量)，除此以外，利用与实施例1—7同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1-11

代替CellicCTec2而使用Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)来作为酶，除此以外，利用与实施例1—7同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—12

在中和工序中使用醋酸来代替盐酸(1N—HCl)，除此以外，利用与实施例1—7同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

实施例1—13

按照下述方式进行中和工序和洗涤工序，除此以外，利用与实施例1—7同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

(中和工序和洗涤工序)

将工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物添加于醋酸水溶液，进行搅拌而使其中和(中和工序)。将其置于离心管(IWAKI制、50ml、29mm×115mm)中，进行离心分离，使用离子交换水，重复进行3次以上洗涤直至除去所生成的盐为止(洗涤工序)。将洗涤后的试样(以干燥原料换算计为150mg)投入到带盖的螺管(株式会社Maruemu制、No.5、φ27×55mm)中，再添加水和100mM醋酸缓冲液0.3ml，调节pH至5.0。

比较例1—3

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和工序，除此以外，利用与实施例1—9同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

比较例1—4

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和工序，除此以外，利用与实施例1—10同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

比较例1—5

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和工序，除此以外，利用与实施例1—11同样的方法进行糖的制造。结果示于表2。

[表2]

由表1和表2可知：与在工序(1)中不使用碱性化合物的比较例1—1和比较例1—3～1—5、以及在工序(1)中的水分量较多的比较例1—2相比，本发明的糖的制造方法中的纤维素的糖化率更为提高，并且所生成的还原糖量也更为提高，因此，生产率也更为优异。

实施例1—14～1—22

使用表3所示量(酶使用量：3mg／g-含有纤维素的原料)的Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)和异种表达葡聚糖内切酶I(异种表达EGI)作为酶，除此以外，利用与实施例16同样的方法进行糖的制造。结果示于表3。另外，如后所述，Celluclast1.5L的葡聚糖内切酶的含有比例为9质量％(EGh4质量％、EGII：5质量％)。

比较例1—6

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和工序，除此以外，利用与实施例114同样的方法进行糖的制造。结果示于表3。

另外，按照以下方式进行提纯和制备，从而得到实施例1—14～1—22和比较例1—6中所使用的各种蛋白。此外，在以下的记载中，只要没有特别说明，试剂使用的是和光纯药工业株式会社制造的试剂。

<提纯或制备酶的确认>

对于利用Celluclast1.5L进行提纯而得到的纤维二糖水解酶I(CBHI)、葡聚糖内切酶I(EGI)、葡聚糖内切酶II(EGII)、纤维二糖水解酶II(CBHII)和异种表达EGI而言，通过与UniProtKB／Swiss—Prot(http：／／au.expasy.org／sprot／)中记载的各个酶(Endoglucanase EG-1(P07981)、EG2：Endoglucanase EG-II(P07982)、CBHl：Exoglucanase1(P62694)、CBH2：Exoglucanase2(P07987))的分子量和部分氨基酸序列进行比较而进行了确认。

(i)纤维二糖水解酶I(CBHI)的提纯

以下的操作在10℃以下进行。将Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)用去离子水稀释成2倍后，使用脱盐柱Econo—Pac10DG柱(Bio Rad公司制造)，置换成10mM醋酸缓冲液(pH5.0)。将所得的酶溶液100mL供给到预先用10mM醋酸缓冲液(pH5.0)平衡后的阴离子交换体(a)SuperQ Toyopearl650M(φ2.5cm×25cm、东曹株式会社制造、商品名)中，用250mL的该缓冲液对柱内进行洗涤后，利用0～0.3M的氯化钠2000mL进行线性浓度梯度洗脱。

利用超滤膜PBCC(截留分子量：5000、Millipore公司制、商品名)，将吸附于阴离子交换体(a)的吸附级分浓缩成19mL。使用SephacrylS200HR(φb2.5cm×100cm、GE SCIENCE公司制、商品名)对浓缩后的吸附级分3mL进行凝胶过滤。将对于洗脱级分来而言能够利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下，也称为“SDS—PAGE”)确认为基本单一的通过级分，使用超滤膜加以浓缩，并利用脱盐柱而置换成10mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)，得到纤维二糖水解酶I(CBHI)。

(ii)葡聚糖内切酶I(EGI)的提纯

将不断穿过上述阴离子交换体(a)的通过级分，使用上述的超滤膜来浓缩成50mL，接着，供给到利用10mM醋酸缓冲液(pH5.0)平衡化后的阳离子交换体(b)SP Toyopearl650M(φ2.5cm×26cm、东曹株式会社制造、商品名)中。用300mL的该缓冲液对柱内进行洗涤后，利用0～0.3M的氯化钠1500mL进行线性浓度梯度洗脱。

将不断穿过阳离子交换体(b)的通过级分，使用上述的超滤膜进行浓缩后，使用脱盐柱，置换成20mM Tris盐酸盐缓冲液(pH7.8)。将该通过级分40mL供给到利用该缓冲液平衡化后的阴离子交换体(c)SuperQToyopearl650M(φφ2.5cm×25cm、东曹株式会社制造、商品名)中，用250mL的该缓冲液对柱内进行洗涤后，利用0～0.3M的氯化钠2000mL进行线性浓度梯度洗脱。

收集吸附于阴离子交换体(c)的吸附级分，利用上述的超滤膜将其浓缩成12mL。使用Sephacryl S200HR(φ2.5cm×100cm、GE SCIENCE公司制、商品名)对浓缩后的吸附级分12mL进行凝胶过滤。将对于洗脱级分而言能够利用SDS—PAGE确认为基本单一的级分，使用上述的超滤膜加以浓缩，并利用脱盐柱而置换成10mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)，得到葡聚糖内切酶I(EGI)。

(iii)葡聚糖内切酶II(EGII)的提纯

将不断穿过上述阴离子交换柱(c)的通过级分，利用上述的超滤膜进行浓缩后，利用脱盐柱而置换成10mM醋酸缓冲液(pH4.5)。将该通过级分16mL供给到利用该缓冲液平衡化后的阳离子交换体(d)SPToyopearl650M(φ2.5cm×26cm、东曹株式会社制造、商品名)中，用300mL的该缓冲液对柱内进行洗涤后，利用0～0.1M的氯化钠1000mL进行线性浓度梯度洗脱。将对于洗脱级分而言能够利用SDS—PAGE确认为基本单一的通过级分，利用上述的超滤膜加以浓缩，并利用脱盐柱而置换成10mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)，得到葡聚糖内切酶II(EGII)。

(iv)纤维二糖水解酶II(CBHII)的提纯

将吸附于上述阳离子交换柱(d)的吸附级分，利用上述的超滤膜进行浓缩，利用脱盐柱而置换成10mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)，得到纤维二糖水解酶II(CBHII)。

在上述的Celluclast1.5L的总蛋白量中，CBHI为70质量％、CBHII为11质量％、EGI为4质量％、EGII为5质量％。

(v)异种表达葡聚糖内切酶I(异种表达EGI)的制备

按照以下步骤制备异种表达EGI。

(Trichoderma reesei cDNA的合成)

用PDA琼脂培养基将Trichoderma reesei QM9414(NBRC31329)在28℃下培养7天，使其充分形成孢子。将1铂耳的该孢子接种到包含液体培养基[0.50％(w／v)KC Flock(日本制纸化学株式会社制造、商品名)、0.14％(w／v)硫酸铵、0.03％(w／v)尿素、0.25％(w／v)聚胨S(日本制药株式会社制造、商品名)、0.20％(w／v)磷酸二氢钾、0.03％(w／v)氯化钙·二水合物、0.03％(w／v)硫酸镁·七水合物、5.0ppm硫化铁·七水合物、1.6ppm硫酸锰·五水合物、1.6ppm硫酸锌·七水合物、2.0ppm氯化钴·六水合物]50mL的容积500mL的带凹槽的三角烧瓶中，在28℃、160rpm下振荡培养6天。

培养结束后，从通过离心分离(3,000rpm、4℃、15分钟)而得到的菌体中，使用TRIzol(注册商标)Reagent(invitrogen公司制)，按照操作规程(Protocol)分离出总RNA。利用所得的总RNA，使用cDNASynthesis Kit(M-MLV Version)(TAKARA BIO株式会社制造)，按照操作规程合成了Trichoderma reesei cDNA。

(EGI基因片段的取得)

将所得的cDNA作为模板，使用基于在swissprot数据库中被公开的T.reesei(Taxonomy ID：51453)的葡聚糖内切酶I基因序列所设计出的引物[上游引物(forward primer)(序列号1：atggcgccctcagttacactgccg)、下游引物(reverse primer)(序列号2：ttaaaggcattgcgagtagtagtcgtt)]来进行PCR。

具体而言，将模板cDNA0.5μL、50μM上游引物0.5μL、50μM下游引物0.5μL、PrimeSTAR(注册商标)Max DNA Polymerase(TAKARA BIO株式会社制造)25μL、灭菌去离子水23.5μL混合后，利用DNA EnginePTC-200(MJ Japan公司制)来进行PCR。关于PCR的条件，以在98℃下10秒钟、在55℃下5秒钟、在72℃下8秒钟作为1个循环，并使之反应30个循环，利用High Pure PCR Product Purification kit(Roche公司制)对增幅后的基因片段进行了提纯。

(EGI基因与amyB启动子和终止子的连接化)

将所得的EGI基因与来自A.oryzae源性α-淀粉酶基因(amyB)的启动子和终止子区域的各PCR片段作为模板DNA，使用基于amyB启动子区域所设计出的上游引物(序列号3：gtgaattcgagctcggtaccattacgcactacccgaatcg)和基于amyB终止子区域所设计出的下游引物(序列号4：tgattacgccaagcttgagttgtacctagaggagac)来进行PCR。

具体而言，将各PCR片段3.0μL、50μM上游引物0.4μL、50μM下游引物0.4μL、PrimeSTAR(注册商标)Max DNA Polymerase(TAKARABIO株式会社制造)25μL、灭菌去离子水15.2μL混合后，利用GeneAmpPCR System9700(PE Applied Biosystems公司制)来进行PCR。关于PCR的条件，以在98℃下10秒钟、在55℃下5秒钟、在72℃下20秒钟作为1个循环，使之反应30个循环，利用High Pure PCR Product Purification kit(Roche公司制)对增幅后的基因片段进行提纯。

(质粒的构建和大量制备)

在含有pPTRI载体(TAKARA BIO株式会社制造)的溶液中，添加Hind III和Kpn I，在37℃下过夜进行限制性内切酶反应。在70℃下进行15分钟的限制性内切酶的失活处理，然后利用High Pure PCR ProductPurification kit(Roche公司制)进行了提纯。对于线状化后的pPTRI载体，添加3倍量(摩尔比)的连接后的EGI片段，进行混合，使用In-FusionTMAdvantage PCR Cloning Kit(Clontech公司制)，进行In-fusion反应(在37℃下15分钟、在50℃下15分钟)。在反应终止液(总量10μL)中添加40μL TE缓冲剂(pH8.0)。在该混合液3μL中加入大肠杆菌感受态细胞DH5α株(东洋纺织株式会社制造)50μL而进行转化，将其涂抹于添加有X-gal和IPTG的LB琼脂培养基(含有100ppm氨苄西林)后，在37℃下进行18小时的培养。在所生长出的菌落中，挑菌挑出白色菌落，使用Quick TaqTM HS DyeMix(东洋纺织株式会社制造)，利用菌落直接法PCR来进行质粒的插入片段检测(Insert Check)。将通过琼脂糖电泳解析而能够确认出目标插入片段尺寸(insert size)的条带(band)的、转化菌落，接种到含有100ppm氨苄西林的LB液体培养基中，使用坂口烧瓶，过夜进行振荡培养(37℃、120rpm)。将该培养液离心(6000×g、4℃、15分钟)，回收菌体后，使用QIAfilter Plasmid Midi Kit(QIAGEN公司制)，进行质粒的提取和提纯。

(A.oryzae的转化)

作为转化用宿主，使用从NITE购入(NBRCl00959)的A. oryzaeRIB40株(正式名称：Aspergillus oryzae(Ahlburg)Cohn var brunneusMurakami)。将该菌株在PDA琼脂平板培养基上在25℃下恢复培养7天，然后在PDA斜面培养基上在25℃下传代培养7天，然后将所得的产物冷蔵保存，用作转化用的宿主。宿主使用的是A.oryzae RIB40株，利用所构建的质粒进行转化，使用含有0.2ppm吡啶硫胺素的再生用CD琼脂培养基，在30℃下培养7天。利用CD琼脂培养基，将在CD琼脂培养基上生长出的转化菌落在30℃下进行2次7天的传代培养。

(A.oryzae转化株的液体培养)

用铂耳将A.oryzae转化株接种到CD琼脂培养基上，在30℃下培养5～7天，然后制备成孢子悬浮液。使用Hema Tito meter(Thoma血球计算板)测量出孢子浓度后，将约5×105个孢子接种到50mL的液体培养基[5％(w/v)聚胨S(日本制药株式会社制造)、2.5％(w／v)酵母提取物(Difco公司制)、0.5％(w／v)磷酸二氢钾、0.05％(w／v)硫酸镁·七水合物、10％(w／v)麦芽糖]中，使用容积500mL的带挡板(baffle)的烧瓶，在培养温度30℃、转速150rpm下进行约5天的振荡培养。由此，最终制备出700mL的量的培养液。

(来自培养液的异种表达EGI的提纯)

将被过滤器(孔径0.45μm、NALGENE公司制)过滤后的培养液700mL，利用平膜(Polyethersulfone、76mm、30,000cutoff、Millipore公司制)来浓缩成200mL，再用离心式过滤器Amicon Ultra(30,000cutoff、Millipore公司制、商品名)而浓缩成15mL。使用脱盐柱Econo—Pac10DG柱(Bio Rad公司制)，将该浓缩液15mL置换成10mM醋酸缓冲液(，pH5.0)。将所得的酶溶液中的5mL供给到预先利用10mM醋酸缓冲液(pH5.0)平衡化后的阴离子交换体DEAE-650M(φ1.46cm×3cm、东曹株式会社制造、商品名)中，用15mL的该缓冲液对柱内进行洗涤后，利用0～0.5M的氯化钠40mL进行线性浓度梯度洗脱。利用脱盐柱，将不断穿过阴离子交换体的通过级分置换成10mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)，得到异种表达葡聚糖内切酶I(异种表达EGI)。

[表3]

如表3所示，可知：若酶中的总蛋白量中的葡聚糖内切酶的配合比例为10～90质量％，则葡萄糖生成量增加，并且将含有纤维素的粉碎物1g进行糖化时所生成的还原糖量提高。

实施例1—23～1—30

使用表4所示的量(酶使用量：3mg／g-含有纤维素的原料)的Celluclast1.5L(Novozymes公司制造、商品名)和cellicHTec(Novozymes公司制造、商品名)作为酶，除此以外，利用与实施例1—6同样的方法进行糖的制造。结果示于表4。

[表4]

如表4所示，可知：若酶中的总蛋白量中的木聚糖酶的配合比例为2～75质量％，则木糖生成量增加，并且将含有纤维素的粉碎物1g进行糖化时所生成的还原糖量提高。

实施例1—31

使工序(1)中的氢氧化钠的使用量为8.8g(相对于构成含有纤维素的原料中的综纤维素的AGU1摩尔，相当于0.5摩尔的量)，并且使粉碎处理时间为0.5小时，除此以外，利用与实施例11同样的方法进行糖的制造。结果示于表5。

实施例1—32

使工序(1)中的氢氧化钠的使用量为8.8g(相对于构成含有纤维素的原料中的综纤维素的AGU1摩尔，相当于0.5摩尔的量)，并且使粉碎时间为0.5小时，除此以外，利用与实施例1—1同样的方法进行干燥处理和工序(1)，得到含有纤维素的粉碎物。

(熟化工序)

将工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物150mg(以除去碱性化合物后的干燥原料进行换算)投入到带盖的螺管(株式会社Maruemu制、No.5，φ27×55mm)中，之后，一次性添加水1245mg进行混合，然后密闭带盖的螺管，在100℃下静置2小时，进行熟化。熟化工序时的水分量相对于含有纤维素的粉碎物(以除去碱性化合物后的干燥原料进行换算)为830质量％。

(中和工序)

用1N—HCl将熟化工序后的混合物进行了中和。

再添加100mM醋酸缓冲液0.3ml，定容至3ml，调节pH至5.0。

(工序(2))

向中和后的含有纤维素的粉碎物(以除去碱性化合物后的干燥原料换算计，相当于150mg)中添加纤维素酶酶标准品CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)以使得酶蛋白量达到1.5mg(酶使用量：10mg／g—含有纤维素的原料)，一边震荡搅拌，一边在50℃下进行24小时的糖化处理。工序(2)的糖化处理时的溶液中的含有纤维素的原料浓度为5质量％。

反应结束后，利用离心分离对沉淀物和上清液进行分离，利用上述的DNS法对游离于上清液的还原糖量进行定量，求出糖化率和使含有纤维素的粉碎物1g糖化时所生成的还原糖量。将结果示于表5。

实施例1—33

使熟化工序中的水的添加量为2490mg，并且使熟化工序时的水分量相对于含有纤维素的粉碎物为1660质量％，除此以外，利用与实施例1

32同样的方法进行糖的制造。将结果示于表5。

实施例1—34

利用与实施例1—32同样的方法进行干燥处理、工序(1)。此外，使熟化工序中的水的添加量为4980mg，并且使熟化工序时的水分量相对于含有纤维素的粉碎物为3320质量％，在100℃下进行2小时的熟化工序，此时，使螺管的盖开放，解除密闭状态，使剩余的水分蒸发至含有纤维素的原料浓度达到5质量％。

在熟化工序之后，利用与实施例1—32同样的方法进行中和工序和工序(2)，进行糖的制造。工序(2)中的溶液中的含有纤维素的原料浓度为5质量％。将结果示于表5。

实施例1—35

在中和工序中使用工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物600mg(以除去碱性化合物后的干燥原料进行换算)，除此以外，利用与实施例1—31同样的方法进行糖的制造。工序(2)中的溶液中的含有纤维素的原料浓度为20质量％。将结果示于表5。

实施例1—36

在熟化工序中使用工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物600mg(以除去碱性化合物后的干燥原料进行换算)，并且使水的添加量为850mg，使熟化工序时的水分量相对于含有纤维素的粉碎物为142质量％，除此以外，利用与实施例1—32同样的方法进行糖的制造。工序(2)中的溶液中的含有纤维素的原料浓度为20质量％。将结果示于表5。

实施例1—37

使熟化工序中的水的添加量为1700mg，并且使熟化工序时的水分量相对于含有纤维素的粉碎物为283质量％，除此以外，利用与实施例1—36同样的方法进行糖的制造。将结果示于表5。

实施例1—38

使熟化工序中的水的添加量为3400mg，并且使熟化工序时的水分量相对于含有纤维素的粉碎物为567质量％，除此以外，利用与实施例1—36同样的方法进行糖的制造。将结果示于表5。

比较例1—7

使工序(1)中的粉碎处理时间为0.5小时，除此以外，利用与比较例1—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表5。

比较例1—8

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和工序，除此以外，利用与实施例1—35同样的方法进行糖的制造。将结果示于表5。

[表5]

实施例1—39～1—49

分别按照表6所示那样改变熟化工序中的温度、时间，除此以外，利用与实施例1—37同样的方法进行糖的制造。将结果示于表6。

[表6]

由表5和表6可知：本发明的糖的制造方法通过进行熟化工序来进一步提高纤维素的糖化率，并且使所得的糖的收获量提高，因此生产率也优异。

实施例2—1

(干燥处理)

将蔗渣(甘蔗的压榨后的渣滓、综纤维素含量71.3质量％、结晶度29％、水分量7.0质量％)置于减压干燥机(ADVANTEC东洋株式会社制造、商品名“VO—320”)中，以氮气流通下的条件减压干燥2小时，得到综纤维素含量71.3质量％、结晶度29％、水分量2.0质量％的干燥蔗渣。

(工序(1))

将所得的干燥蔗渣100g和粒径0.7mm的粒状的氢氧化钠(东曹株式会社制造、商品名“Tosoh Pearl”)4.4g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，相当于0.25摩尔的量)、以及作为含氮化合物的月桂基三甲基氯化铵的27％水溶液(花王株式会社制造、商品名“QUARTAMIN24P”)4.30g(有效量：1.16g、相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，以氮原子换算计相当于0.01摩尔的量)投入间歇式振动磨机(中央化工机株式会社制造、商品名“MB—1”：容器总容积3.5L、作为棒而使用13根φ30mm、长218mm、剖面形状为圆形的SUS304制的棒，棒填充率57％)中，粉碎处理1小时，得到含有纤维素的粉碎物。

(中和工序)

将工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物150mg(以除去碱性化合物和含氮化合物后干燥原料进行换算)投入到带盖的螺管(株式会社Maruemu制、No.5，φ27×55mm)中，用1N—HCl进行了中和。

再添加水和100mM醋酸缓冲液0.3ml，定容至3ml，调节pH至5.0。

(工序(2))

向中和后的含有纤维素的粉碎物(以除去碱性化合物和含氮化合物后的干燥原料换算计，相当于150mg)中添加7.5μl(酶使用量：10mg／g—含有纤维素的原料)纤维素酶酶标准品CellicCTec2(Novozymes公司制造、商品名)，一边震荡搅拌，一边在50℃下进行24小时的糖化处理。工序(2)的糖化处理时的溶液中的含有纤维素的原料浓度为5质量％。

反应结束后，利用离心分离对沉淀物和上清液进行分离，利用上述的DNS法对游离于上清液的还原糖量进行定量，求出糖化率和使含有纤维素的粉碎物1g糖化时所生成的还原糖量。将结果示于表7。

实施例2—2

在工序(1)中使用作为含氮化合物的烷基苄基二甲基氯化铵的50％水溶液(花王株式会社制造、商品名“SANISOL B—50”)3.12g(有效量：1.56g、相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，以氮原子换算计相当于0.01摩尔的量)，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

实施例2—3

在工序(1)中使用作为含氮化合物的四甲基氯化铵(和光纯药株式会社制造)0.49g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，以氮原子换算计相当于0.01摩尔的量)，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

实施例2—4

在工序(1)中使用作为含氮化合物的氯化铵(和光纯药株式会社制造)0.24g(相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，以氮原子换算计相当于0.01摩尔的量)，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

实施例2—5

在工序(1)中使用作为含氮化合物的二烯丙基二甲基氯化铵聚合物(Mw40,000)的28％水溶液(NITTOBO MEDICAL株式会社制造、商品名“PAS—H—5L”)5.00g(有效量；1.40g、相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，以氮原子换算计相当于0.02摩尔的量)，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

实施例2—6

在工序(1)中使用作为含氮化合物的二烯丙基胺盐酸盐-二氧化硫共聚物(Mw5,000)的20％水溶液(NITTOBO MEDICAL株式会社制造、商品名“PAS—92S”)5.00g(有效量；1.00g、相对于构成综纤维素的AGU1摩尔，以氮原子换算计相当于0.02摩尔的量)，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

实施例2—7

代替工序(1)而在工序(2)中添加月桂基三甲基氯化铵的27％水溶液(花王株式会社制造、商品名“QUARTAMIN24P”)，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

实施例2—8

代替工序(1)而在工序(2)中添加二烯丙基二甲基氯化铵聚合物(Mw40,000)的28％水溶液(NITTOBO MEDICAL株式会社制造、商品名“PAS—H—5L”)，除此以外，利用与实施例25同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

比较例2—1

在不添加碱性化合物的情况下进行工序(1)，并且不进行中和处理，除此以外，利用与实施例2—1同样的方法进行糖的制造。将结果示于表7。

[表7]

由表7可知：与实施例1—1、比较例1—1和比较例2—1相比，使用了含氮化合物的实施例2—1～2—8的糖的制造方法中的纤维素的糖化率进一步提高，而且所得的糖的收获量也进一步提高，因此，生产率也优异。

产业上的可利用性

本发明的糖的制造方法的生产率优异，可以利用含有纤维素的原料效率良好地得到糖。所得的糖在乙醇或乳酸等的发酵生产等中是有用的。

Claims (15)

1.一种糖的制造方法，其具有下述工序(1)和工序(2)，

工序(1)：在碱性化合物的存在下，对含有纤维素的原料在相对于该含有纤维素的原料的干燥重量而言的水分量为40质量％以下的条件下进行粉碎处理，从而得到含有纤维素的粉碎物的工序，

工序(2)：利用酶对通过工序(1)所得的含有纤维素的粉碎物进行糖化处理的工序。

2.根据权利要求1所述的糖的制造方法，其中，以固体状态添加碱性化合物。

3.根据权利要求1或2所述的糖的制造方法，其中，相对于构成含有纤维素的原料中的综纤维素的脱水葡萄糖单元，碱性化合物的量为0.01～10倍摩尔。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的糖的制造方法，其中，在工序(2)之前具有利用酸对工序(1)中所得的含有纤维素的粉碎物进行中和的工序。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的糖的制造方法，其中，酶为选自纤维素酶和半纤维素酶中的1种以上。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的糖的制造方法，其中，酶包含葡聚糖内切酶，该葡聚糖内切酶的配合比例在酶中的总蛋白量中为10～90质量％。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的糖的制造方法，其中，酶包含木聚糖酶，该木聚糖酶的配合比例在酶中的总蛋白量中为2～75质量％。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的糖的制造方法，其中，含有纤维素的原料为选自浆类、纸类、利用针叶树或阔叶树所得到的木材、植物茎类、植物叶类、植物果穗类、和藻类中的1种以上。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的糖的制造方法，其中，碱性化合物为选自碱金属或碱土金属的氢氧化物、氧化物和硫化物中的1种以上。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的糖的制造方法，其中，在工序(2)之前，具有对通过工序(1)所得的含有纤维素的粉碎物在相对于该含有纤维素的粉碎物而言的水分量为50～10000质量％的条件下进行熟化的工序。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的糖的制造方法，其中，在含氮化合物的存在下进行工序(1)或工序(2)。

12.根据权利要求11所述的糖的制造方法，其中，在含氮化合物的存在下进行工序(1)。

13.根据权利要求1～10中任一项所述的糖的制造方法，其中，在含氮化合物的存在下进行工序(1)和工序(2)。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的糖的制造方法，其中，含氮化合物为选自具有烷基的伯铵盐、具有烷基的仲铵盐、具有烷基的叔铵盐、无机铵盐、季铵盐、具有胺部位的聚合物、具有胺部位的聚合物与酸的加成盐、和具有季铵盐部位的聚合物中的1种以上。

15.根据权利要求11～14中任一项所述的糖的制造方法，其中，相对于构成含有纤维素的原料中的综纤维素的脱水葡萄糖单元，含氮化合物的使用量以氮原子换算计为0.001～1倍摩尔。