CN103667463A - 一种利用数字pcr检测食品中大肠菌群数量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用数字PCR检测待测食品中大肠菌群数量的方法。该方法包括如下步骤：1）富集待测食品中的细菌，将富集物与DNA结合物共同孵育，获得PCR扩增模板；所述DNA结合物为不能穿过完整的细胞膜，但能与细胞膜受损后暴露出来的DNA结合的物质；2）配制PCR反应体系，进行数字PCR反应；所述PCR反应体系中含有所述PCR扩增模板、大肠菌群通用引物对、荧光染料、dNTP和DNA聚合酶；3）根据反应产生的荧光信号，计算所述待测食品中的大肠菌群数量。本方法无需对食品中细菌进行分离培养，检测时间短至3-4小时；同时减少了背景DNA和基质的干扰，灵敏度低至1个拷贝；且该方法无需设置标准曲线，根据结果可直接判读样品中的大肠菌群数量，大大简化了操作步骤。

Description

一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法
技术领域
本发明属于食品安全领域，涉及一种检测食品中大肠菌群数量的方法，特别涉及一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法。
背景技术
民以食为天，食以安为先，食品安全关系到消费者的身心健康与财产安全。食品中的致病微生物是引发食品安全问题的重要原因之一，而大肠菌群是作为食品安全一个很重要的微生物指标，检测食品中大肠菌群数是判断样品是否被人、畜粪便污染及污染程度的标志，可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，以及潜伏着食物中毒和流行病的威胁，是否对人体健康具有潜在的危险。所以各个国家都针对诸如肉、蛋、奶、饮料等各种食品中的大肠菌群数量制定了限定标准，并依法对各种食品的微生物含量进行抽查检测。例如我国规定每100g鲜禽产品不能超过10000MPN，100ml巴氏杀菌乳中不能超过90个。由于食品基质复杂，食品中微生物数量较少，目前对食品中大肠菌群数量的检测方法都要依赖于细菌培养，在培养的基础上检测，因此检测时间需要1-2天完成。如目前的国标培养法需要48个小时才能完成，美国进口3M大肠菌群测试片也需要24小时才能确认结果。对于讲究鲜活的食品来讲，检测时间过长，大大影响了食品的供应，同时也降低了鲜活食品的质量。因此急需一种快速的食品中大肠菌群数量的检测方法。
数字PCR是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR技术不同的是数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在现阶段的低丰度因子含量检测中，定量PCR、杂交等方法都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求（如定量PCR检测中Ct值大于33的情况下，其重复性和准确性就不是很高），而微滴式数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有的待检测片段从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及精确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法。
数字PCR方法在检测食品中大肠菌群数量中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法，具体可包括如下步骤：
（1）富集待测食品中的细菌，将富集物与DNA结合物共同孵育，获得PCR扩增模板；
所述DNA结合物为不能穿过完整的细胞膜（活细菌），但能与细胞膜受损（死细菌）后暴露出来的DNA结合的物质；
（2）配制PCR反应体系，进行数字PCR反应；所述PCR反应体系中含有步骤（1）获得的PCR扩增模板、大肠菌群通用引物对、荧光染料、dNTP和DNA聚合酶；
（3）根据步骤（2）数字PCR反应产生的荧光信号，计算得到所述待测食品中的大肠菌群数量。
在上述方法中，所述待测食品可为液体食品，也可为固体食品。如各种鲜活农产品及其加工食品、水以及饮料等。在本发明的一个实施例中，所述待测食品为奶，具体为牛奶，更加具体为生鲜牛乳或巴氏杀菌牛奶。
当所述待测食品为液体食品（如牛奶）时，上述方法的步骤（1）中，所述“富集待测食品中的细菌”可为将所述待测食品（如牛奶）离心，所得沉淀即为所述富集物（富集了待测食品中的细菌）。进一步，将所述待测食品（如牛奶）离心的转速可为14000g，时间可为5-10min（如10min），温度可为4℃。
在上述方法的步骤（1）中，将所述富集物与所述DNA结合物共同孵育的目的是为了让所述DNA结合物与死细菌的DNA结合，从而阻断死细菌DNA分子的PCR扩增，从而有效实现对活细菌的选择性扩增。
在上述方法中，所述大肠菌群通用引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，或者由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2。
在上述方法中，所述DNA结合物具体可为叠氮溴化丙锭（PMA）或叠氮溴化乙锭（EMA）。
在上述方法中，所述荧光染料具体可为SybGreen或EvaGreen。
在上述方法的步骤（2）中，进行所述数字PCR反应时的退火温度可为58℃。进一步，在本发明中，进行所述数字PCR反应时的反应程序为：94℃预变性3min；94℃ 45S，50℃ 45S，72℃ 60S，5个循环；94℃ 45S，58℃ 45S，72℃ 60S，30个循环；最后72℃保温10min。
进一步，在步骤（1）中，所述DNA结合物（PMA或EMA）在孵育体系中的终浓度为10μg/ml。
在本发明的一个实施例中，上述方法的步骤（1）具体为：将20-50ml牛奶（生鲜牛乳或巴氏杀菌牛奶）4℃下14000g离心10min后，收集沉淀，用1ml生理盐水重悬后加入DNA结合物（PMA或EMA）至其终浓度为10μg/ml，25℃孵育20分钟，然后4℃14000g离心5min，用生理盐水重悬沉淀至10-20微升，得到所述PCR扩增模板。
在上述方法的步骤（2）中，进行所述数字PCR反应时的反应体系中，所述大肠菌群通用引物对中两条单链DNA分子的终浓度均为10μM。
具体的，在本发明的一个实施例中，上述方法的步骤（2）中，进行所述数字PCR反应时的反应体系（以总体积20微升为例）为：5微升所述PCR扩增模板，所述大肠菌群通用引物对中两条单链DNA分子的终浓度均为10μM，1微升荧光染料（SybGreen或EvaGreen），以及10微升PCR mix，余量为水。所述PCR mix由dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成，具体为Bio-rad公司产品，其产品目录号为186-4035。
在上述方法中，进行所述数字PCR反应，并根据产生的荧光信号计算所述待测食品中的大肠菌群数量，是在现有的数字PCR系统上进行。首先，利用数字PCR系统自带的分液器将配制好的所述反应体系进行分液处理，生成数万个液滴，分散至芯片的微反应器或微滴中，使每个微滴或反应器的PCR扩增模板数少于或者等于1个；其次，进行PCR循环扩增，有一个PCR扩增模板的反应器就会给出荧光信号，没有PCR扩增模板的反应器就没有荧光信号。进一步，根据荧光信号的相对比例和PCR反应液的体积，计算出所述待测食品（如牛奶）中大肠菌群数量。
本发明的再一个目的是提供一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的试剂盒。所述食品可为液体食品，也可为固体食品。如各种鲜活农产品及其加工食品、水以及饮料等。在本发明的一个实施例中，所述食品为奶，具体为牛奶，更加具体为生鲜牛乳或巴氏杀菌牛奶。
具体的，本发明所提供的试剂盒，可包括如下物质：
（a）引物对；所述引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，或者由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；
（b）DNA结合物；所述DNA结合物为不能穿过完整的细胞膜，但能与细胞膜受损后暴露出来的DNA结合的物质；
所述DNA结合物具体可为叠氮溴化丙锭（PMA）或叠氮溴化乙锭（EMA）。
进一步，所述试剂盒还可包括荧光染料；
所述荧光染料具体可为SybGreen或EvaGreen。
所述试剂盒还可以包括PCR反应缓冲液。
在本发明中，所有的所述大肠菌群数量均为活的大肠菌群的数量（细胞膜完整的活的大肠菌群的数量）。
在本发明中，所述引物对不限于由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，以及由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2，只要是能够特异性扩增所有大肠菌群的引物对均可。
所述大肠菌群为需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
本发明在数字PCR基础上，设计了可以扩增大肠菌群的通用引物，建立了基于数字PCR方法的食品中大肠菌群数量的检测方法。与常规方法相比，本发明的方法无需对食品中的细菌进行分离培养，使检测时间从1-2天缩短至3-5小时；同时本发明的方法通过数字PCR技术对PCR反应液进行分液处理，大大减少了背景DNA和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝；而且该方法无需设置标准曲线，根据结果可以直接判读样品中的大肠菌群数量，大大简化了操作步骤。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
数字PCR系统：Bio-rad公司Droplet Digital PCR System（购自伯乐公司，目录号为186-4001）。其工作原理为：将含有荧光染料的反应体系进行分液处理，生成数万个液滴，分散至芯片的微滴中，使每个微滴的模板数少于或者等于1个；这样，在PCR循环扩增时，有一个模板的微滴就会发出荧光信号，没有PCR扩增模板的微滴就没有荧光信号。进一步，根据荧光信号的相对比例和反应液的体积，就可以计算出反应体系中模板的浓度。
叠氮溴化丙锭（PMA）：美国Biotium公司产品，其产品目录号为40013。叠氮溴化乙锭（EMA）：美国Biotium公司产品，其产品目录号为40015。PMA和EMA均为DNA结合物，均不能穿过完整的细胞膜，但能与细胞膜受损后暴露出来的DNA结合。因此，PMA和EMA可以与死细菌的DNA结合，但是不能与细胞膜完整的活细菌的DNA结合。
荧光染料SybGreen：美国Invitrogen公司产品，其产品目录号为S-7585。荧光染料EvaGreen：美国Biotium公司产品，其产品目录号为31000。荧光染料SybGreen和EvaGreen均可与双链DNA分子结合，发出绿色荧光。
PCR mix：Bio-rad公司产品，其产品目录号为186-4035。所述PCR mix由dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成。
美国3M大肠菌群数量测试片：美国3M公司产品，其产品目录号为6412。
实施例1、利用数字PCR对市售生鲜牛乳进行大肠菌群数量的检测
本实施例以12份市售生鲜牛乳作为待测牛奶，编号为1-12，利用数字PCR技术对其中的大肠菌群数量（活的大肠菌群的数量）进行检测。
一、大肠菌群通用引物对的设计
为了能够利用PCR方法检测食品中的所有的大肠菌群，根据大肠菌群基因组保守序列，设计可以扩增所有大肠菌群的通用引物对1和引物对2，具体如下：
引物对1：
正向引物：5’-CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3’（序列1）；
反向引物：5′-CAACCAGACGATAGTTATCACGCA-3’（序列2）。
引物对2：
正向引物：5’-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3’（序列3）；
反向引物：5’-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3’（序列4）。
二、PCR扩增模板的制备
取20ml市售生鲜牛乳，4℃ 14000g离心10min，得沉淀（细菌），用1ml生理盐水重悬后加入叠氮溴化乙锭（EMA）使其终浓度为10μg/ml，室温（25℃）孵育20分钟，然后4℃ 14000g离心5min，用生理盐水将沉淀重悬至20微升，得到PCR扩增模板。
三、配制PCR反应体系
取5微升步骤二获得的PCR扩增模板，加入10微升PCR mix，2微升正向引物和2微升反向引物（使正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度均为10μM）（步骤一中的引物对1），1微升荧光染料EvaGreen。混合后得到20微升的反应体系。
四、上机进行数字PCR检测
1、反应体系的分液处理
将步骤三配制好的PCR反应体系置于数字PCR系统的分液器内，按照仪器使用说明进行操作，实现对反应体系的分液处理，生成2万个液滴。
2、PCR循环扩增
每个液体在独立的空间内进行PCR循环扩增。设置反应程序如下：94℃预变性3min；94℃ 45S，50℃ 45S，72℃ 60S，5个循环；94℃ 45S，58℃ 45S，72℃ 60S，30个循环；最后72℃保温10min。
3、分析荧光信号
PCR循环扩增反应结束后，利用数字PCR系统自带的微滴荧光检测仪采集每个液滴的荧光信号。进一步，根据发出荧光信号的液滴的数量，计算出所述待测食品（市售生鲜牛乳）中活的大肠菌群的数量。
实验同时设置以美国3M大肠菌群数量测试片对作为待测食品的市售生鲜牛乳进行大肠菌群数量测定的对照。具体的实验操作均按照产品说明书记载进行。
实验重复三次，结果取平均值。
结果如表1所示，从结果可以看出，本发明采用数字PCR方法对生鲜牛乳中大肠菌群数量的测定结果，与现有的“美国3M大肠菌群数量测试片法”相比，12份样本的误差均小于20%，平均误差为12%，这说明本发明方法具有很高的准确度。另外，本发明数字PCR方法的单样本全程检测时间为4小时，远短于现有进口3M快速检测片的24小时。
表1数字PCR法与美国3M大肠菌群数量测试片法测定生鲜牛乳中大肠菌群数量的结果对比（单位：CFU/mL）
Figure BDA0000423530340000061
实施例2、利用数字PCR对市售巴氏杀菌牛奶进行大肠菌群数量的检测
本实施例以12份市售巴氏杀菌牛奶作为待测牛奶，编号为1-12，利用数字PCR技术对其中的大肠菌群数量（活的大肠菌群的数量）进行检测。
一、PCR扩增模板的制备
取50ml市售巴氏杀菌牛奶，4℃14000g离心10min，得沉淀（细菌），用1ml生理盐水重悬后加入叠氮溴化丙锭（PMA）使其终浓度为10μg/ml，室温（25℃）孵育20分钟，然后4℃ 14000g离心5min，用生理盐水将沉淀重悬至10微升，得到PCR扩增模板。
二、配制PCR反应体系
取5微升步骤一获得的PCR扩增模板，加入10微升PCR mix，2微升正向引物和2微升反向引物（使正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度均为10μM）（步骤一中的引物对2），1微升荧光染料SybGreen。混合后得到20微升的反应体系。
三、上机进行数字PCR检测
1、反应体系的分液处理
将步骤二配制好的PCR反应体系置于数字PCR系统的分液器内，按照仪器使用说明进行操作，实现对反应体系的分液处理，生成2万个液滴。
2、PCR循环扩增
每个液体在独立的空间内进行PCR循环扩增。设置反应程序如下：94℃预变性3min；94℃ 45S，50℃ 45S，72℃ 60S，5个循环；94℃ 45S，58℃ 45S，72℃ 60S，30个循环；最后72℃保温10min。
3、分析荧光信号
PCR循环扩增反应结束后，利用数字PCR系统自带的微滴荧光检测仪采集每个液滴的荧光信号。进一步，根据发出荧光信号的液滴的数量，计算出所述待测食品（市售巴氏杀菌牛奶）中活的大肠菌群的数量。
实验同时设置以美国3M大肠菌群数量测试片对作为待测食品的市售生鲜牛乳进行大肠菌群数量测定的对照。具体的实验操作均按照产品说明书记载进行。
实验重复三次，结果取平均值。
结果如表2所示，从结果可以看出，本发明采用数字PCR方法对巴氏杀菌牛奶中大肠菌群数量的测定结果，与现有的“美国3M大肠菌群数量测试片法”相比，12份样本的误差均小于25%，平均误差为18%，这说明本发明方法具有很高的准确度。另外，本发明数字PCR方法的单样本全程检测时间为4小时，远短于现有进口3M快速检测片的24小时。
表2数字PCR法与美国3M大肠菌群数量测试片法测定巴氏杀菌牛奶中大肠菌群数量的结果对比（单位：CFU/100mL）
Figure BDA0000423530340000071
Figure IDA0000423530410000011
Figure IDA0000423530410000021

Claims (10)

1.数字PCR方法在检测食品中大肠菌群数量中的应用。
2.一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的方法，包括如下步骤：
（1）富集待测食品中的细菌，将富集物与DNA结合物共同孵育，获得PCR扩增模板；
所述DNA结合物为不能穿过完整的细胞膜，但能与细胞膜受损后暴露出来的DNA结合的物质；
（2）配制PCR反应体系，进行数字PCR反应；所述PCR反应体系中含有步骤（1）获得的PCR扩增模板、大肠菌群通用引物对、荧光染料、dNTP和DNA聚合酶；
（3）根据步骤（2）数字PCR反应产生的荧光信号，计算得到所述待测食品中的大肠菌群数量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述大肠菌群通用引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，或者由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述DNA结合物为叠氮溴化丙锭或叠氮溴化乙锭。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述荧光染料为SybGreen或EvaGreen。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，进行所述数字PCR反应时的退火温度为58℃。
7.一种利用数字PCR检测食品中大肠菌群数量的试剂盒，包括如下物质：
（a）引物对；所述引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1，或者由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；
（b）DNA结合物；所述DNA结合物为不能穿过完整的细胞膜，但能与细胞膜受损后暴露出来的DNA结合的物质。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA结合物为叠氮溴化丙锭或叠氮溴化乙锭。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光染料；
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为SybGreen或EvaGreen。
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