CN103755583A - 魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物有效成分的提取工艺领域，公开了一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法。本发明利用超声波技术先进行初步处理，把神经酰胺在短时间内从原料细胞内部分散出来，提取时间短，避免了高温加热对有效成分的破坏，为下步的提取分离提高提取率；再利用二氧化碳在超临界状态下具有选择性的溶解能力的特性来对不同的极性物质进行二次萃取精制分离，具有操作温度低，选择性好，有效成分结构不被破坏，能完好地保存天然植物的活性有效成分等优点，使魔芋飞粉中的神经酰胺能高效地提取分离出来，神经酰胺的含量比现有的技术更高更纯化。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分的提取工艺领域，具体涉及魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法。
背景技术
魔芋（Amorfhophallus Konjac）属于被子植物门、单子叶植物纲、天南星科、魔芋属,是具有球茎的多年生草本植物。含有大量的膳食纤维、多种维生素、微量元素、氨基酸等多种活性成分，是一种药食两用的天然植物原料，具有降血脂、降血压、减肥、保湿美白、抗衰老、通便润肠胃等功能。神经酰胺（Ceramide）是一类广泛存在于动植物细胞中的生物活性物质,由长链鞘氨醇和脂肪酸通过酰胺键缩合而成。近些年来,神经酰胺类物质已成为新兴医药保健品、食品和化妆品的重要功能性成分,尤其是其高效保湿的特性使得神经酰胺类物质在化妆品中得到广泛应用,具有极大的市场潜力和很高的附加值。研究发现，魔芋中含有较丰富的神经酰胺，据报道在魔芋中的神经酰胺含量高达0.15～0.2%，比小麦、玉米、米糠中的含量高出十倍之多，而在魔芋飞粉中的神经酰胺含量又高于魔芋精粉。魔芋飞粉是在魔芋精粉生产过程中产生的极轻且极细的副产品，占魔芋精粉质量的36%～42%。目前，从魔芋飞粉中提取分离神经酰胺的常用方法是有机溶剂提取分离法，都存在溶剂消耗量较大，提取效率较低，耗费时间太长，有效成分受热不稳定等缺点，难以大规模工业化生产。而且提取分离过程中要用到有一定毒性的有机溶剂，有机溶剂的蒸发消耗大量的能源，不环保，且产品中有机溶剂残留也不可避免。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法，包括以下操作步骤：
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在45～70℃下经超声振荡提取20～45分钟，趁热过滤提取液，旋转蒸发除去溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的5～10倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为35～60℃，萃取压力15～65Mpa，萃取时间为0.5～3小时，CO2流速为10～25L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度35～60℃，分离压力为5～20Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品；
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂，萃取压力30～55Mpa，萃取温度为35～60℃，萃取时间为1～2小时，CO2流速为10～25L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为5～15Mpa，分离温度35～60℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺；所述夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液。
步骤（1）所述乙醇的用量优选为魔芋飞粉质量的6～8倍；所述超声振荡提取优选温度为50～60℃，时间为30～40分钟。
步骤（2）所述萃取温度优选为40～55℃，萃取压力优选25～55Mpa，萃取时间优选为1～2.5小时，CO2流速优选为10～25L/h；所述分离温度优选40～55℃，分离压力优选为7～17Mpa。
步骤（3）所述萃取压力优选35～50Mpa，萃取温度优选为40～55℃，萃取时间优选为1～2小时，CO2流速优选为10～25L/h；所述分离压力优选为8～12Mpa，分离温度优选40～55℃。
本发明的原理：
神经酰胺（ceramide），即N-脂酰神经鞘胺醇，是生物体内一类重要的功能性物质，作为一种脂质分子以细胞膜的结构组成成份或胞内自由分子形式存在，参与调节细胞的生长、抑制、分化、衰老和凋亡等。游离态的神经酰胺含量都比较少，神经酰胺在生物体中主要以结合态存在即鞘脂类为其主要存在形式。鞘脂类在不同的溶剂中其溶解度差别很大，不溶于乙醚和丙酮，溶于乙醇和石油醚等，经过多年的工艺摸索，以及从工业化生产及节能环保等各方面因素综合考虑，先用乙醇超声处理魔芋飞粉，然后利用超临界二氧化碳萃取分离技术对乙醇提取物进行萃取分离。在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。虽然对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出。利用这种特性提取魔芋飞粉中的极性有效成分，首先获得粗提物——神经酰胺粗品。粗品中除了含有游离的神经酰胺、结合的神经酰胺即鞘磷脂外还含有大量的杂质如磷脂、三酰甘油等物质，各种物质的极性有一定的差异，由于神经酰胺类物质是一种中等极性的脂类物质，针对不同极性的物质，通过在超临界二氧化碳流体加入适当的夹带剂和调整压力，可以改变超临界流体的极性，调节神经酰胺类物质在超临界流体中的溶解度，以达到纯化富集这一有效成分的目的。利用这种特性对粗品进行二次萃取精制分离，从而获得纯度较高的有效成分神经酰胺。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
（1）本发明提供了一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取精制分离方法，该方法是将溶剂法与二氧化碳超临界萃取分离相结合的新工艺技术，充分利用了乙醇极性溶剂提取极性化合物的优异性能和发挥超临界二氧化碳流体高效萃取分离的特点，从而获得较高的分离效率和较高的产品收率。
（2）本发明利用超声波技术先进行初步处理，把神经酰胺在短时间内从原料细胞内部分散出来，提取时间短，避免了高温加热对有效成分的破坏，为下步的提取分离提高提取率；再利用二氧化碳在超临界状态下具有选择性的溶解能力的特性来对不同的极性物质进行二次萃取精制分离，具有操作温度低，选择性好，有效成分结构不被破坏，能完好地保存天然植物的活性有效成分等优点，使魔芋飞粉中的神经酰胺能高效地提取分离出来，神经酰胺的含量比现有的技术更高更纯化。
（3）本发明的二氧化碳超临界萃取是一个封闭的过程，萃取和分离合二为一，当饱含溶解物的二氧化碳超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得CO2与萃取物迅速回复成为分离的两相（气液分离）而立即分开，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂，操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本，同时可回收大量的乙醇，回收的乙醇可循环利用，减少了浪费，达到环保和节约的目的。超临界CO2流体常态下是无色无味无毒的气体，与萃取成分分离后，完全没有溶剂的残留，可以有效地避免传统溶剂萃取条件下溶剂毒性的残留.同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染，是一种天然且环保的萃取技术。
（4）本发明的整套提取精制分离方法工艺简单，操作方便，生产周期短，具有质量可控性高、提取效率高、利用率高、运行成本低、无有机溶剂和重金属残留、绿色无污染、活性成分不易破坏等优势，极具广阔的应用前景，适合工业化大生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在45℃经超声振荡提取20分钟，趁热过滤提取液，旋转蒸发除去部分溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的5倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为35℃，萃取压力15Mpa，萃取时间为0.5小时，CO2流速为10L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度35℃，分离压力为5Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品A。
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力30Mpa，萃取温度为35℃，萃取时间为1小时，CO2流速为10L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为5Mpa，分离温度35℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品Ⅰ。
实施例2
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在50℃经超声振荡提取25分钟，趁热过滤提取液，用旋转蒸发除去部分溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的6倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为40℃，萃取压力25Mpa，萃取时间为1小时，CO2流速为12L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度40℃，分离压力为7Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品B。
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力35Mpa，萃取温度为40℃，萃取时间为1小时，CO2流速为12L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为8Mpa，分离温度40℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品Ⅱ。
实施例3
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在55℃经超声振荡提取30分钟，趁热过滤提取液，用旋转蒸发除去部分溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的7倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为45℃，萃取压力35Mpa，萃取时间为1.5小时，CO2流速为15L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度45℃，分离压力为10Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品C。
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力40Mpa，萃取温度为45℃，萃取时间为1.5小时，CO2流速为15L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为10Mpa，分离温度45℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品Ⅲ。
实施例4
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在60℃经超声振荡提取35分钟，趁热过滤提取液，用旋转蒸发除去部分溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的8倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为50℃，萃取压力45Mpa，萃取时间为2小时，CO2流速为18L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度50℃，分离压力为13Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品D。
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力45Mpa，萃取温度为50℃，萃取时间为2.5小时，CO2流速为10L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为10Mpa，分离温度55℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品Ⅳ。
实施例5
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在65℃经超声振荡提取40分钟，趁热过滤提取液，用旋转蒸发除去部分溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的9倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为55℃，萃取压力55Mpa，萃取时间为2.5小时，CO2流速为20L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度55℃，分离压力为17Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品E。
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力50Mpa，萃取温度为55℃，萃取时间为2小时，CO2流速为20L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为12Mpa，分离温度55℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品Ⅴ。
实施例6
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在70℃经超声振荡提取45分钟，趁热过滤提取液，旋转蒸发除去部分溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的10倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为60℃，萃取压力65Mpa，萃取时间为3小时，CO2流速为25L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度60℃，分离压力为20Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品F。
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力55Mpa，萃取温度为60℃，萃取时间为2小时，CO2流速为25L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为15Mpa，分离温度60℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品Ⅵ。
对比例1
（1）将20质量份魔芋飞粉装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为45℃，萃取压力35Mpa，萃取时间为1.5小时，CO2流速为15L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度45℃，分离压力为10Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品1。
（2）将步骤（1）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂（夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液），萃取压力40Mpa，萃取温度为45℃，萃取时间为1.5小时，CO2流速为15L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为10Mpa，分离温度45℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺①。
对比例2
（1）将步骤（1）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为45℃，萃取压力35Mpa，萃取时间为1.5小时，CO2流速为15L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度45℃，分离压力为10Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品2。
（2）将神经酰胺粗品装入旋转瓶中，加入5倍量的石油醚萃取3次，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩，除去大部分溶剂，收集所得的萃取产物即为神经酰胺②。
效果实施例：
一、提取率的测定
通过对以上实施例1-6和对比例1-2步骤（2）和步骤（3）所得的神经酰胺测定提取率，结果见表1。
表1神经酰胺粗品和精品的提取率
| 示例 | 粗品 | 提取率（%） | 精品 | 提取率（%） |
| 实施例1 | 神经酰胺A | 4.7 | 神经酰胺Ⅰ | 38 |
| 实施例2 | 神经酰胺B | 4.9 | 神经酰胺Ⅱ | 38 |
| 实施例3 | 神经酰胺C | 5.2 | 神经酰胺Ⅲ | 41 |
| 实施例4 | 神经酰胺D | 5.1 | 神经酰胺Ⅳ | 40 |
| 实施例5 | 神经酰胺E | 4.9 | 神经酰胺Ⅴ | 39 |
| 实施例6 | 神经酰胺F | 5.0 | 神经酰胺Ⅵ | 40 |
| 对比例1 | 神经酰胺1 | 3.8 | 神经酰胺① | 29 |
| 对比例2 | 神经酰胺2 | 3.6 | 神经酰胺② | 12 |
上述实验结果表明，在神经酰胺粗品和神经酰胺纯品的提取分离过程中，魔芋飞粉经过超声处理后，能明显提高超临界二氧化碳萃取神经酰胺粗品和神经酰胺产品的提取率。超声波是一种具有独特效应的机械波，经过超声快速振动处理的魔芋飞粉，使有效成分神经酰胺在短时间内从细胞内部分散出来，易于扩散进入超临界二氧化碳流体中，并到达一定的溶解度，强化了超临界流体对极性物质的提取率，最佳的超声条件为超声35分钟，温度55℃，料液比为1:7。
二、含量的测定
1、实验仪器及材料
1.1实验仪器
高效液相色谱仪（型号：U3000；厂家：Thermo Fisher Scientific），蒸发光散射检测器（型号：M100）；色谱柱：Kromasil100-5C18（5μm，250×4.6mm）
1.2实验条件
甲醇：水60:40，柱温：35℃，流速：1ml/min，蒸发光散射检测器温度：40℃，氮气流速：1.5ml/min
1.3材料
实施例1-6所得的神经酰胺粗品A-F和纯品Ⅰ-Ⅵ，对比例1-2所得的神经酰胺粗品1-2和纯品①-②。
2实验内容
2.1供试品溶液的制备
精密称定已制备的神经酰胺粗品和纯品各0.5g，置50mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.2标准品溶液的配制
精密称定神经酰胺C6标准品1.0mg，置10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.3测定方法
分别取标准品溶液、供试品溶液，按照色谱条件进样，采集谱图。
3实验结果及结论
3.1标准曲线的绘制
精密量取已配制好的标准品溶液，分别进样2、6、10、12、14、18、20μL，分别以进样量的对数值与峰面积对数值建立线性方程，Y=1.3785X+5.4958；R2=0.9985。
3.2供试品中神经酰胺C6的含量测定，结果见表2
表2神经酰胺C6的含量
从上述的神经酰胺含量结果表明，经过二氧化碳超临界二次萃取分离，神经酰胺的含量大大的提高，精制后神经酰胺含量达到70%以上，各实施例之间含量差异不大，表明精制分离方法合理稳定。比用传统的有机溶剂分离法有所提高，表明提纯效果良好，而且本发明中所用的试剂为乙醇和水，同时也解决了有机溶剂残留的问题。
在二氧化碳超临界流体萃取分离过程中，影响萃取率的因素主要包括：萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO2流量、夹带剂等。通过改变压力、温度来调整超临界流体的密度，便能溶解不同类型的化合物，达到选择性提取分离各类化合物的目的。通过在超临界流体中添加一定量的夹带剂可对流体进行改性，增加流体的极性，提高其对极性物质的溶解度，增加提取率和改善选择性，使超临界二氧化碳更有效的对物质进行分离提纯。神经酰胺是中等极性脂类物质，夹带剂极性过大或过小都不利于神经酰胺类物质的提纯分离，因此选用85%乙醇作为夹带剂。通过设计正交实验得到，第一步萃取神经酰胺粗品最佳工艺条件为萃取压力35Mpa，萃取温度45℃，时间1.5小时，流速15L/h，分离压力10Mpa，分离温度45℃。二次萃取分离最佳的条件为萃取压力40Mpa，萃取温度45℃，时间1.5小时，流速15L/h，夹带剂85%乙醇水溶液，分离压力10Mpa，分离温度45℃。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法，其特征在于包括以下操作步骤：
（1）将20质量份魔芋飞粉干燥，加入体积百分比浓度95%的乙醇，在45～70℃下经超声振荡提取20～45分钟，趁热过滤提取液，旋转蒸发除去溶剂得到密度为1.15的膏状物；所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的5～10倍；
（2）将步骤（1）所得膏状物装入超临界萃取釜中，采用CO2超临界流体萃取分离，萃取温度为35～60℃，萃取压力15～65Mpa，萃取时间为0.5～3小时，CO2流速为10～25L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离温度35～60℃，分离压力为5～20Mpa，收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品；
（3）将步骤（2）所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中，进行二次萃取分离，加入30%的夹带剂，萃取压力30～55Mpa，萃取温度为35～60℃，萃取时间为1～2小时，CO2流速为10～25L/h；所获含萃取物的超临界CO2流体，经减压解析分离出萃取产物，分离压力为5～15Mpa，分离温度35～60℃，收集所得的萃取产物即为神经酰胺；所述夹带剂为体积百分比浓度85%的乙醇水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法，其特征在于：步骤（1）所述乙醇的用量为魔芋飞粉质量的6～8倍；所述超声振荡提取的温度为50～60℃，时间为30～40分钟。
3.根据权利要求1所述的一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法，其特征在于：步骤（2）所述萃取温度为40～55℃，萃取压力25～55Mpa，萃取时间为1～2.5小时，CO2流速为10～25L/h；所述分离温度40～55℃，分离压力为7～17Mpa。
4.根据权利要求1所述的一种魔芋飞粉中神经酰胺的提取分离方法，其特征在于：步骤（3）所述萃取压力35～50Mpa，萃取温度为40～55℃，萃取时间为1～2小时，CO2流速为10～25L/h；所述分离压力为8～12Mpa，分离温度40～55℃。
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2014
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