CN103757023B - 应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子及其制备方法和应用，家蚕卵黄原蛋白启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，由1474个核苷酸组成，该启动子含有3个家蚕BrC-Z2的特异性结合位点，能够与BmBrC-Z2蛋白特异结合，并受蜕皮激素诱导表达；本发明还公开了家蚕卵黄原蛋白启动子的制备方法和应用，为研究蜕皮激素诱导表达基因的功能基因以及这些基因是如何受蜕皮激素调控的机理提供了有力的工具。

Description

应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种应答蜕皮激素家蚕卵黄原蛋白启动子，还涉及该启动子的制备方法和应用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫，为中华民族文化经济社会的发展做出了极为重要的贡献。同时，其遗传背景清楚，遗传资源丰富，又是国际公认的鳞翅目模式昆虫。卵黄原蛋白（vitellogenin，Vg），是卵黄磷蛋白的前体，是昆虫卵发育和成熟必须的营养组分之一，并且该基因在蛹期特异表达。已有的报道显示，昆虫Vg的转录受到激素和营养信号的共同调控，如：果蝇3个卵黄蛋白（yp1，yp2，yp3）在脂肪体和卵的滤泡细胞中表达，其表达由组织特异性因子、保幼激素和蜕皮激素共同调控；蚊子Vg在雌蚊成虫食血后开始高量表达，这种时期特异性是受蜕皮激素和氨基酸介导的营养信号通路共同调控。而家蚕卵黄原蛋白（BmVg）是在雌虫蛹期特异高量表达的，蛹期对于家蚕来说是个变态发育的关键时刻，组织器官更新，代谢旺盛。但是，目前并不清楚家蚕卵黄原蛋白是如何调控的，因此家蚕卵黄原蛋白BmVg启动子的开发，对于揭示这个过程的很多重要基因的功能以及这些基因在变态期是如何受激素调控的机理是一个理想的工具。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供应答蜕皮激素家蚕卵黄原蛋白启动子；本发明的目的之二在于提供家蚕卵黄原蛋白启动子的制备方法；本发明的目的之三在于提供含有家蚕卵黄原蛋白启动子的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供家蚕卵黄原蛋白启动子的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子，所述家蚕卵黄原蛋白启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.所述家蚕卵黄原蛋白启动子的制备方法，以家蚕品种p50上蔟三天基因组为模板，SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增。

优选的，所述PCR扩增的条件为94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸80秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

3.含有所述家蚕卵黄原蛋白启动子的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.11所示核苷酸序列连入细胞转染载体pGL3basic的XhoI和HindIII酶切位点处而得。

4.所述家蚕卵黄原蛋白启动子在制备蜕皮激素诱导表达的重组载体中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子，通过分析家蚕卵黄原蛋白基因表达谱发现，家蚕卵黄原蛋白在变态发育期高表达，然后利用蜕皮激素和保幼激素分别处理体外培养家蚕脂肪体发现，BmVg受蜕皮激素诱导表达，并存在时间和浓度依赖性，对启动子分析发现BmVg启动子含有3个BrC结合元件，并且能够与BmBrC-Z2蛋白特异结合，因此可以得出BmVg启动子受蜕皮激素的调控表达，可作为一个蜕皮激素调控靶标基因的模式启动子。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1.BmVg的转录与激素的关系（A：雌家蚕变态期BmVg基因的转录谱；B：不同浓度保幼激素处理体外培养脂肪体；C：不同浓度蜕皮激素处理体外培养脂肪体；D：0.2μM蜕皮激素分别处理体外培养脂肪体0，6，12，24，48小时）。

图2为BmVg启动子结构示意图（其中粗箭头为BrC-Z2结合基序，转角箭头处为转录起始位点）。

图3为BmVg受蜕皮激素的调控是通过BmBrC-Z2起作用的（A和B：细胞转染分析BrC-Z2结合元件对BmVg启动子应答蜕皮激素的响应；C和D：EMSA实验分析BmBrC-Z2蛋白与预测的结合位点相互作用。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、脂肪体体外培养与激素处理

取家蚕品种p50雌虫五龄幼虫第五天、第七天、上蔟第一天、第二天、第三天、化蛹第一天，第二天（5D5L、7D7L、W1、W2、W3、P1和P2）不同时期的脂肪体，用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取组织的总RNA，并用M-MLV逆转录酶（Promega，Madison，WI）合成cDNA。然后利用表1所示的引物进行半定量PCR和定量PCR检测BmVg基因的表达情况，结果如图1A所示。其中半定量PCR的检测条件为94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，58℃退火30秒，72℃延伸80秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。定量PCR的检测条件为95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，95℃延伸15秒，共40个循环。

表1、半定量和定量检测检测BmVg基因表达的引物序列

由图1A可知，BmVg基因在上蔟第二天开始表达，第三天转录达到最高峰。

脂肪体体外培养与激素处理：将上蔟第一天和第三天的雌性家蚕品种p50个体用酒精清洗后，解剖并取出脂肪体。取出的脂肪体用高压灭菌处理过的昆虫生理盐水清洗干净（至少五遍）。然后将每头蚕的脂肪体均匀分成4-6份，用不加胎牛血清的双抗Grace昆虫培养基培养细胞。

用浓度分别为0.0μM，0.02μM，0.2μM，2μM和4μM的保幼激素处理上蔟第三天的脂肪体，处理时间为24小时，然后利用表1所示的引物进行半定量和定量PCR检测BmVg基因的表达情况，结果如图1B所示。用浓度分别为0.0μM，0.02μM，0.2μM，2μM和4μM的蜕皮激素处理上蔟第一天的脂肪体，处理时间为24小时，然后利用表1所示的引物半定量和定量PCR检测BmVg基因的表达情况，结果如图1C所示。由图1B和图1C可知，BmVg的表达受保幼激素的影响不大，但受蜕皮激素诱导表达，其最佳诱导浓度为0.2μM。确定最佳处理浓度为0.2μM蜕皮激素后，用0.2μM的蜕皮激素分别处理体外培养脂肪体0，6，12，24，48小时，然后利用表1所示的引物进行半定量和定量PCR检测BmVg基因的表达情况，结果如图1D所示。结果表明，当用0.2μM的蜕皮激素处理24小时时，BmVg基因诱导的效果最好。上述结果表明BmVg基因的转录被蜕皮激素诱导，这种诱导具有剂量和时间的依赖性。

实施例2、克隆家蚕BmVg基因启动子

根据家蚕基因组数据，在BmVg基因上游设计克隆BmVg基因启动子的引物，上游引物为BmVg Pc(1.5)-F：5′-ccgctcgagatcagcacctcgcctatt-3′（SEQ ID NO.9），下划线表示XhoI酶切位点；下游引物为BmVg Pc-R：5′-cccaagctttgtactagctccgctgtc-3′（SEQ ID NO.10），下划线表示HindIII酶切位点。然后以家蚕品种p50上蔟三天基因组为模板进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸80秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存，将扩增产物经电泳，纯化，然后克隆至pMD-19T simple载体，最后进行测序，获得如SEQ ID NO.11所示序列，即BmVg基因启动子。

实施例3、BmVg启动子序列分析

将实施例2获得的BmVg启动子序列用MatInspector program（http://www.genomatix.de/）在线预测其存在的潜在调控位点。经预测，在BmVg启动子中发现3个BrC-Z2的特异性调控位点（图2）M1，M2和M3，其结合基序分别为：SEQ ID NO.12（-1100～-1082），SEQ IDNO.13（-1070～-1088）和SEQ ID NO.14（-186～-211）。

实施例4、BmBrC-Z2调控BmVg基因的转录

构建由BmVg启动子驱动荧光素酶基因表达的细胞转染载体：用XhoI和HindIII限制性内切酶同时酶切含有BmVg启动子的pMD19T simple载体（实施例2）及细胞转染载体pGL3basic。然后将酶切得到的启动子连到酶切后的pGL3basic骨架载体上，得pGL3-BmVgP-LUC重组载体。

在此基础上分别将三个BrC-Z2调控位点突变，分别获得具有不同形式的该调控位点的重组质粒。具体方法为：分别利用M1突变位点、M2突变位点和M3突变位点的正向引物和反向引物扩增pGL3-BmVgP-LUC重组载体（引物序列如表2所示），扩增后用Dpn I限制性酶将模板载体切碎，由于Dpn I限制性酶识别含甲基化的序列，因此只有模板序列能被切碎，而扩增后的序列不会被识别，因此酶切后分别获得含M1突变位点、M2突变位点和M3突变位点的载体，再以含M2突变位点的载体为模板，以M3突变位点的正向引物和反向引物进行扩增，扩增后用Dpn I限制性酶将模板载体切碎，得含有M2和M3突变位点的载体；然后再以含有M2和M3突变位点的载体为模板，以M1突变位点的正向引物和反向引物进行扩增，扩增后用Dpn I限制性酶将模板载体切碎，得含有M1、M2和M3突变位点的载体。

表2、获得含突变位点的引物

将扩增获得的含突变位点在载体转化大肠杆菌DH5α感受态，获得阳性克隆并测序验证。然后将构建好的载体转染家蚕BmE胚胎细胞系，24小时后收集细胞表达的蛋白。用双荧光素酶报告系统（Promega，USA）分析这些BrC-Z2的调控位点对于启动子响应蜕皮激素的作用，结果如图3A和3B所示。结果显示，BrC-Z2的调控位点对于启动子响应蜕皮激素是非常重要的，尤其是近端反向的BrC-Z2的调控位点，将其突变后启动子失去了对蜕皮激素的响应。

EMSA实验用于分析蜕皮激素早期应答基因（Broad complex isoform Z2，BmBrC-Z2）是否会与预测的BmVg启动子上的BrC-Z2调控位点结合。由上海生工合成探针，正向序列为aaataaaaattagaacgcg（SEQ ID NO.21），反向序列为：cgcgttctaatttttattt（SEQ ID NO.22）,并在正向序列的5’端用生物素标记，该探针包括了最核心的BrC-Z2调控位点。利用大肠杆菌原核表达的方法合成带His标签的BmBrC-Z2重组蛋白（BmBrC-Z2蛋白的登录号为NP_001104803.1），其制备方法是根据BmBrC-Z2蛋白的基因序列分别合成带BamHI和HindIII限制性酶切位点的引物，上游引物为：5’-cgcggatccgtggacagtcagacgcaacaa c-3’（SEQ IDNO.23），下游：5’-cccaagcttctaaaaaaaccggatttgatccg-3’（SEQ ID NO.24），然后以蛹期第一天的雌蚕脂肪体cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的基因片段克隆到PET28a载体上去，经测序验证后将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21中诱导表达。诱导条件为：在15℃，IPTG诱导浓度为0.05mM，诱导20小时。诱导表达后，收集菌体，将菌体破碎，收集蛋白并过镍柱、阳离子交换柱和分子筛，得BmBrC-Z2重组蛋白。EMSA实验按照LightShiftChemiluminescent EMSA Kit(Thermo pierce)试剂盒说明书进行。结果显示，BmBrC-Z2重组蛋白和探针形成一条明显的滞后条带，该条带随着蛋白和探针的加量增加变亮（图3C），随着竞争探针的增多变弱，这说明重组蛋白与预测的BrC-Z2调控位点是特异性的结合的（图3D）。因此，BmVg启动子含有调控位点，该调控位点能够与BmBrC-Z2蛋白结合，并受蜕皮激素诱导下游基因表达，该启动子公开为研究家蚕变态期相关基因功能具有重要意义。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.应答蜕皮激素的家蚕卵黄原蛋白启动子，其特征在于：所述家蚕卵黄原蛋白启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.权利要求1所述家蚕卵黄原蛋白启动子的制备方法，其特征在于：以家蚕品种p50基因组为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸80秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

4.含有权利要求1所述家蚕卵黄原蛋白启动子的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ ID NO.11所示核苷酸序列连入细胞转染载体pGL3 basic的XhoI和HindIII酶切位点处而得。

6.权利要求1所述家蚕卵黄原蛋白启动子在制备蜕皮激素诱导表达的重组载体中的应用。