CN103687870A - 用于移植和移植物排斥的体外预后和诊断的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型肽、它们的衍生物和包含其的组合物，它们作为移植器官疼痛、尤其是移植或移植物排斥的预后或诊断中的工具的用途。

Description

用于移植和移植物排斥的体外预后和诊断的生物标志物
本发明涉及新型肽、它们的衍生物以及包含其的组合物，它们作为移植器官疼痛(distress)、特别是移植或移植物排斥的预后或诊断中的工具的用途。
肾在活生物体中的主要功能是清除血液的废弃物或毒性物质。肾损伤可损害肾结构(肾小球或小管细胞缺失、纤维化和肾脉管系统改变)，这导致慢性肾排泄功能障碍(Lopez-Novoa等人,J Transl Med2011,9:13)。慢性肾病的演化可通过关键病理事件例如肾单位功能活性的百分比、肾小球滤过率、肾排泄功能或通过血浆和尿生物标志物(肌酸酐、尿酸……)的测量来监测。按照肾功能障碍和肾损伤将慢性肾病的进展分成了5个阶段(Levey等人,Ann Intern Med2003,139,137-147)。阶段1通常是其中肾功能障碍可被逆转的沉默期，而晚期的阶段4和阶段5对应于肾衰竭，并且需要肾替代疗法例如透析或任何可行时的肾移植。
器官移植也可在其它器官系统例如循环系统(心脏)、消化系统(肝)和呼吸系统(肺)中发生。患有白血病的患者还可接受软组织移植，即骨髓移植。
在欧洲每年进行超过15000例肾移植、5000例肝移植、2000例心脏移植和1000例肺移植。器官移植通常是用于最终状态器官衰竭的唯一治疗。细胞和组织例如造血干细胞或心脏瓣膜也用于移植来恢复基本功能。不利事件和反应例如移植或移植物排斥通常在接受者中发生。这可至少导致移植物的损害和最终导致其丧失。免疫抑制药物的使用通过调节接受者的免疫应答来帮助改善移植的结果。然而，这些药物诱导一组对于患者不利的事件，所述事件限制他们的生活质量或存活预期。最常见的副作用是肾毒性、癌症和心血管事件。
已鉴定了移植或移植物排斥所基于的分子机制。免疫排斥是通过抗提供者细胞的接受者T细胞的活化介导的。接受者T细胞识别提供者的主要组织相容性复合物(MHC)I类编码的抗原。T细胞和其它单核白细胞(例如B细胞和天然杀伤细胞)对移植器官的浸润通过活化补体系统和单核细胞而促成损害移植物。CD4+和CD8+T细胞均参与急性细胞排斥。抗提供者MHC I类和II类抗体的产生也与急性和慢性移植物损害相关。在慢性移植排斥中，接受者免疫应答的活化可能不是排斥的唯一原因。其它原因例如纤维化、病毒感染或原始疾病的复发可能在移植排斥中起重要作用(Sanchez-Fueyo等人,Gastroenterology2011,140,51-64)。
排斥发作通过常规临床参数来诊断，所述参数对于移植器官是特异性的并且取决于遗传因子，主要通过活组织检查来确认。目前，利用常规组织学检查的组织同种异体移植物活组织检查仍然是用于诊断经移植的患者中排斥的金标准(Racusen等人,The Banff 97 workingclassification of renal allograft pathology,KidneyInternational 1999,55,713-723)。由于程序活组织检查是侵入性方法，因此需要医生的干预来收集移植器官的小块组织。尽管这些测试相当准确地预测移植失败，但它们通常在相对晚的时期检测其，此时广泛的组织损害已发生。组织损害发生前对移植失败的早期检测可能帮助医生更高效地监测免疫抑制药物，使它们的副作用最小化、同时延长移植存活率。表明哪些患者处于随后急性同种异体移植排斥和慢性同种异体移植功能障碍的最高风险中的血清中蛋白质的鉴定在开发可用于体液样品的新型体外预后和诊断测定中可能是有帮助的。
鉴定用于移植和移植物排斥的生物标志物仍然具有挑战性。在过去十年中，已开发了不同的策略来鉴定此类标志物。第一种策略在于就特定蛋白质在免疫反应系统中的已知影响而言选择所述蛋白质。US2008/274910公开了TIRC-7(T细胞免疫应答cDNA7)在肾移植患者血液中的增强的表达特征谱对于可导致移植排斥的免疫活化的早期活化是决定性的。
更普遍的蛋白质(不参与免疫系统)例如TRIB-1（一种MAP激酶激活剂）(WO 2007/138011)或溶菌酶(JP 2006/6177679)已被鉴定为分别用于肾或肠急性移植排斥的体外诊断和或预后的标志物。在所有先前的实例中，使用了单种蛋白质。
另一个策略是研究移植器官的转录特征谱。在WO 2004/074815中，发明人研究了在血管再灌注后15分钟内已知基因在移植肾组织上的表达，所述基因编码介导免疫活化的促炎性或粘着蛋白和抗凋亡蛋白。结果显示可从与临床信息相结合的基因簇的差异表达预测延迟的移植物功能、急性排斥或延迟的排斥。
最近在移植排斥领域中开发了更加全局性的方法。基因组或蛋白质组学技术已使得能够进行许多人类疾病的基因或蛋白质表达的特征分析(profiling)。
微阵列工具提供了检测数百或数千个基因间差异表达的基因的模式的可能性。在WO 2010/083121中，发明人在微阵列平台上筛查了已接受肾移植的患者的血液样品的全基因组的表达水平，并且鉴定了一组其表达水平通过RT-PCR技术被证实的基因。利用所述基因表达特征谱来预先6至3个月预测急性排斥反应的发生。通过使用来自肾和心脏移植的基于活组织检查的基因表达微阵列研究的电脑模拟(insilico)数据开发了类似的策略(Chen等人,PLoS ComputationalBiology 2010,6(9),1-12)。这引起鉴定了3个交叉器官急性排斥蛋白质生物标志物即PECAM-1、CXCL-9和CD44。
在心脏移植中，心脏同种异体移植排斥基因表达观察(CARGO)研究引起开发了用于急性排斥的非侵入性、FDA承认的商购可得的测试(www.allomap.com)。通过算法将20个基因的测量表达水平转化成报告为评分的整数值。临床医生在测试时将该评分用于排斥概率的总体评价。该体外诊断可在移植后2个月至超过6个月之间进行，以评价排斥。
使用iTRAQ-MALDI-TOF/TOF法对蛋白质血浆浓度的测量鉴定了18个具有差异相对浓度的蛋白质组代码（protein group code）(CohenFreue等人,Molecular&Cellular Proteomics 9.9 2010,1954-1967)。这些蛋白质中的一些先前与急性肾移植排斥相关联，例如参与补体系统的那些(MBL2-甘露糖结合蛋白C)、凝集级联(SERPINA10和因子11)或炎性反应(巨噬细胞刺激蛋白-MSPT-1和MSPT-9)。在此出版物中，作者还公开了通过心肌细胞分泌的称为PI16的抗肥大蛋白，和称为AFM的、白蛋白家族蛋白的维生素E结合成员，所述蛋白在肾功能中具有未知作用。本研究加强了下述想法：有可能鉴定出普遍存在于所有移植器官间的生物标志物。
鉴定在急性和慢性排斥中具有未知作用的新型蛋白质可能不仅提供用于器官排斥的预后和诊断的新型测定而且还提供用于治疗干预的新型靶标。因此，这可导致免疫抑制药物的全部或部分撤出或者修改方案或改变使用的活性分子以允许接受者中的移植耐受。
虽然上述基因组和蛋白质组学技术构成了强大的工具，其引起鉴别新型基因或蛋白质作为急性或慢性移植物排斥的标志物，但它们的实施仍然昂贵，并且它们在医院并非总是可获得的。因此，仍然需要备选的标记物，其使得能够简单、快速且容易地实施用于移植和移植物排斥的预后及诊断的测定。
因此，本发明的目的之一是提供作为移植器官疼痛，尤其是移植和移植物排斥的特异性生物标志物的新型蛋白质。
本发明不仅允许在数分钟内诊断而且还允许在数分钟内预后移植或移植物排斥。
本发明涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或由其组成的肽，或源自SEQ ID NO:1的肽，所述肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1至11具有至少65%的同一性，条件是所述肽不是天然病毒蛋白质。
在优选实施方案中，本发明的肽由氨基酸序列SEQ ID NO:1或源自SEQ ID NO:1的肽组成，所述肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1至11具有至少65%，更优选至少75%，更优选至少85%，更优选至少95%的同一性，条件是所述肽不是天然病毒肽。
“天然病毒蛋白质”意指这样的蛋白序列，所述蛋白序列包含、对应于、存在于或以其它方式源自可在病毒的基因组中发现的任何蛋白序列。作为天然病毒蛋白质的实例，将引述来自HIV的gag蛋白。
在优选实施方案中，根据本发明的肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1至11具有至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%和最优选至少95%的同一性。
表述“肽”意指连续的线性氨基酸链。该连续氨基酸链可来自天然来源或人工（来自化学合成）。肽的化学合成法是本领域技术人员所熟知的。
氨基酸序列SEQ ID NO:1的肽的片段也是本发明的部分。肽的片段意指在SEQ ID NO:1的肽的11个氨基酸中选择的至少5个连续氨基酸链，其能够结合针对SEQ ID NO:1的肽产生的抗体。
可通过所述肽的序列改变获得的氨基酸序列SEQ ID NO:1的肽的变体也是本发明的部分。这些改变可包括置换、缺失、插入或突变。
修饰的或不寻常的氨基酸也可包含在这类变体中。还可按照本领域中的已知方法修饰存在于末端N或C基团上的氨基酸部分的侧链上的官能团。此类衍生物包括例如羧基的酯、脂肪族酰胺和游离氨基的N-酰基衍生物。此外，可使氨基酸经受翻译后修饰例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、甲基化、酰胺化、硫酸化、甲酰化或磷酸化。
可能是盐化的肽的、包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或由其组成的肽及其变体也是本发明的部分。羧基的盐包括无机盐，例如与有机碱如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸的钠、钾、钙盐。氨基的盐包括例如与无机酸例如盐酸或与有机酸例如醋酸的盐。
SEQ ID NO:1的肽被称为VEA195。
包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或由其组成的肽源自从移植的或植入的宿主分离的具有25-30kDa的分子量的血清蛋白质。
本发明还涉及编码上文中定义的肽的分离的核酸分子，特别是能够编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或由其组成的肽或源自SEQ ID NO:1的肽的核酸序列，条件是所述肽不是天然病毒肽，其中所述核酸是SEQ ID NO:2或其片段，条件是所述核酸分子不是天然病毒核酸。
“天然病毒核酸”意指这样的核酸序列，所述核酸序列包含、对应于、存在于或以其它方式源自可在病毒的基因组中发现的任何核酸序列。作为天然病毒核酸的实例，将引述来自HIV的gag基因。
由于遗传密码的简并性，编码SEQ ID NO:1的氨基酸的密码子可在其3个位置中的任何位置上不同。例如氨基酸赖氨酸可由AAA或AAG密码子（第三位置上的差异）指定。
术语“核酸分子”意指单链或双链DNA分子，或单链或双链RNA分子，所述RNA分子直接从DNA分子推演而来，或杂合DNA/RNA分子，所述核酸分子编码本发明的肽。
本发明还涉及包含可操作地连接至表达载体的上述核酸分子的重组核酸构建体。
表述“可操作地连接的”意指前述核酸分子以共价方式连接至表达载体，从而允许核糖体翻译所述核酸分子，或允许RNA聚合酶产生编码根据本发明的肽的mRNA。
术语“表达载体”意指由核酸制成的分子，特别是质粒，其包含启动子区域和任选地增强子区域。表达载体可包括其它基因例如抗生素抗性基因，为了选择包含编码根据本发明的肽的核酸分子的宿主细胞。使用前述表达载体的重组产生技术是本领域技术人员所熟知的。
本发明还涉及包含上述重组核酸构建体的宿主细胞。
术语“宿主细胞”意指任何活细胞，特别是真核细胞，但也指细菌细胞，或包含转录和/或翻译装置(machinery)和任选地来自细胞的细胞器的任何无生命介质，其允许扩增前述核酸构建体和/或产生根据本发明的肽。
本发明还涉及特异性结合表位的抗体或其片段，所述表位包含序列SEQ ID NO:1或所述肽的片段或由其组成。
在优选实施方案中，本发明的抗体或其片段特异性结合表位，所述表位由序列SEQ ID NO:1或所述肽的片段组成。
术语“抗体”意指属于任何物种例如人、小鼠、大鼠、兔或山羊物种的抗体。抗体也可以是嵌合抗体，即包含源自不同物种的部分的抗体。还可将抗体人源化。抗体还可以是包含至少一个互补位的抗体片段例如Fab、F(ab’)2或scFv片段。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体也可以是抗独特型单克隆抗体或抗独特型抗体的Fab片段。本发明的抗体可以是天然抗体或重组抗体。
术语“特异性”意指肽与一种抗体相互作用而基本上不与在结构上不与前述抗体相似的另一种抗体相互作用。
产生多克隆或单克隆抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。通常地，可将SEQ ID NO:1的肽与高分子量载体蛋白一起注射至非人哺乳动物（例如小鼠、兔、山羊或绵羊），以引发良好的免疫应答。可在将动物处死之前数次进行免疫接种方案。随后在层析柱上纯化动物血清，以分离目标单克隆或多克隆抗体。
通常，单克隆抗体产生自对分泌针对SEQ ID NO:1的肽产生的抗体的杂交瘤的选择。这样的杂交瘤产生自利用SEQ ID NO:1的肽免疫接种的非人哺乳动物的脾细胞与非人哺乳动物的骨髓瘤细胞之间的融合。基于它们分泌能够结合SEQ ID NO:1的肽的能力进行杂交瘤的选择。
在优选实施方案中，靶向氨基酸序列SEQ ID NO:1或源自SEQ IDNO:1的肽的抗体被于2011年5月4日在布达佩斯条约下在参考号CNCM I-4479、CNCM I-4480和CNCM I-4481下保藏在CNCM(国立微生物保藏中心，巴斯德研究所,25rue du Docteur Roux,75724巴黎Cedex15,法国)的杂交瘤分泌，所述杂交瘤为本发明的部分。
本发明还涉及于2011年5月4日分别在参考号CNCM I-4479、CNCMI-4480和CNCM I-4481下保藏在CNCM的杂交瘤2C7D10E5、4H7A7G9和1H8C9C10C7。
根据本发明的肽具有免疫原性，即VEA195肽能够在注射后诱导哺乳动物的体液免疫应答。已从其鉴定了VEA195肽的完整蛋白质在移植排斥中的确切功能还不知道。由于无人可预测该蛋白质对移植排斥是具有有益还是有害的作用，可开发两种治疗性策略来避免移植排斥。如果需要该蛋白质的存在，则在利用包含编码VEA195肽所源自的接受者蛋白质的多核苷酸的质粒进行移植之前或同时向接受者施用一剂或多剂DNA疫苗可能是有帮助的。在WO 2009/114735中通过使用由包含编码Bax促细胞凋亡蛋白的多核苷酸的质粒组成的DNA疫苗测试了该方法。相反地，如果需要该蛋白质不存在，则可能通过使用针对所述VEA195肽特异性产生的固定抗体来开发VEA195肽所源自的完整蛋白质的耗竭。本领域技术人员可能使用下述程序：其中从患者的循环采血以在将其返回循环之前对其施用耗竭方法。例如，可将针对VEA195肽产生的抗体结合至在身体之外循环血液的装置的树脂柱。已从其鉴定了VEA195肽的25-30kDa的蛋白质将被保留在柱子上，而全血被返回至经移植的患者的身体。该蛋白质从血液循环的快速耗竭可能限制移植或移植物排斥。
本发明的另一个目的是提供包含至少一种上文中定义的肽或抗体的组合物。
本发明的另一个目的是提供上文中定义的组合物，其用作用于评价移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的预后、诊断或监测工具。
术语“预后”和“诊断”分别涉及确定移植或移植物排斥是否将在哺乳动物中发生或正在发生。
术语“移植器官疼痛”意指移植器官功能障碍或移植器官衰竭。器官功能的丧失可导致例如但不限于通常被器官清除的物质的积累或器官不能进行其生理合成代谢或分解代谢功能。器官衰竭可能与（但不限于）坏死、纤维化或炎症过程相关。
例如，肾疼痛可与移植的肾的数种损害相关，例如急性肾小管坏死(ATN)、慢性间质小管坏死(CITN)、移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、毛细血管外肾小球肾炎或移植排斥（其为最高等级的肾疼痛）。
移植器官疼痛不限于移植的肾，还可能在其它移植或植入的器官和组织（例如肺、心脏、肝和骨髓）中发生。
术语“移植”意指将细胞或组织引入来自相同物种的另一个个体（同种异体移植）或来自不同物种（异种移植）的接受者哺乳动物的身体以恢复被疾病或损害改变的功能。造血细胞、脐带血细胞、胰腺β细胞举例说明了最常进行的细胞移植。提供了皮肤、骨髓、肝的部分或角膜的移植作为组织移植的实例。
术语“移植(transplant)”意指将从提供者哺乳动物的身体取出的器官引入其器官不再能正确地发挥其功能的接受者哺乳动物的身体。当器官提供者和器官接受者哺乳动物来自相同物种时，这称为同种异体移植。当器官提供者和器官接受者来自两个不同物种时，发生异种移植。在哺乳动物中当前大多数移植的器官是肺、肾、心脏、肝、胰腺和肠。所有先前提及的移植或移植物的类型被给出来举例说明本发明的领域，但不应当被用于限制本发明的范围。
表述“移植或移植物排斥”意指移植的细胞、组织或器官被接受者的免疫系统部分或全部破坏。已鉴定了3种类型的器官排斥：超急性、急性和慢性的。超急性排斥通常在移植的24小时内发生。急性排斥在移植的前6个月内发生，而慢性排斥可在移植后6个月至数年之间出现，尽管使用免疫抑制药物。
本发明还提供用于预测或进行哺乳动物的移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)测定SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段在所述哺乳动物的生物学样品中的存在或量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于预测或进行哺乳动物的移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的方法，其包括下述步骤：
(i)测定针对SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段产生的抗体在所述哺乳动物的生物学样品中的存在或量。
术语“哺乳动物”包括人以及其它动物例如猪、牛、马、兔、猫、狗。哺乳动物可以是雌性的或雄性的、成年或儿童。
根据本发明，检测或测定SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段的水平，或针对SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段产生的抗体的水平可通过任何本领域中已知的技术、优选通过使用免疫测定法来进行。
术语“免疫测定”意指任何下述技术：其中SEQ ID NO:1的肽或针对SEQ ID NO:1的肽特异性产生的抗体的水平是使用至少一种本说明书中在上文中定义的肽和/或抗体来测定的。免疫测定法是本领域技术人员所熟知的并且可具有各种形式，例如在固相或液相中、在一个或两个步骤中、通过夹心或竞争性方法。
例如，可使用胶体金免疫层析测定(CIA)(Cao等人,Am.J.Trop.Med.Hyg.2007,76(3),553-558)。该类型的免疫测定特别容易实施并且在少于30分钟中，优选在少于20分钟中，更优选在10分钟中获得定性的结果。
抗原在生物学样品中的存在可通过金胶体标记的检测抗体来显露，所述抗体能够通过识别与被捕获抗体识别的位点不同的表位位点来结合目标肽或蛋白质。优选地，可使捕获抗体结合至固体支持物，特别是醋酸纤维素膜，并且将金胶体标记的抗体认为是迁移抗体。
关于其它实例，可使用ELISA测定、放射免疫测定或任何其它检测方法来显露所形成的抗原-抗体复合物的存在。因此，可设想不同类型的配体和/或抗体的标记(放射活性、酶促、荧光……)。
在移植或植入发生后数小时或数天，在来自经移植或植入的接受者的生物学样品上进行SEQ ID NO:1的肽或针对SEQ ID NO:1肽的肽特异性产生的抗体的测量测定。生物学样品可以是体液样品或固体样品例如移植器官或组织的活检样品。
表述“体液样品”意指适合用于根据本发明的方法的任何类型的样品。生物学样品可选自血液样品、血清样品、血浆样品、尿样或唾液样品。
本发明还涉及用于移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的试剂盒，其包括：
(i)至少一种适合于结合包含SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段或由其组成的表位的抗体,
(ii)至少一种适合用于结合抗体-抗原复合物的偶联至检测系统的抗体，
和任选地至少一种SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段。
本发明还涉及SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段用作用于哺乳动物的移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的标志物的用途。
本发明还涉及能够编码SEQ ID NO:1的肽的SEQ ID NO:2的核酸分子用作用于哺乳动物的移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的标志物的用途。
术语“标志物”还指“生物标志物”，其涉及其表达调控对于移植或移植物排斥的预后或诊断有用的任何蛋白质和/或核酸分子。
下列实施例1至4和图1至2举例说明本发明。
图1表示已从其分离了VEA195的蛋白质的组织定位。按照实施例2对患有或未患有移植排斥的接受者进行了肾活组织检查：
A　未患排斥的移植患者
B　患有排斥的移植患者。
图2显示胶体金免疫层析测定(CIA)的结果。用于根据实施例3诊断器官接受者的血清中VEA195肽所源自的完整蛋白质的条带：
(a)　未患排斥的移植患者
(b)　患有排斥的移植患者
实施例1:25-30kDa的蛋白质的分离、提取、纯化和对应于在25-30kDa的蛋白质上鉴定的内源免疫原性肽的VEA195肽的合成
1.1 　方案
从肾移植患者收集了5个血清样品，通过蛋白G琼脂糖4快速流动(Pharmacia,Uppsala,瑞典)清除了其人免疫球蛋白(IgG)。获得了15ml的总体积，并将其加载至Sephadex G-75(Pharmacia,Uppsala,瑞典)色谱柱上用于使用氯仿甲醇3/1缓冲液进行分离。收集了200μl级分的洗脱物，级分n°4-5(400μl)的分析显示出存在25-30kDa蛋白质。
通过在4℃下、在4L的PBS中浸没过夜，将所述400μl于小管(Sigma-Aldrich,法国)中进行透析方案。最后收集了终体积200μl的透析物，并允许了鉴定出具有免疫原性性质的1.2kDa的小序列。该级分的测序被定义为VEA195。随后合成该肽。
通过本领域技术人员熟知的方法在自动化合成仪上装配了VEA195肽。简要地，使用Boc/苄基策略进行了固相肽合成。以5倍过量偶联每一个氨基酸，在PyBPO、HObt和DIEA存在的情况下于DMF中进行每一个偶联。通过利用氟化氢的处理从树脂切离的肽，并通过反相色谱进行纯化。合并具有高于95%纯度的级分。
1.2 　结果
通过分析质谱法控制VEA195肽的身份(identity)，并使用nucleosil C18250x4.6mm柱通过分析HPLC控制其纯度。将10至60%的梯度的乙腈用于该纯化。测量收集的级分的电势差以获得色谱特征谱。色谱特征谱上唯一的峰对应于VEA195肽，将所述VEA195肽干燥、重悬于纯水中，并随后用于小鼠的免疫接种以产生特异性抗体。
实施例2:肾组织的免疫组织化学
2.1 　方案
将移植患者的经福尔马林固定、石蜡包埋的移植肾活检组织切成5微米切片，并固定在载玻片上。按照制造商的推荐，在自动化染色系统(Ventana Medical Systems Tucson,Arizona USA)上对先前经测序的来自25-30kDa蛋白质的VEA195进行免疫组织化学（IHC）测定。将这些载玻片于二甲苯中脱石蜡，通过3次乙醇通过脱水，并转移至Ventana试剂盒（其包括封闭内源性过氧化物酶活性的溶液）。也将抗-VEA195小鼠单克隆抗体如2C7D10E5(E5)、4H7A7G9(G9)和1H8C9C10C7(C7)插入在平台上，并且在测定过程中自动化地以1:100的稀释进行分配。使这些载玻片在DAB Map(DAB=二-氨基-联苯胺)中进行显色，并用苏木精(Ventana)复染，最后于甲苯溶液(Eukit,CML,Nemours,法国)中固定。
2.2 　结果
将它们示于图1中。来自患有移植排斥的肾移植接受者的活检组织在肾小球基底膜和肾的小管部分上都显示典型的25-30kDa蛋白质染色。小管细胞的细胞质染色非常强(图1-B)。在来自健康（即未经历移植排斥）肾移植接受者（图1-A）的活检组织中未出现25-30kDa蛋白质染色。
实施例3:免疫-上升（ascendant）色谱结果
3.1 　单克隆抗体合成
给每只小鼠注射约50μg的稀释于PBS中的VEA195肽，注射总共4只小鼠。使用在完全弗氏佐剂中乳化的VEA195肽腹膜内地进行第一注射。在第21天和42天进行新的注射，在第0、14、35和56天进行测试放血。在完成最后一次测试放血后，进行了ELISA测试。在最后一次放血后，通过手术取出最佳反应性小鼠的脾脏。将淋巴细胞分离，并将其置于培养基中。
为了使免疫球蛋白产生性淋巴细胞保持存活，将它们在聚乙二醇的存在下与小鼠骨髓瘤细胞系的细胞系[骨髓瘤SP2/0-Ag14(ATCCCRL8287)]融合。在填充了HAT培养基（次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷）的平板上进行融合和未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞的分离。收集存活的细胞，且构成杂交瘤。在抗原特异性抗体的存在下测试细胞培养物的上清液，将杂交瘤细胞冷冻以进一步生长。然后通过在多孔板中稀释混合物来分离真正的单克隆抗体产生性杂交瘤细胞系。通过该方法，在一系列新细胞的选择和克隆、ELISA和显微镜控制后，选择了一个“母细胞”，其分泌一种独特的抗体。
通过使用该技术，针对VEA195肽产生了IgG1或IgG2κ同种型单克隆抗体：2C7D10E5(E5)、4H7A7G9(G9)和1H8C9C10C7(C7)。
3.2 　免疫测定方案
在该测定中使用双抗体夹心技术使得能够在移植患者血清中检测VEA195肽所源自的完整蛋白质。该测试基于使用两种针对VEA195肽产生的特异性抗体和针对小鼠Ig产生的非特异性抗体的免疫色谱法。单克隆E5捕获抗体特异性识别VEA195的表位。缀合有胶体金的G9迁移抗体识别VEA195肽的第二表位。抗小鼠Ig是用作阴性对照的对照捕获抗体。将三种抗体线性地结合至醋酸纤维素膜上。将条带浸没在含有迁移缓冲液(Na2HPO450mM,BSA1%和NaN30,10%pH7.4，来自BIOSYNEX)中的稀释的患者血清的测定管中。由E5捕获抗体-VEA195肽所源自的蛋白质-缀合有胶体金的G9迁移抗体构成的复合物形成测试线，并且由抗小鼠Ig捕获抗体-缀合有胶体金的G9迁移抗体构成的复合物形成对照线。缀合有胶体金的抗体的迁移沿着测试条带进行。10分钟后读取结果。当测试线和对照线均为红色时，其意指对应的血清样品是阳性的。如果仅对照线是红色的，则表示阴性结果。
3.3 　结果
将它们示于图2中。两条线存在于利用患有移植排斥的肾移植患者的血清进行的条带上(图2-b)：上方的线对应于对照线，下方的条带是测试线。仅可见对照线的是利用未患有移植排斥的肾移植患者的血清进行的条带测试（图1-a）。
对总共20个肾移植患者的血清样品进行了胶体金免疫-色谱测定(CIA)与免疫组织化学(IHC)之间的比较研究（通过移植器官的苏木精和伊红染色的切片进行）(表1，第17页)。根据IHC标准确立了最终的诊断。所有的实验都是用经编码和盲测的样品进行的。追溯性地和盲测地进行通过CIA测定的分析，有时在通过病理学确定的诊断后数月进行。结果集中在表1中。
与通过病理学确定的诊断相关地进行了胶体金免疫-色谱测定(CIA)与免疫组织化学测定(IHC)之间的比较研究。患者的特征谱被分类为反应性(+)，即阳性，或非反应性(-)，即阴性，或边界病理学(BP)，即无通过IHC显示的移植排斥的组织学证据。在一些情况下，由于样品不再可获得，因此CIA分析不能进行且结果表示为未进行(ND)。
用两种测定均发现为阴性的5个血清样品属于未患有移植排斥的移植患者。该组患者可被细分成两类：A1是健康接受者，A2是患有细菌感染的接受者。属于这些A1和A2类别的患者未患有任何肾疼痛。对于使用抗VEA195抗体的CIA，13个血清为阳性。在那些阳性样品中，4个与急性体液排斥(AHR)相关，4个与急性细胞排斥(ACR)相关。肾疼痛的其它形式在4个血清样品中是反应性的，主要与急性肾小管坏死(ATN)、慢性间质性肾小管坏死(CITN)或毛细血管外肾小球肾炎相关。通过IHC，患者1(第一样品)、14和34(第三样品)被发现为边界病理学(BP，即无通过IHC显示的移植排斥的组织学证据)，这需要进行另一次活组织检查。数月后进行的活组织检查确认了先前利用CIA测定获得的结果。这些结果清楚地显示出抗-VEA195抗体是肾疼痛包括移植排斥的可靠生物标志物。
实施例4:ELISA测定
4.1 　方案
用100μl的、于20μl碳酸盐缓冲液(50mM,pH9.4)中稀释的患者血清在4℃过夜涂覆微量滴定板。用PBS-0.05%Tween20缓冲液清洗微量滴定板3次。用250μl的PBS缓冲液和150μl的5%BSA的溶液在室温下孵育平板2小时，并用PBS-0.05%Tween20缓冲液清洗3次。每一个孔接收100μl、于PBS-BSA1%中1:4000稀释的E5抗体，并将平板在室温下孵育1小时。用PBS-0.05%Tween20缓冲液清洗微量滴定板3次。以1:3000向每一个孔中添加缀合有过氧化物酶的山羊抗-小鼠IgG抗体，在37℃孵育30分钟。用PBS-0.05%Tween20缓冲液清洗微量滴定板3次。随后添加OPD(正-苯二胺)底物，进行10分钟。通过添加4mM的H2SO4溶液来终止反应。随后由光学讲师(optical lecturer)在415nm读取微量滴定板。
4.2 　结果
结果示于下面的表2上，如第20和21页举例说明的。用3个血液提供者（T）和8个移植患者的血清样品进行了ELISA测定。将对于对照血清（血液提供者）获得的光密度（OD）值的平均值和SD用于建立截断值，因为血液提供者被认为是阴性样品。将包括高于阴性值的平均值3个标准偏差的任意方法用于计算截断值，其在本测定中为0.068OD单位。高于截断值的OD值被认为是阳性的，而低于截断值的OD值被认为是阴性的。在进行移植和进行通过病理学确定的诊断后数月，通过ELISA测定追溯性地和盲测地测试患者的移植排斥。
Figure BDA0000458039050000181
用抗VEA195 E5抗体测定了来自8个肾移植接受者的34个血清样品。
在血液提供者(患者ID:100、200和300)即未经移植的人中，OD值等于或低于0.068。
在进行移植后数月未患有移植排斥的移植患者(类别A1，患者ID:400和500)中，OD值也等于或低于0.068。这意味着类别A1患者未患有移植排斥。该诊断与通过病理学分析的诊断一致。
在B类别的移植患者中，对于每一个患者分析了3个样品。取样的时间过程对于患者600是40天，对于患者700是106天。患者600的第一样品显示等于0.093（高于截断值）的OD，表明所述25-30kDa蛋白质存在于患者600的血清中。所述蛋白质的浓度在所述患者的样品2和3中降到该测定的检测限制水平以下。对于患者700，在样品3和4中检测到25-30kDa蛋白质的存在。25-30kDa蛋白质在最后的样品中是不可检测的。一旦通过病理学确立了移植排斥的诊断，使患者600和700经受适当的治疗(即，透析、移植物去除（transplantremoval）、免疫抑制药物。这可解释对于患者600的样品2和3以及对于患者700的最后一个样品的OD值的下降及因而25-30kDa蛋白质浓度的下降。在表2中用星号标记那些样品。1.2倍至2倍截断值的调整似乎表示急性体液排斥(AHR)。
对于C类的4名患者，所有的样品OD值均高于截断值。对于患者800和900的最后一个样品，OD值下降一半。对于患者1000，在取样的38天过程中OD值保持在相同的水平。对于患者1100，在样品2与样品3之间，OD值、因而25-30kDa蛋白质的浓度增加。2至40倍截断值之间的调整似乎表示急性细胞排斥(ACR)。
最后，反映患者血清中25-30kDa蛋白质的量的OD值的水平似乎与移植排斥的类型相关，并且可能在移植的功能障碍和恶化阶段中提供诊断的洞悉。
对于在进行移植后数月经历移植排斥的移植患者，OD值从0.084上升至超过2.7。因此，血液样品中VEA195肽所源自的25-30kDa蛋白质的量可以是用于预测移植排斥的良好工具。肾移植接受者中25-30kDa蛋白质的动力学表达特征谱也可能受到疾病状态的影响并且与患者的免疫抑制治疗相关。
ELISA测定显示出本发明可以是高效的工具并且可提供用于评价移植器官疼痛、特别是在本文中通过移植排斥举例说明的最有害的阶段的方法。
Figure IDA0000458039130000011
Figure IDA0000458039130000021

Claims (14)

1.肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO:1或衍生自SEQ ID NO:1的肽组成，所述肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1至11具有至少65%，更优选至少75%，更优选至少85%，更优选至少95%的同一性，条件是所述肽不是天然病毒肽。
2.能够编码根据权利要求1的肽的核酸分子，其中所述核酸是SEQ ID NO:2或其片段，条件是所述核酸分子不是天然病毒核酸。
3.抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合由根据权利要求1的肽或所述肽的片段组成的表位。
4.杂交瘤，其于2011年5月4日于布达佩期协议下、在参考编号CNCM I-4479、CNCM I-4480和CNCM I-4481下被保藏在CNCM(巴黎)，其分泌如权利要求3中定义的抗体或其片段。
5.组合物，其包含至少一种权利要求1的肽或至少一种权利要求3的抗体。
6.权利要求5的组合物，其作为用于评估移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的预后、诊断或监测工具的用途。
7.用于预测或进行哺乳动物中移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的方法，其包括下列步骤：
(i)测定所述哺乳动物的生物学样品中SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段的存在或量。
8.用于预测或进行哺乳动物的移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的方法，其包括下述步骤：
(i)测定所述哺乳动物的生物学样品中针对SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段产生的抗体的存在或量。
9.权利要求7或8的任一项的方法，其中使用免疫测定法来测量SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段，或针对SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段产生的抗体的水平。
10.权利要求7或9的任一项的方法，其中所述抗体由于2011年5月4日在布达佩斯条约下、在参考号CNCM I-4479、CNCM I-4480和CNCM I-4481下保藏在CNCM(巴黎)的杂交瘤之一分泌。
11.权利要求7或8的方法，其中所述生物学样品是体液样品。
12.用于移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的试剂盒，其包括：
(i)至少一种适合于结合包含SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段或由所述肽或肽片段组成的表位的抗体，
(ii)至少一种适合用于结合抗体-抗原复合物的偶联至检测系统的抗体，
和任选地至少一种SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段。
13.SEQ ID NO:1的肽或所述肽的片段作为用于哺乳动物中移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的标志物的用途。
14.能够编码SEQ ID NO:1的肽的SEQ ID NO:2的核酸分子作为用于哺乳动物中移植器官疼痛、特别是移植或移植物排斥的体外预后或诊断的标志物的用途。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009089568A1 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Opal Therapeutics Pty Ltd Immunomodulating compositions and uses therefor
WO2010083121A1 (en) * 2009-01-15 2010-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker panel for diagnosis and prediction of graft rejection

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1599602B1 (en) 2003-02-14 2015-01-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Predicting graft rejection
JP2006177679A (ja) 2004-12-20 2006-07-06 Keio Gijuku 診断マーカー及び薬効マーカー、並びにそれらの利用方法
EP1891444A2 (en) 2005-05-17 2008-02-27 GenPat77 Pharmacogenetics AG Tirc7 as marker for detecting early immune activation
WO2007138011A1 (en) 2006-05-25 2007-12-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating graft rejection and inflammatory conditiions
AU2009223148B2 (en) 2008-03-12 2013-03-14 Loma Linda University DNA vaccines and methods for the prevention of transplantation rejection

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009089568A1 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Opal Therapeutics Pty Ltd Immunomodulating compositions and uses therefor
WO2010083121A1 (en) * 2009-01-15 2010-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker panel for diagnosis and prediction of graft rejection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VAN BAALEN C A等: "Fine-specificity of cytotoxic T lymphocytes which recognize conserved epitopes of the GAG protein of human immunodeficiency virus type 1", 《JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY》, vol. 77, no. 8, 1 August 1996 (1996-08-01), XP009075529 *

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