CN103706800A

CN103706800A - 一种在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法

Info

Publication number: CN103706800A
Application number: CN201410018780.2A
Authority: CN
Inventors: 刘楠; 张威; 罗安娜; 王英元; 冯晓民; 何声宝; 闫新甫
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2014-04-09

Abstract

一种在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，也即基于基因修饰的TMVCP模板的一维金纳米复合材料的制备方法，其特征在于：是以基因修饰的TMVCP为模板，通过其与含金元素基团的静电作用，在其表面吸附含金元素基团，最后加入还原剂，从而实现了纳米金在基因修饰的TMVCP模板表面的生长，得到了新型的TMVCP-纳米金一维复合材料。结果表明，与在未经基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长相比，在基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长，纳米金在模板表面的生长密度得到较大提升，可望对TMVCP-纳米金一维复合材料的应用产生积极影响。

Description

一种在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法

技术领域

本发明涉及有机-无机复合材料研究领域，具体说是一种在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，也即一种基于基因修饰的TMVCP模板的一维金纳米复合材料的制备方法，利用本发明提供的方法，可提升TMVCP-纳米金复合材料的一维化程度和纳米金在TMVCP模板表面的生长密度，可望对TMVCP-纳米金一维复合材料的应用产生积极影响。

背景技术

烟草花叶病毒（TMV），是烟草花叶病得病原体，对烟叶生长危害极大，目前有关烟草花叶病毒的研究多以防治烟草花叶病相关(例如专利：银杏内酯B在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用（申请号201010291033.8）；专利：柴胡皂苷A在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用（申请号201010291073.2），专利：6-O-咖啡酰基飞蓬苷在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用（申请号201010291012.6）)。

近年来，有研究者开始将TMV在材料研究领域进行应用。TMV外壳蛋白（CP）以其纳米管状的几何外形、高活性的内外表面被认为是一种理想的构筑低维材料的模板（R. Tsukamoto, M. Muraoka, M. Seki, H. Tabata, I. Yamashita. Chem. Mater., 2007, 19: 2389；E. Dujardin, C. Peet, G. Stubbs, J. N. Culver, S. Mann. Nano Lett., 2003, 3: 413；M. Knez, M. Sumser, A. M. Bittner, C. Wege, H. Jeske, T. P. Martin, K. Kern. Adv. Funct. Mater., 2004, 14: 116.），目前以TMVCP为模板，已经进行了多种纳米材料的生长，最终得到的复合材料被认为可在信息存储、光捕集以及传感器等领域有应用的潜力（R. J. Tseng, C. Tsai, L. Ma, J. Ouyang, C. S. Ozkan, Y. Yang. Nature Nanotechnology, 2006, 1: 72；R. A. Miller, A. D. Presley, M. B. Francis. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129: 3104；T. L. Schlick, Z. Ding, E. W. Kovacs, M .B. Francis. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127: 3718）。

一般来说，TMVCP的组装体在分散介质中存在多种可能的状态（A. Klug. Philos Trans R. Soc. London B, 1999, 354: 531），调控体系pH值、离子强度以及温度等条件，可以使得TMVCP处于某几种状态的动态平衡中，这就使得TMVCP在具体应用中呈现出结构的不连续性，不利于发挥其作为模板材料的功能。本专利申请案的发明人在前期研究中，已经通过分子生物学的方法，对TMVCP进行了基因修饰，改善了TMVCP模板的结构均一性，并已申请了中国专利：一种烟草花叶病毒壳蛋白模板结构修饰方法，申请号201210336227.4。而在本专利申请中，发明人则进一步以基因修饰的TMVCP为模板，进行了纳米金的生长。也即前一专利申请的续篇，对前一专利申请得到的结果进行了更深一步的改善，结果表明，与在未经基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长相比，在基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长，纳米金在模板表面的生长密度得到较大提升，可望对TMVCP-纳米金一维复合材料的应用产生积极影响。

发明内容

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，也即基于基因修饰的TMVCP模板的一维金纳米复合材料的制备方法，是以基因修饰的TMVCP为模板，通过其与含金元素基团的静电作用，在其表面吸附含金元素基团，最后加入还原剂，从而实现了纳米金在基因修饰的TMVCP模板表面的生长，得到了新型的TMVCP-纳米金一维复合材料。具体步骤如下：

（1）以六聚组氨酸（His-tag）对烟草花叶病毒壳蛋白TMVCP进行基因修饰，得到基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板His-TMVCP，将His-TMVCP分散于去离子水中，得到浓度约为0.3~0.5 mg/mL的悬浮液。

（2）将10~15 mL此悬浮液、5~7 mL乙酸溶液、0.3~0.5 mL氯金酸溶液一同置于反应容器中，在避光条件下搅拌2~3 h。其中乙酸溶液的质量浓度为5%，氯金酸溶液浓度为0.01 M。

（3）将1~1.5 mL的水合肼溶液加入反应物中，室温下将反应物静置2~3 h。其中水合肼溶液浓度为10^-3M。

（4）用去离子水、以离心的方法对产物进行多次洗涤、提纯，得到深棕色絮状产物即本发明的目标产物，将该产物再次分散于去离子水中，得到含有目标产物的悬浮液，以便进行透射电镜（TEM）表征（见附图）,该目标产物即为基于基因修饰的TMVCP模板的一维金纳米复合材料。

本发明步骤（1）中所述的基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板His-TMVCP是通过以下方法制备的：①两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白（WT-TMV-CP），上游引物TMVCP F1，GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物His-TMV-CP R1，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC。②PCR产物使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体。③ 在羧基端含有6*His 标签的含有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达。④上柱纯化蛋白时，首先以50 mL预冷缓冲液冲洗柱子（50 mM磷酸钾，300 mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，10 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0）随后，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子（50 mM磷酸钾，300 mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，40 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0），最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白（50mM磷酸钾，300mM氯化钾，1 mM PMSF，10 mM β-巯基乙醇，500 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0）。

本发明通过基因修饰的TMVCP模板与含金元素基团的静电作用，以化学沉积的方法，在基因修饰的TMVCP模板表面进行了纳米金的生长，实现了基因修饰的TMVCP与纳米金的复合，与在未经基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长相比，纳米金在模板表面的生长密度得到较大提升。

附图说明

图1为基于His-TMVCP模板生长的纳米金透射电镜（TEM）照片。

图2为基于未经基因修饰的TMVCP模板生长的纳米金透射电镜（TEM）照片。

从图（1）和图（2）的对比可以看出，与在未经基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长相比，在基因修饰的TMVCP模板上进行纳米金的生长，纳米金在模板表面的生长密度的到较大提升。

具体实施方式

本发明以下结合具体实施例作进一步描述：

实施例1

（1）以六聚组氨酸（His-tag）对TMVCP进行基因修饰，得到的产物以His-TMVCP表示，制备过程如前面发明内容中所述（也可具体参照已公开的中国专利201210336227.4中的方法），将His-TMVCP分散于去离子水中，得到浓度约为0.3 mg/mL的悬浮液。

（2）将10 mL的His-TMVCP悬浮液、5 mL乙酸溶液、0.3 mL氯金酸溶液一同置于反应容器中，在避光条件下搅拌2 h。其中乙酸溶液的质量浓度为5%，氯金酸溶液浓度为0.01 M。

（3）将1 mL的水合肼溶液加入反应物中，室温下将反应物静置2 h。其中水合肼溶液浓度为10^-3M。

（4）用去离子水、以离心的方法对产物进行多次洗涤、提纯，得到深棕色絮状产物，将该产物再次分散于去离子水中，得到含有目标产物的悬浮液，而后进行电镜表征。

实施例2

（1）以六聚组氨酸（His-tag）对TMVCP进行基因修饰，得到的产物以His-TMVCP表示，将His-TMVCP分散于去离子水中，得到浓度约为0.4 mg/mL的悬浮液。

（2）将15 mL此悬浮液、6 mL乙酸溶液、0.4 mL氯金酸溶液一同置于反应容器中，在避光条件下搅拌2 h。其中乙酸溶液的质量浓度为5%，氯金酸溶液浓度为0.01 M。

（3）将1.5 mL的水合肼溶液加入反应物中，室温下将反应物静置2~3 h。其中水合肼溶液浓度为10^-3M。

实施例3

（1）以六聚组氨酸（His-tag）对TMVCP进行基因修饰，得到的产物以His-TMVCP表示，将His-TMVCP分散于去离子水中，得到浓度约为0.5 mg/mL的悬浮液。

（2）将15 mL此悬浮液、7 mL乙酸溶液、0.5 mL氯金酸溶液一同置于反应容器中，在避光条件下搅拌3 h。其中乙酸溶液的质量浓度为5%，氯金酸溶液浓度为0.01 M。

（3）将1.5 mL的水合肼溶液加入反应物中，室温下将反应物静置3 h。其中水合肼溶液浓度为10^-3M。

实施例4

（1）以六聚组氨酸（His-tag）对TMVCP进行基因修饰，得到的产物以His-TMVCP表示，将His-TMVCP分散于去离子水中，得到浓度约为0.3 mg/mL的悬浮液。

（2）将10 mL此悬浮液、6 mL乙酸溶液、0.4 mL氯金酸溶液一同置于反应容器中，在避光条件下搅拌3 h。其中乙酸溶液的质量浓度为5%，氯金酸溶液浓度为0.01 M。

（3）将1.2 mL的水合肼溶液加入反应物中，室温下将反应物静置2 h。其中水合肼溶液浓度为10^-3M。

Claims

1.一种在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，也即基于基因修饰的TMVCP模板的一维金纳米复合材料的制备方法，其特征在于：是以基因修饰的TMVCP为模板，通过其与含金元素基团的静电作用，在其表面吸附含金元素基团，最后加入还原剂，从而实现了纳米金在基因修饰的TMVCP模板表面的生长，得到了新型的TMVCP-纳米金一维复合材料。

2.根据权利要求1所述的在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

（1）以六聚组氨酸（His-tag）对烟草花叶病毒壳蛋白TMVCP进行基因修饰，得到基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板His-TMVCP，将His-TMVCP分散于去离子水中，得到浓度约为0.3~0.5 mg/mL的悬浮液；

（2）将10~15 mL此悬浮液、5~7 mL乙酸溶液、0.3~0.5 mL氯金酸溶液一同置于反应容器中，在避光条件下搅拌2~3 h；

（3）将1~1.5 mL的水合肼溶液加入反应物中，室温下将反应物静置2~3 h；

（4）用去离子水、以离心的方法对产物进行多次洗涤、提纯，得到深棕色絮状产物即本发明的的目标产物，将该产物再次分散于去离子水中，得到含有目标产物的悬浮液，该目标产物即为基于基因修饰的TMVCP模板的一维金纳米复合材料。

3.根据权利要求1所述的在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，其特征在于：步骤（2）中的乙酸溶液的质量浓度为5%，氯金酸溶液浓度为0.01 M。

4.根据权利要求1所述的在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，其特征在于：步骤（2）中的水合肼溶液浓度为10^-3M。

5.根据权利要求1所述的在基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板上进行纳米金生长的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的基因修饰的烟草花叶病毒壳蛋白模板His-TMVCP是通过以下方法制备的：①两条引物被用来扩增TMV外壳蛋白（WT-TMV-CP），上游引物TMVCP F1，GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物His-TMV-CP R1，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC；②PCR产物使用T4DNA连接酶连接进入pET28a载体；③ 在羧基端含有6*His 标签的含有确定DNA序列的His-TMV-CP质粒被亚克隆进原核表达菌株Rosetta中进行蛋白表达；④上柱纯化蛋白时，首先以50 mL预冷缓冲液冲洗柱子,随后，再以冲洗缓冲液-40冲洗柱子，最后，使用洗脱缓冲液来洗脱目标蛋白。