CN1037518A - 大分子物质的干燥方法 - Google Patents

Abstract

一种用于干燥生物大分子材料的方法，任选地在 有稳定剂存在的情况下干燥上述生物大分子材料的 水溶液或悬浮液，本方法的特征是，在有一种或多种 易风化的碱金属盐、铵盐或碱土金属盐存在的条件下 配制上述水溶液或悬浮液，然后进行干燥。

Description

本发明涉及用于干燥生物材料（例如蛋白质）以及其它大分子物质、病毒等的一种改进的方法，特别是涉及一种获得干燥制品的方法，该干燥制品无须密封或精心贮存即可以保持干燥。本发明还涉及用这种方法制备的干燥制品。

在出版物上曾公开发表过多种用于干燥生物材料的方法。例如，在GB2009198A、GB2126588A和JP58074696A中描述了从含有各种糖的溶液中冷冻干燥某些生物材料，这些糖包括海藻糖、葡萄糖、半乳糖。我们以前的专利PCT/GB86/00396中描述了使用海藻糖来稳定这些材料以防止在室温和较高温度下干燥时发生损害。此外，我们的英国专利申请8801338中描述了使用海藻糖来稳定新鲜病毒、避免冷冻和干燥（冷冻或在室温下）时的损伤。我们的英国专利申请8715238描述了在食物制品中包含海藻糖。从而，现在可以安全地干燥包括免疫组分、病毒、酶和荧光剂以及蛋白质或其它食品原料在内的所有生物材料。

这类方法的一个常见的、几乎是不可避免的问题是，这些配制品需要在无水条件下贮存在带有干燥剂的密封容器中。之所必须这么做是因为，大分子物质（例如抗体、酶等）和碳水化合物（例如海藻糖、蔗糖等）在经过干燥后都是吸水的，此外，通常存在的离子缓冲剂含有易潮解的盐。所有这些因素结合在一起，促使其从潮湿的环境中吸收水分。其结果是，经过干燥的材料一旦在潮湿的气氛中打开包装，干燥的大分子物质就面临着极其高渗水的状态。

这意味着，这些配制品在贮存条件不完善时容易损坏，它们的稳定性可能会由于操作不够尽善尽美而打折扣。在实践中，由于冷藏保存生物活性分子的传统作法，常常会发生上述情况。任何时候，只要一打开冰箱的门，大气中的水分就会在冷的制品上凝结。此外，在潮湿或热带气候中，这些制品也是非常不稳定的。

本发明提供了一种简便的方法，依靠分子的作用原理，从干燥的大分子制品、特别是用糖保护防止干燥损伤的大分子制品中除去吸收的水分。

根据本发明，提供了一种生物大分子材料的干燥方法，任选地在有稳定物质存在的条件下对上述生物大分子材料的水溶液或悬浮液进行干燥，其特征是，在有一种或多种易风化的碱金属盐、铵盐或碱土金属盐存在的条件下配制上述水溶液或悬浮液，然后对其进行干燥。

这种方法靠的是，用易风化的盐（如硫酸钠）来取代常规的缓冲剂/渗透压调节剂中的易潮解的盐（例如氯化钠）。这里所使用的“易风化”（efflorescent）这一术语，指的是在环境湿度下失去水分的盐，例如结晶水的蒸气压至少是15mm    Hg（2000Pa）的盐。根据需要干燥的材料的性质，可以使用各种不同的盐。当然，所用的盐与要进行干燥的材料必须是相容的。对于食品用途来说，已获准使用的添加剂乳酸钙是易风化的，可以适用于食品。可能在某些配方中获得应用的其它易风化的盐包括：

1.钠盐：三水合乙酸盐、十水合四硼酸盐（硼砂）、十二水合溴铱化物（bromoiridite    dodecahydrate）、七水合碳酸盐、三水合偏高碘酸盐、六水（或三水）合偏磷酸盐、十二水合正磷酸氢盐、七水合亚硫酸盐、五水合硫代硫酸盐（海波）。

2.非钠盐（在此适用）：乳酸钙水合物、四水合水扬酸镁、七水合硫酸镁（泻盐）和硫酸铵。

有些制品不含有添加的缓冲剂，例如象鸡蛋或牛奶这类食品，在这些制品中，无须取代缓冲剂盐，可以直接加入易风化的盐，但必须注意保持适当的摩尔浓度。

我们不打算被理论的研究所束缚，我们认为可以按以下所述来解释易风化盐的作用：

硫酸钠以十水合物Na₂SO₄·10H₂O（芒硝）的形式从水溶液中结晶出来。既使是在相当潮湿的环境中，该结晶水的蒸气压仍高于环境大气中水分的蒸气压，因此，这种盐象“泵”一样将水分从晶体中送入大气。含有硫酸钠晶体的收湿的干燥制品所吸收的水分，由这种可溶性盐吸收，然后，利用风化现象将其排到大气中。这样，在经过干燥的制品中以微晶形式存在的、均匀分布在整个干燥制品中的易风化盐就起到了“分子水泵”的作用。在经常暴露于潮湿环境的条件下，这种作用使经过干燥的制品仍然保持干燥状态。

硫酸钠溶解于过量的水中后，就得到pH值为中性的溶液，它在溶液中不具有活性，对细胞或组织不产生毒性。0.12M的溶液大体上与哺乳动物的血浆是等渗压的。它在所有重要的方面完全替代了生理的盐分氯化钠。

如果添加的盐是非常容易风化的，那么，分子水泵作用就可以有效地减少“干燥”制品中残留的水分。例如，含有硫酸钠而不是氯化钠的琼脂糖凝胶可以被干燥成透明、有韧性的薄膜，这种膜在中等湿度的大气条件下贮存时，有效地持续失水，从而以无水硫酸钠微晶的形式产生表面白化。这一过程毫无任何损害，该凝胶完全可以重新水化。

为了实际地说明这一干燥机制的作用过程，我们测定了在一个模型系统中水的实际吸收和解析情况。

实施例1

测定干燥的蛋白质膜在受控制的湿度及有吸湿的缓冲剂以及有易风化的缓冲剂存在的条件下的吸水率。

方法：

将无盐的牛血清白蛋白（BSA）在生理的达尔贝克（Dulbecco）磷酸盐缓冲盐水（PBS）中或在0.12M的硫酸钠溶液中配制成10%（重量/容积）的溶液。将1毫升左右该溶液的样品分散在予先称重的无菌的聚苯乙烯的组织培养级的陪替式培养皿中（Nunclon    60×15mm    Cat    No.1-50288），在温室（37℃）内无遮盖地静置48小时使之干燥。然后，用精确到小数点后5位的Mettler    HK60电子微量天平称重，得到蛋白质+缓冲剂的干重。

然后，把它们密封到用标准硫酸溶液（在CRC出版社出版的“化学和物理手册”第67版中有详细描述）将相对湿度控制在90%的气密的玻璃湿润箱内60小时，然后移出湿润箱，立即重新称量至小数点后第5位，测定吸收的水。

随后，将所有样品在处于室温和环境相对湿度的敞口的容器中贮存8天，再次称重，测定已吸收的水分被解析的效率。

结果：（表1）

这些结果表明，在相对湿度为90%的情况下，干燥的蛋白质吸收了很多水。在PBS缓冲剂中吸收的水（30.3%）比硫酸钠缓冲剂中吸收的（13.4%）要多得多。

请注意，在这个试验中BSA与缓冲剂的比例（约1∶1.7重量/重量）比通常试剂配方中的比例（约1∶17重量/重量）要高得多，因此，易风化的缓冲剂排除水的效率是接近于另人满意的。此外，不存在海藻糖或其它湿润剂。

表1

缓冲剂    总干重（mg）    总湿重（mg）    增水率（%）

P.B.S    222.0    289.2    30.3

Na₂SO₄314.7. 356.9 13.4

实施例2

将海藻糖在PBS或0.12M的硫酸钠溶液中配制成10%（重量/容积）的溶液，再配入荧光试剂R-藻红素（RPE）制成对于临床应用适宜的浓度（1mg/ml）的溶液，使用这一溶液建立第二类定量试验。这些试验按前一实施例中所述进行。

结果（表2）表明，在相对湿度为90%的情况下，在PBS缓冲剂中的经过干燥的RPE吸收了大量的水，吸收的水达RPE干重的20%以上。硫酸盐缓冲剂中的情况与此大不相同，吸收的水只有2.4%。这两种制品的外观有显著的差异。在PBS缓冲剂中，RPE变成液态，呈粘稠的糖浆状;而在硫酸盐缓冲剂中，经过干燥的RPE仍保持干燥，而且不发粘。在从湿润箱中取出并在室内空气的环境湿度下贮存4小时内，吸收的水从PBS制品中解析达到3.5-3.9%的程度。在这一过程中，大的缓冲剂晶体分离出来，留下高浓度的糖浆蛋白质收集物在陪替式培养皿中，产生了明显的相分离。正是这种伴随相分离而产生的反复的液化和干燥，给干燥的蛋白质造成损伤。

表2

缓冲剂    总干重（mg）    总湿重（mg）    增水率（%）

P.B.S    211.8    257.9    21.8

Na₂SO₄245.9 251.8 2.4

实施例3

作为这种缓冲剂系统在检验用的小动物身上的有效性的一个例子，我们选择了一个容易定量测定的免疫测定系统，使用该系统可以精确地测定在不十分完善的贮存条件下活性丧失的程度。试剂由生物素结合的蛋白质抗生蛋白链菌素〔由链霉菌属抗生物素蛋白（Streptomyces    avidinii）提纯得到〕与荧光性藻胆蛋白R-藻红素的结合体构成。将这结合体置于有96个小井的微量滴定板的平底小井中、在各种配方的缓冲剂中进行干燥，所述的缓冲剂含有海藻糖双糖作为彻底防止在干燥过程中结合体活性丧失的措施。

使用的缓冲剂配方为各种不同配比的标准磷酸盐缓冲盐水和0.1M硫酸钠，其范围从90%的前者与10%的后者直到90%的硫酸钠缓冲剂与10%的PBS。

含有这些制剂的微量滴定板在37℃的温室中干燥24小时，然后将这些板的样品在37℃或室温下贮存，或者放入冰箱中在4-10℃贮存，贮存时间为2个月。

检测上述经过干燥的制剂对用饱和量的生物素标记的单克隆小鼠抗大鼠CD4抗体W3/25（D.W.Mason，R.P.Arthur，M.J.Dallman，J.R.Green，G.P.Spickett    and    M.L.Thomas，1983，Immunological    Reviews，74    PP.57-82）标记的大鼠淋巴细胞染色的能力。用50μl蒸馏水使微量滴定板的各小井再水化，然后向每个小井中加入10⁶个大鼠淋巴结淋巴细胞的悬浮液，用这种方法制备出经过染色的制剂。淋巴细胞悬浮在含有10% Haemaccel作为蛋白质添加物（TCM）的完整的RPMI1640组织培养介质中。在4℃染色30分钟，接着在TCM中洗涤两次，然后在一台操纵功率300mw、488nm线的氩激光器的FACS420荧光活化的细胞分析器（Becton Dickinson，Sunnyvale，Calif.USA）中进行分析。

这些带有R-藻红素/抗生蛋白链菌素结合体的淋巴细胞的染色强度是该结合体活性的直接量度。以亮度的对数的形式将荧光强度记录下来，X轴是荧光强度，Y轴是细胞数目，这样，活性的降低就表现为明亮的荧光细胞出现频率最高的值（峰值）向左移动。结果：

在室温下或置于冰箱中在4-10℃贮存2个月后（图1a、b）含0.1M硫酸钠缓冲剂数量较少的缓冲剂明显地丧失活性。其活性的丧失与所含硫酸盐缓冲剂的量成反比。在90%硫酸盐的缓冲剂中，活性一点也没有丧失，而在50%硫酸盐的缓冲剂中，该结合体变成几乎完全不具有活性（图1和图2）。

反之，如果将该结合体置于一个干燥的温室中在37℃下贮存（图1c），则缓冲剂的配比对此几乎没有影响。在任一缓冲剂配方中，活性的丧失都是最小的。

所以，上述结合物活性的保持依赖于其干燥状态的保持，而要保持干燥状态，须将该结合物在干燥的环境（例如温室）中保存或者使用高浓度的硫酸钠缓冲剂，即使在潮湿的环境中，这种缓冲剂也可利用风化使经过干燥的结合体保持干燥状态。

实施例4

为了说明本方法在工业产品中的应用，在干燥状态中配制瞬时双色免疫荧光试验样品，具体作法是，将25μl结合到小鼠IgGi单克隆抗大鼠CD4抗体W3/25上的R-藻红素溶液和25μl结合到小鼠IgGi抗大鼠CD8抗体MRC    OX-8上的荧光素溶液（二者均溶于0.1M硫酸钠溶液中）与50μl10%的海藻糖在蒸馏水中的溶液，在微量滴定板的小井中混合，然后在37℃下干燥。该滴定板在室温下保持二个月，记录干燥的结合体产生明亮的双色免疫荧光染色同时对相关细胞群体产生完全、特定染色的能力。在没有海藻糖的情况下干燥的抗体几乎没有活性，与此相比，上述在有海藻糖存在的情况下干燥的抗体在所有方面（包括染色能力）均与新鲜的未经干燥的抗体一样好（图2a、2b、2c）。

图1-该图是W3/25标记的大鼠淋巴细胞的抗生蛋白链菌素/R-藻红素（SA/RPE）结合体染色的红色荧光的FACS420频率曲线。将SA/RPE结合体在平底的微量滴定板的小井中于37℃下在由0.1M硫酸钠和PBS的各种不同混合物组成的缓冲剂中进行了干燥。随后将它们在室温下或置于冰箱中在4-10℃下贮存二个月，或者放在温室中在37℃下贮存二个月，然后用来进行染色。

1a.在室温下贮存：随着硫酸盐缓冲剂的比例降低，染色能力的丧失逐渐增加。图中表示了90%、70%和50%缓冲剂的曲线。对于较低比例的硫酸盐缓冲剂，结合体完全没有活性。在90%缓冲剂中贮存使染色能力保持与新鲜的SA/RPE结合体的染色能力相等。

1b.在4-10℃下贮存：硫酸盐浓度为50%和70%的结合体的染色能力大大降低，而90%硫酸盐缓冲剂的染色能力保持不变。

1c.在37℃下贮存：在干燥气氛中贮存时，不需要高比例的硫酸盐缓冲剂就可以保持染色能力。

图2-使用干燥结合体的同时双色免疫荧光：

该图是偶联到RPE上的W3/25αCD4抗体与偶联到大鼠淋巴细胞上FITC上的MRC    OXB    αCD8抗体的混合体的FACS420分析的VDU荧光屏照片。照片上，X轴表示荧光，Y轴表示细胞数目。

FL2＝RPE上的红色荧光

FL1＝FITC的绿色荧光

上图：新鲜的结合体

中图：在0.1M含有10%海藻糖的硫酸钠中干燥并在室温下贮存一个月然后染色的结合体

下图：在没有海藻糖的情况下在0.1M硫酸钠缓冲剂中干燥过的结合体。该图表明了染色能力的丧失。在室温下贮存时，硫酸钠缓冲剂使海藻糖干燥的结合体保持住原有的染色能力，但它不能取代海藻糖起结合体保护剂的作用。

实施例5

重量分析试验

方法：

模型系统由1毫升1%的牛血清白蛋白与10%的海藻糖在10mM    pH7.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）氯化物缓冲剂中的溶液构成，缓冲剂中加入了适当浓度的试验盐。将上述混合物置于疏水的塑料盘中在3°干燥24小时，干燥前予先在一台顶盘式天平上称重，称量精度达到1毫克，干燥之后再次称重，然后将其转移到密闭室中，该密闭室中的相对湿度用各种盐的饱和溶液（详见“Handbook    of    Chemistry    and    physics”67th    edition    pE-42    R.C.Weast    editor（1986）CRC    Press    Paton    Fla.USA.）控制在20-22℃。每间隔一段时间取出该塑料盘并立即称重。大约120小时后，将它们返回到环境的温度和相对湿度，此后每间隔一段时间称量一次重量直至它们的重量趋于稳定。

试验结果以各个称重时间的重量作为起始重量的百分数的形式标绘出来。

试验过的其它易风化盐

1.七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）

结果：引起蛋白质沉淀，因此不能用于这种用途。

2.五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）

结果：引起蛋白质沉淀，因而不能用于这种用途。

3.十二水合正磷酸氢二钠（Na₂PO₄·12H₂O）

将BSA溶于200mM和300mM的溶液中，将这些溶液置于37°的恒温室中在相对湿度约47%的条件下干燥，24小时后将它们从37°的恒温室中移至相对湿度分别为51%、80%或90%的湿润箱中。在所有三种相对湿度的条件下均吸收了水分。这可能是由于，上述十二水合物晶体在37°下失水变成二水合物，随后，该二水合物在较潮湿的环境中吸收水分变成七水合物形式。这种形式是在环境温度和湿度的条件下比较稳定的形式。这一点可以由以下事实得到证实：从理论上讲，1ml 300mM的二水合正磷酸氢二钠吸收1.5×10^-3克分子的水就形成七水合物。吸收水的重量等于27mg，这恰好是与环境湿度平衡的磷酸盐干燥的混合物重量的增加量。

在相对湿度为90%的条件下，这一混合物重量增加了50%，而在相对湿度为80%时只增加了20%，相对湿度为51%时增加约15%。在144小时的时候将其移回室内空气环境，此时，吸收的水分很快失去，重量稳定在37°起始重量的115-120%左右（图3）。

4.十水合硫酸钠（Na₂SO₄·10H₂O）

将BSA溶于200mM或300mM硫酸钠中。由37°的室内相对湿度移至湿润箱时，在51%或80%相对湿度下没有吸收水，只有在90%的相对湿度时吸收了相当于起始重量50%的水。当返回到室内空气环境时，这些水很快失去（图4）。

5.氯化钠（NaCl）〔作为对比物，不是易风化的〕

在由37°转移至51%相对湿度时，混合物没有吸收水。在80%相对湿度下吸收水分为起始重量的50%，在90%相对湿度时吸收水分为起始重量的100%。当回到室内空气环境中时，又很快失去水分（图5）。

小结：

在图6、图7和图8中的每一曲线上给出了在不同的相对湿度条件下的数据作为氯化物、硫酸盐和磷酸盐的比较。

与中性的（非吸湿的、不易风化的）盐氯化钠相比，在80%相对湿度下正磷酸氢二钠和硫酸钠由于BSA和海藻糖的吸湿混合物而吸收水，在90%的相对湿度下，它们减少吸水50%。因此，如果把七水合物形式（稳定的形式）的盐的结晶水考虑在内的话，磷酸盐缓冲剂在90%的相对湿度下有效地限制水的吸收。

在20℃，这些盐施加等效于以下相对湿度的水蒸气张力：

水蒸气张力（MmHg）    相对湿度

NaCl    4.5    35%

Na₂HPO₄·12H₂O 16.5 95%

Na₂SO₄·10H₂O 16.1 93%

因此，在这些盐本身结晶水的蒸气压或高于该蒸气压的相对湿度下它们将吸收水，而在低于上述蒸气压的相对湿度下它们不吸收水。由于这一原因，Na₂SO₄是理想的盐，因为它在溶液中是中性的，没有毒性、与生物分子不起反应，它具有正常的咸味，在最高达80-90%的相对湿度下，它保护海藻糖干燥的生物分子免受潮气的损害。

正磷酸氢二钠是另一个具有潜在的、更高一些的保护作用的有效盐的例子。但它因有某种缺点而受到损害，这个缺点是，降低pH将会导致生成轻微潮解的正磷酸二氢钠。如果不去调整pH值，磷酸氢二钠的水溶液是碱性的，pH值为9.5左右。所以，这种盐不适用于要求生理的pH7.4的生物分子。

Claims (6)

1、一种干燥生物大分子材料的方法，任选地在有稳定剂存在的条件下干燥上述材料的水溶液或悬浮液，其特征是，在有一种或多种易风化的碱金属盐、铵盐或碱土金属盐存在的情况下配制上述水溶液或悬浮液，然后进行干燥。

2、按权利要求1所述的方法，其中易风化的盐取代氯化钠或其它收湿的盐在所述溶液或悬浮液中作为渗透压调节剂和/或缓冲剂。

3、按权利要求1所述的方法，其中所述的易风化盐选自下列钠盐：

硫酸盐、三水合乙酸盐、十水合四硼酸盐、（硼砂）、十二水合溴铱化物、七水合碳酸盐、三水合偏高碘酸盐、六水合（或三水合）偏磷酸盐、十二水合正磷酸氢盐、七水合亚硫酸盐、五水合硫代硫酸盐（海波），或者选自下列非钠盐：

乳酸钙水合物、四水合水扬酸镁、七水合硫酸镁（泻盐）和硫酸铵。

4、按权利要求1所述的方法，其中易风化的盐是硫酸钠或磷酸氢二钠。

5、按权利要求1所述的方法，其中要进行干燥的溶液或悬浮液含有糖作为稳定剂。

6、按权利要求5所述的方法，其中所述的糖是海藻糖。

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