CN103695471A - 一种将microRNA转染到血小板中的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将microRNA转染到血小板中的方法，包括如下步骤：a）将待转染microRNA与脂质体制混匀，得混合溶液；b）在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将步骤a的混合溶液与血小板共培养，培养时间为12～36h，离心，收集血小板，即可。本发明方法可以有效地将microRNA转染至血小板中，克服了现有技术的缺陷。

Description

一种将microRNA转染到血小板中的方法

技术领域

本发明涉及一种将microRNA转染到血小板中的方法。 

背景技术

血小板是体内血栓形成的关键成分之一，在心血管疾病（增殖、血栓形成和血栓栓塞）、炎症和部分肿瘤等多种病理生理进程中扮演重要角色。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。 

研究表明，血小板内包含大量miRNAs，部分与体内纤溶、凝血过程相关的血小板miRNAs可能是体内血栓形成潜在的分子标志物。 

然而，由于血小板内部缺乏细胞核和基因组DNA，使得血小板内直接转染miRNA技术异常困难，使得血小板miRNA标志物的研究一直停滞不前，急需寻找一种能够将miRNA直接导入血小板中的方法。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种将microRNA转染到血小板中的方法。 

本发明将microRNA转染到血小板中的方法，包括如下步骤： 

a）将待转染microRNA与脂质体制混匀，得混合溶液； 

b）在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将步骤a的混合溶液与血小板共培养，培养时间为12～36h，离心，收集血小板，即可。 

microRNA(miRNA)是一类长度约为20-24个核苷酸的小RNA。 

步骤a)中，所述脂质体为阳离子脂质体。优选地，所述阳离子脂质体是siPORTTMNeoFXTM或Lipofectamine2000。 

步骤a）所述混合溶液中，microRNA的浓度为0.7～0.8mol/L，脂质体的浓度为5～7%（v/v）。优选地，所述microRNA的浓度为0.74mol/L，脂质体的浓度为5.9%（v/v）。 

步骤a）中，混匀的方法如下：将脂质体和待转染microRNA混合，在温度为15～25℃，震荡频率为50～70Hz的条件下，放置10～30min，即得混合溶液。优选地，所述温度为22℃，震荡频率为60Hz，放置时间为20min。 

步骤b）中，所述培养时间为24h。 

本发明还提供了前述任意一项所述方法制备的血小板。 

发明人在前期试验中，采用常规的脂质体转基因方法转染miRNA至血小板中，即将miRNA与脂质体混合，形成混合物，再在37℃与血小板共培 养，然而，经检测发现，该种方法难以有效地将microRNA转入血小板中。 

发明人也是偶然发现，在温度为22℃，振荡频率为60Hz条件下，将microRNA与脂质体混合物，与血小板共培养，可以将microRNA转入血小板中。 

另外，发明人通过筛选实验发现，只有在温度为22℃，振荡频率为60Hz条件下才能有效转染，培养温度和震荡频率有微小变动，则难以达到目的。 

本发明方法可以将microRNA导入血小板中，使得血小板miRNA的功能鉴定成为可能，同时为筛选血小板的miRNA治疗药物提供了体外筛选体系，临床应用前景良好。 

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

附图说明

图1血小板中miR-30c含量检测结果图，其中，NC表示空白组，miRNA-30c表示转染miRNA-30c后血小板的含量，Anti-miRNA-30c表示转染Anti-miRNA-30c后血小板的含量。 

图2血小板内PAI-1含量检测结果图，其中，NC表示空白组，miRNA-30c表示转染miRNA-30c后血小板的含量，Anti-miRNA-30c表示转染Anti-miRNA-30c后血小板的含量。 

具体实施方式

实施例1本发明在血小板内转染microRNA的方法 

取脂质体siPORTTMNeoFXTM和待转染microRNA，分别制成溶液，混合，在温度为15℃，震荡频率为50Hz的条件下，放置10min，得混合液，混合液中microRNA的浓度为0.7mol/L，脂质体的浓度为5%（v/v）； 

在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将前述混合液与血小板共培养，培养时间为12h，离心，收集血小板，即可。 

实施例2本发明在血小板内转染microRNA的方法 

取脂质体Lipofectamine2000和待转染microRNA，分别制成溶液，混合，在温度为25℃，震荡频率为70Hz的条件下，放置30min，得混合液，混合液中microRNA的浓度为0.8mol/L，脂质体的浓度为7%（v/v）； 

在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将前述混合液与血小板共培养，培养时间为36h，离心，收集血小板，即可。 

实施例3本发明在血小板内转染microRNA的方法 

取脂质体Lipofectamine2000和待转染microRNA，分别制成溶液，混合，在温度为22℃，震荡频率为60Hz的条件下，放置20min，得混合液，混合液中microRNA的浓度为0.74mol/L，脂质体的浓度为5.9%（v/v）； 

在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将前述混合液与血小板共培养，培养时间为36h，离心，收集血小板，即可。 

以下采用实验例的方式验证本发明方法可以将microRNA有效转入血小板中： 

实验例1 

血小板中存在miR-30c，其可以下调PAI-1（纤溶酶原激活物抑制物1）的表达。若在血小板中导入miR-30c，血小板中miR-30c的含量应当增加，PAI-1表达应当下调；若在血小板中导入anti-miR-30c（反义miR-30c），血小板中miR-30c的表达应当被抑制，PAI-1的表达应当上调。 

因此，如下实验采用本发明方法转染miR-30c和anti-miR-30c（反义miR-30c）的，通过检测miR-30c的表达量和PAI-1的表达量，验证转染是否成功。 

miR-30c的序列：uguaaacauccuacacucucagc； 

anti-miR-30c的序列：cugggagaaggcuguuuacucu。 

一、实验材料： 

健康人外周血加入加入枸橼酸葡萄糖（85mM柠檬酸三钠；78mM柠檬酸，111mM葡萄糖）抗凝；乙二胺四乙酸（EDTA）；3ml Tyrode’s缓冲液(containing138mM NaCl,5.5mM dextrose,12mM NaHCO₃,0.8mMCaCl₂,0.4mM MgCl₂,2.9mM KCl,0.36mM Na₂HPO₄and20mM Hepes,pH7.4)；1μM prostaglandin I2；高速冷冻离心机（Eppendorf Centrifuge5804R），自动凝胶成像系统Gel DocXR+（美国BIO-RAD公司），ND-1000微量紫外可见分光光度计（美国NanoDrop公司），超净工作台（SW-CJ），超低温冰箱(Thermo-80℃)，mirVanaTM miRNA Isolation Kit、siPORTTMNeoFXTM、miR-30c、anti-miR-30c及其阴性Negative Control（美国Ambion公司），DEPC（美国Invitrogen公司），E.coli poly(A)Polymerase、rATP（NEB公司），逆转录试剂盒（TaKaRa公司），20bp DNA Ladder Marker、2×Taq PCR Master Mix等（北京天根生化科技公司），荧光素酶检测试剂盒（Promega），HEK293细胞系(ATCC)；酶标仪（赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）、寡核苷酸序列、PCR引物合成和序列测序（Invitrogen公司）；lipofectamine2000 （Invitrogen公司） 

二、实验方法 

（一）、血小板准备： 

采用梯度离心法，取健康志愿者外周血按1：9比例加入枸橼酸葡萄糖溶液（85mM柠檬酸三钠；78mM柠檬酸，111mM葡萄糖）后200g条件下离心10min，吸取上清富含血小板血清（PRP）。 

将PRP进一步1000g离心10min使血小板沉淀后，加入3ml Tyrode’s缓冲液(138mM NaCl,5.5mM dextrose,12mM NaHCO₃,0.8mM CaCl₂,0.4mM MgCl₂,2.9mM KCl2，0.36mM Na₂HPO₄和20mM Hepes,pH7.4)，再加入1μM前列腺素I2（prostaglandin I2），重悬于Tyrode’s缓冲液中清洗3次后沉淀血小板，血小板（2×10⁸个/ml）混悬于培养液DMEM中待用。 

（二）、血小板内转染

miR-30c组：采用如下方法转染miR-30c后的血小板；anti-miR-30c组（反义miR-30c）：采用如下方法转染anti-miR-30c后的血小板；以未处理血小板作为空白对照。 

转染程序如下： 

a)取血小板； 

b)将siPORT^TMNeoFX^TM转染试剂60μl，与690μl的DMEM培养基混匀，室温22℃孵育5min； 

c)245μl的DMEM培养基中加入15μl的50μM浓度的miR-30c使终浓度为50nM(或15μl的50μM浓度的anti-miR-30c，使终浓度50nM)，轻柔混匀后室温22℃下放置5min。 

d)将上述b和c混合，并22℃轻摇（震荡频率为60Hz）20min后，按每孔500μl/加入6孔板待用； 

e）取a步血小板悬液按每孔1500μl/孔覆盖在上述混液上，前后轻轻晃动培养板以充分混匀，继续室温22℃振荡培养，振荡频率60Hz； 

f)转染振荡培养24h后，离心收集血小板。 

（三）、检测

利用茎环real-time RCR检测转染后miR-30c表达变化状况；荧光定量real-time RCR检测靶基因（PAI-1）mRNA表达变化。 

小分子RNA提取方法： 

首先在转染后收集的血小板中加入2ml Lysis/Binding Buffer，并充分混匀后，加入0.2ml miRNA匀浆添加剂（Homogenate Additive），充分混匀，冰上静置10min；然后加等体积的酸-苯酚氯仿（Acid-phenol chloroform），在涡流振荡器（Vortex）上振荡30-60s；室温下10,000g离心5min，以分 离水相和有机相，此时移取上层液体到另一离心管，并确定移取的上层液体体积。准确加入1/3体积的常温保存的无水乙醇，并混匀后加入到滤芯（Filter Cartridge）中在10,000g条件下离心15s并收集滤液，此步滤芯（Filter Cartridge）中可吸附mRNA。然后收集滤液，再准确加入2/3体积的常温保存的无水乙醇，并混匀后加入到滤芯（Filter Cartridge）中在10,000g条件下离心15s，弃滤液，此步滤芯（Filter Cartridge）中可吸附≤200nt小分子RNA。分别取吸附mRNA的滤芯（Filter Cartridge）和吸附≤200nt小分子RNA的滤芯（Filter Cartridge），加入700μl洗涤液（Wash solution）1后在10,000g条件下离心5-10s，并弃滤液；再加入500μl洗涤液（Wash solution）2/3后10,000g5-10s离心并弃滤液后，10,000g空转1min，去处残留的洗涤液（Wash solution）；将滤柱移至另一收集管（Collection Tube）中，加入100μl95℃预热的洗脱液（Elution Solution）并以10,000g20-30s离心收集滤液，即为血小板mRNA。 

Ⅰ、血小板中miR-30c含量检测 

1.引物的设计与合成：根据miR-30c的序列信息，设计、合成RT引物和PCR扩增引物。 

反转录引物设计：在固定茎环结构： 

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC序列后面加上候选miRNAs最后6个碱基的互补序列，形成颈环结构RT引物。 

PCR引物设计：miR-30c经颈环RT逆转录之后，Reverse prime引物为茎环结构上固定序列，引物序列为：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。Forward primer（GCTGCGCTGTAAACATCCTACACT）为候选miRNAs除去茎环逆转录所加碱基的剩余序列，并在5'端增加若干GC碱基以调适TM值。 

2.miR-30c的茎环RT逆转录：利用上述逆转录引物，通过逆转录试剂盒（Takara）进行逆转录反应，获得候选miRNAs特异性Stem-loop-cDNAs模板。 

3.miR-30c的实时荧光定量PCR检测：以人U6为内参标准，分别以miR-30c的茎环RT逆转录产物为模板，利用SYBR green荧光定量方法检测miR-30c特异性表达情况。 

利用BIO-RAD IQ5荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，各样品均设置3个平行反应。反应体系:样品cDNA/U6/miRNA的标准品2μl，SYBR Premix Ex Taq（2×conc）10μl，10uM的引物各1μl(Table1)，补RNase-Free水至20μl。反应程序：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次，72℃延伸3min后，60℃到95℃绘制融解曲线，71Cycle(每个循环降0.5℃)，2-ΔΔCt方法计算相对表达量。 

Ⅱ、荧光实时定量PCR检测血小板中PAI-1RNA含量 

1、逆转录 

1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液. 

2）将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性； 

3）在该PCR管中加入下列试剂（Promega） 

4）将上述20μl反应溶液30℃保温10min； 

5）42℃保温60min； 

6）85℃保温10mn。 

2、定量PCR 

1）检测序列片段大小 

内参片段:18srRNA-112bp 

目的片段:PAI-1-262bp 

2）设计的引物： 

3）反应体系： 

4）反应条件： 

50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s读板，40cycles； 

融解曲线分析：温度60℃-95℃。 

每个样重复3次 

定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen公司 

定量PCR仪：ABI

7500Sequence Detection System 

三、实验结果 

检测结果如图1和图2所示： 

与空白对照相比，miR-30c组中，血小板的miR-30c的含量增加（图1），同时靶标PAI-1mRNA表达显著下调（图2），说明miR-30c组血小板中，含有外源转入miR-30c； 

与空白对照相比，anti-miR-30c（反义miR-30c）组中，血小板的miR-30c的表达被抑制（图1），同时靶标PAI-1mRNA表达显著上调（图2），说明anti-miR-30c组血小板中，含有外源转入anti-miR-30c。 

实验结果说明，本发明方法可以有效地将microRNA导入血小板中。 

综上，本发明方法可以有效地将microRNA转染至血小板中，使得血小板miRNA的功能鉴定成为可能，同时为筛选血小板的miRNA治疗药物提供了体外筛选体系，促进相关药物的研发进程。 

Claims (9)

1.一种将microRNA转染到血小板中的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a）将待转染microRNA与脂质体制混匀，得混合溶液；

b）在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将步骤a的混合溶液与血小板共培养12～36h，离心，收集血小板，即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述脂质体为阳离子脂质体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述阳离子脂质体是siPORTTMNeoFXTM或Lipofectamine2000。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a）所述混合溶液中，microRNA的浓度为0.7～0.8mol/L，脂质体的浓度为5～7%（v/v）。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述混合溶液中，microRNA的浓度为0.74mol/L，脂质体的浓度为5.9%（v/v）。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a）所述混匀的方法如下：将脂质体和待转染microRNA混合，在温度为15～25℃，震荡频率为50～70Hz的条件下，放置10～30min，即得混合溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述温度为22℃，震荡频率为60Hz，放置时间为20min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b）中，所述共培养的时间是24h。

9.权利要求1～8任意一项所述方法制备的血小板。

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