CN103675285A - 一种肝癌早期诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种肝癌早期诊断试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肝癌早期诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含酶标多肽抗体、包被缓冲液、清洗液、显色液、封闭液、终止液、抗原包被的酶标板。采用该试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：首先对抗原包被的酶标板进行封闭，然后在酶标板中加入酶标多肽抗体，并加入显色液进行显色反应，最后加入终止液终止反应，并采用酶联检测仪测定吸光度值。采用该诊断试剂盒进行肝癌早期诊断，具有良好的临床背景，而且酶联免疫吸附检测具有检测迅速、操作简单、特异性及灵敏度高的优点，既保证了诊断结果的准确性和特异性，而且极大的节省了检测时间，提高了检测效率。

Description

一种肝癌早期诊断试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肝癌早期诊断试剂盒及检测方法。
背景技术
国际卫生组织统计结果显示，2008年全球有75万肝癌新发病例，70万肝癌死亡病例，男、女新发病例分别位于当年恶性肿瘤发病率的第五位及第七位，而男、女死亡病例分别位于当年恶性肿瘤死亡率的第二位及第六位。在所有肝癌患者中，肝细胞癌为最常见的一种组织学类型，占所有肝癌患者的70%-85%。
肝癌恶性程度高，病情发展迅速，若治疗不及时或治疗不当，则可使病情迅速恶化而致死亡。近年来，随着人们生活方式的改变及其他各种因素的影响，我国肝癌发病率仍有逐年上升趋势，我国每年死于肝癌的患者约有11万人，约占世界肝癌死亡人数的45%，目前肝癌已经成为我国仅次于胃癌、食管癌第三位的恶性肿瘤死亡原因。
肝癌早期无明显症状，若患者有自觉症状时，约有30%的患者已属肝癌晚期，患者会感到肝区胀痛，出现不明原因的消瘦、发热、乏力，体检可见右上腹肿块、肝大。针对肝癌患者上述临床表现，对于肝癌的早期诊断显得尤为重要。目前最为常用的肝癌细胞血清标志物为甲胎蛋白，甲胎蛋白是血液里含有的一种特殊蛋白质，只有在胎儿的肝细胞中才能合成，待胎儿从母体中娩出后一周内，胎儿体内的甲胎蛋白会完全消失，正常人的肝细胞是不产生甲胎蛋白的，可是当得了肝癌时，由于肝细胞癌变幼稚化无休止地生长，恢复合成甲胎蛋白的能力，这也是目前将甲胎蛋白作为诊断早期肝癌重要标志物的道理，目前，甲胎蛋白仍是临床广泛应用的原发性肝癌血清学诊断标志物，但其敏感性、特异性及准确性均不理想，因此，迫切需要新的更为准确可靠的肝癌标志物以期提高肝癌尤其是早期肝癌诊断的灵敏度和特异度。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种灵敏度、特异度更高的
本发明的技术方案如下：
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下：酶标多肽抗体,包被缓冲液,清洗液,显色液,封闭液,终止液和抗原包被的酶标板。
所述的酶标多肽抗体具体制备方法为：
（1）以合成肽Rep5为抗原免疫BALB/c小鼠，BALB／c小鼠，采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体，并制备小鼠腹水抗体，通过Pmtein G柱将腹水抗体进行亲和纯化。
（2）采用辣根过氧化酶标记抗体，具体方法为：先吸取1-5mg纯化后的单克隆抗体，加入新制备的100-200ul的碘酸钠水溶液中，在4℃旋转混合20-40min，加入100-200ul丙二醇水溶液，25℃混合20-40min，加入1-3mg多肽抗体，涡旋混匀后采用碳酸钠缓冲液调节PH至9-10，在4℃下搅拌混合12-24h，加入硼氢酸钠水溶液终止反应。
优选的，所述的小鼠腹水抗体效价为1：2000000-1：5000000
所述的包被缓冲液为PBS缓冲液。
所述的清洗液为含有0.05%-0.1%Tween 20的PBS溶液。
所述的显色液为TMB显色液。
所述的封闭液为The Blocking Solution封闭液。
所述的终止液为2-3mol/L的硫酸。
采用上述诊断试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：
（a）在抗原包被的酶标板中加入封闭液200-300ul，37℃静置10-15min；弃封闭液，采用清洗液清洗3-5次；
（b）加入100-200ul的酶标多肽抗体，37℃静置10-15min，弃酶标多肽抗体，采用清洗液清洗3-5次；
（c）加入100-200ul显色液，37℃避光孵育10-15min显色；
（d）加入50-100ul终止液终止反应；
（e）采用酶联检测仪测定吸光度值。
所述的吸光度值的测定波长为455nm。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.目前，甲胎蛋白仍是临就要上广应应用的肝癌患者的血清学诊断标志物，但于肿瘤直径小于3cm的肝癌患者，敏感性为33％-65％；
若以AFP含量大于20ng/mL为诊断标准，其阳性率则明显下跌，甚至下跌至9.1％-26％。血清多肽分子量一般在10kD以下，其蕴含着丰富的疾病信息，血清多肽可精细地区分肿瘤种类，而且其血清浓度与肿瘤大小、肿瘤组织分化程度、肿瘤临床分期均具有密切的关系。而且Pep5诊断肝癌的敏感性可达80%以上，特异性可达90%以上，对于早期检测肝癌检测具有重要意义。本组发明采用酶联免疫吸附法检测血清中Rep5多肽水平，来判断和预测肝癌的发生，具有良好的临床背景。
2.本组发明采用酶联免疫吸附法检测血清中Rep5多肽水平，酶联免疫吸附法具有较高的灵敏性和特异性。
3.本发明提供了一种诊断试剂盒，可将酶联免疫吸附法检测血清中Rep5多肽水平的操作变得更简便，从而极大的提高了临床检测的效率。
4. 本组发明中的封闭操作时采用 The Blocking Solution封闭液，The Blocking Solution封闭液是一种基于酪蛋白的新型表面封闭液，酪蛋白溶液具有非常好的封闭特性，而The Blocking Solution显著的优于其他酪蛋白溶液具有非常好的重现性，而且是即用型的，可以反复冻融，除此以外， The Blocking Solution封闭液封闭时间短，10min左右即可完成封闭操作，极大的节省了检测时间，提高了检测效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下：
酶标多肽抗体
PBS缓冲液
0.05%Tween 20的PBS溶液
TMB显色液
The Blocking Solution封闭液
2mol/L的硫酸
抗原包被的酶标板。
所述的酶标多肽抗体具体制备方法为：
（1）以合成肽Rep5为抗原免疫BALB/c小鼠，BALB／c小鼠，采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体，并制备小鼠抗体效价为1：2000000的小鼠腹水抗体，通过Pmtein G柱将腹水抗体进行亲和纯化。
（2）采用辣根过氧化酶标记抗体，具体方法为：先吸取1mg纯化后的单克隆抗体，加入新制备的100ul的碘酸钠水溶液中，在4℃旋转混合20min，加入100ul丙二醇水溶液，25℃混合20min，加入1mg多肽抗体，涡旋混匀后采用碳酸钠缓冲液调节PH至9，在4℃下搅拌混合12h，加入硼氢酸钠水溶液终止反应。
采用上述诊断试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：
（a）在抗原包被的酶标板中加入The Blocking Solution封闭液
200ul，37℃静置10min；弃封闭液，采用0.05%Tween 20的PBS溶液清洗3次；
（b）加入100ul的酶标多肽抗体，37℃静置10min，弃酶标多肽抗体，采用0.05%Tween 20的PBS溶液清洗3次；
（c）加入100ul TMB显色液，37℃避光孵育10min显色；
（d）加入50ul2mol/L的硫酸终止反应；
（e）采用酶联检测仪测定455波长处的吸光度值。
 
实施例2
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下：
酶标多肽抗体
PBS缓冲液
0.1%Tween 20的PBS溶液
TMB显色液
The Blocking Solution封闭液
3mol/L的硫酸
抗原包被的酶标板。
所述的酶标多肽抗体具体制备方法为：
（1）以合成肽Rep5为抗原免疫BALB/c小鼠，BALB／c小鼠，采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体，并制备抗体效价为1：5000000的小鼠腹水抗体，通过Pmtein G柱将腹水抗体进行亲和纯化。
（2）采用辣根过氧化酶标记抗体，具体方法为：先吸取5mg纯化后的单克隆抗体，加入新制备的200ul的碘酸钠水溶液中，在4℃旋转混合40min，加入200ul丙二醇水溶液，25℃混合40min，加入3mg多肽抗体，涡旋混匀后采用碳酸钠缓冲液调节PH至10，在4℃下搅拌混合24h，加入硼氢酸钠水溶液终止反应。
采用上述诊断试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：
（a）在抗原包被的酶标板中加入The Blocking Solution封闭液300ul，37℃静置15min；弃The Blocking Solution封闭液，采用清洗液清洗5次；
（b）加入200ul的酶标多肽抗体，37℃静置15min，弃酶标多肽抗体，采用清洗液清洗5次；
（c）加入150ul TMB显色液，37℃避光孵育15min显色；
（d）加入100ul3mol/L的硫酸终止反应；
（e）采用酶联检测仪测定455波长处的吸光度值。
 
实施例3
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下：
酶标多肽抗体
PBS缓冲液
0.08%Tween 20的PBS溶液
TMB显色液
The Blocking Solution封闭液
2.5mol/L的硫酸
抗原包被的酶标板。
所述的酶标多肽抗体具体制备方法为：
（1）以合成肽Rep5为抗原免疫BALB/c小鼠，BALB／c小鼠，采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体，并制备抗体效价为1：3500000的小鼠腹水抗体，通过Pmtein G柱将腹水抗体进行亲和纯化。
（2）采用辣根过氧化酶标记抗体，采用辣根过氧化酶标记抗体，具体方法为：先吸取3mg纯化后的单克隆抗体，加入新制备的150ul的碘酸钠水溶液中，在4℃旋转混合30min，加入150ul丙二醇水溶液，25℃混合30min，加入2mg多肽抗体，涡旋混匀后采用碳酸钠缓冲液调节PH至9.5，在4℃下搅拌混合18h，加入硼氢酸钠水溶液终止反应。
采用上述诊断试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：
（a）在抗原包被的酶标板中加入The Blocking Solution封闭液
250ul，37℃静置12min；弃The Blocking Solution封闭液，采用清洗液清洗4次；
（b）加入150ul的酶标多肽抗体，37℃静置12min，弃酶标多肽抗体，采用清洗液清洗4次；
（c）加入150ulTMB显色液，37℃避光孵育12min显色；
（d）加入80ul2.5mol/L的硫酸终止反应；
（e）采用酶联检测仪测定455波长处的吸光度值。
以上所述实施例只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括本发明专利申请范围内。

Claims (10)

1.一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的诊断试剂盒组成如下：酶标多肽抗体,包被缓冲液,清洗液,显色液,封闭液,终止液和抗原包被的酶标板。
2.根据权利要求1所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的酶标多肽抗体具体制备方法为：
（1）以合成肽Rep5为抗原免疫BALB/c小鼠，BALB／c小鼠，采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体，并制备小鼠腹水抗体，通过Pmtein G柱将腹水抗体进行亲和纯化；
（2）采用辣根过氧化酶标记抗体。
3.根据权利要求2所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的小鼠腹水抗体效价为1：2000000-1：5000000。
4.根据权利要求1所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的包被缓冲液为PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的清洗液为含有0.05%-0.1%Tween 20的PBS溶液。
6.根据权利要求1所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的显色液为TMB显色液。
7.根据权利要求1所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为The Blocking Solution封闭液。
8.根据权利要求1所述的一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2-3mol/L的硫酸。
9.采用如权利要求1-8任一所述的试剂盒进行检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）在抗原包被的酶标板中加入封闭液200-300ul，37℃静置10-15min；弃封闭液，采用清洗液清洗3-5次；
（b）加入100-200ul的酶标多肽抗体，37℃静置10-15min，弃酶标多肽抗体，采用清洗液清洗3-5次；
（c）加入100-200ul显色液，37℃避光孵育10-15min显色；
（d）加入50-100ul终止液终止反应；
（e）采用酶联检测仪测定吸光度值。
10.根据权利要求9所述的检测方法，特征在于，吸光度值的测定波长为455nm。
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