CN103655468B - 一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂 - Google Patents

Abstract

一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，属于药学制剂研究领域。本发明Exendin-4-HSA溶液稳定制剂包括有效成分Exendin-4-HSA融合蛋白，磷酸盐缓冲系统、表面活性剂F68、渗透压维持剂甘露醇、防腐剂间甲酚、辛酸钠和EDTA。这个配方能有效提高促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA的稳定性，延长该药物的保存期和适用性，从而提高其治疗2型糖尿病和肥胖症的治疗价值。

Description

一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂

技术领域

本发明一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，涉及提高促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白溶液稳定性的制剂配制方法，可发展促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白用于治疗糖尿病和肥胖症更合适的药物剂型，属于药学制剂研究领域。

背景技术

Exendin-4（促胰岛素分泌肽）是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥（Gila monster）唾液发现的一种多肽物质，氨基酸序列53%与人类血液中调控血糖的胰高血糖素类似肽GLP-1同源。Exendin-4为胰高血糖素类似肽受体（Glucogan like Peptide 1R，GLP-1R）激动剂。与GLP-1功能相似，Exendin-4具有促胰腺分泌胰岛素发挥降低血糖作用、促进机体对血糖的利用、减少肝糖原分解、通过减缓胃肠道的蠕动使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液内出现的高峰、作用中枢神经系统控制过度食欲等多种生理功能。同时，由于不被二肽基肽酶－IV降解，其稳定性明显高于GLP-1。Exendin-4在人体内的半衰期为数小时，远远长于GLP-1的3-5分钟。

目前Exendin-4已由美国Lilly公司和Amylin公司研制生产，2005年获得了美国FDA批准上市，商品名倍它Byetta，目前已成为一种治疗2型糖尿病全新类型的药物。在生理条件下，Byetta（Exendin-4）和GLP-1作用相似，在刺激胰岛素分泌的作用时依赖于血糖浓度，不会因持续分泌而发生低血糖，这特征显著优于胰岛素使用时因剂量不当造成的低血糖反应。然而，因Exendin-4在人体内的半衰期为数小时，患者还是需要每天注射Byetta两次才能获得预期疗效。因此，如何延长Exendin-4降血糖的持续效应，减少用药次数，减轻副作用，减轻病人的负担是进一步提高Exendin-4治疗2型糖尿病效果的关键。将Exendin-4与大分子蛋白进行融合或偶联，延长其在患者体内的半衰期是延长Exendin-4的有效途径。目前，Conjuchem公司采用化学偶联的方法将Exendin-4与人血清白蛋白进行连接，开发了一种长效的Exendin-4药物PC-DAC-Exendin-4-HSA。无锡和邦生物技术有限公司采用基因工程技术，将促胰岛素分泌肽Exendin-4与人白蛋白HSA基因直接融合，通过酿酒酵母表达产生促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA，该蛋白质特征既具有促胰岛素分泌肽Exendin-4的生物学活性，又大大延长了药物在体内的半衰期，半衰期可长达1-2周，能有效增加对糖尿病的治疗效果，减轻病人的痛苦和经济负担，是一种理想的长效2型糖尿病治疗药物。但是，蛋白质药物最大的缺点是易降解而失活，不能长期保存。通常采用冻干粉针剂的方法来保存蛋白质药物，以延长保质期。但是，冻干粉针剂在使用前必须先用溶液溶解，病人使用不方便，甚至会出现安全性问题。本发明对增加促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白注射用水针剂的稳定性，对该融合蛋白注射用水针剂的配方进行了研究，获得能有效提高注射用水针剂中促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白的稳定性的配方，制备了能长期稳定保存的注射用水针剂，对提高长效促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白的药用价值具有重要意义。

发明内容

 本发明的目的是提供一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂。

本发明的技术方案：一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，包含治疗有效成分Exendin-4-HSA融合蛋白，在磷酸盐缓冲液中，加入甘露醇，F68，EDTA，辛酸钠，间甲酚，控制溶液pH 7.0；

Exendin-4-HSA融合蛋白的浓度为0.25-100mg/mL，

磷酸盐缓冲液的浓度为5-20mM，

甘露醇浓度w/v为4.3%-5.5%，

F68浓度w/v为0.1%-0.8%，

EDTA的浓度为1-5mM，

辛酸钠的浓度为5-10mM，

间甲酚的浓度为2-8mg/mL。

为使促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白能长期保存，本发明选择一种缓冲溶液作为促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白的溶剂。该缓冲系统可使促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA蛋白溶液的pH值范围保持在5.0-7.0之间。缓冲液包括但不局限于磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液。本发明优先的缓冲液是磷酸盐缓冲液，缓冲液盐浓度在5-20mM之间，优选的盐浓度为10mM。

       为防止促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白溶液因蛋白质降解而降低其在保质期内的药理活性，本发明在不影响对患者治疗效果的前提条件下，适当增加溶液中Exendin-4-HSA融合蛋白的浓度，浓度范围在0.25-100mg/mL, 之间，优选的Exendin-4-HSA融合蛋白为10mg/mL。

为使促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液保持在生理等渗状态，满足在人体内治疗用药维持等渗的需要，本发明在促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液中加入等渗剂。等渗剂是生理耐受性化合物，且赋予制剂合适的张力以阻止穿过细胞膜的净水流，调节溶液适当的离子强度或张力，提供可接受的稳定性和促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA生物活性。这类化合物的实例包括甘油、NaCl、葡萄糖、甘露醇和蔗糖等等。本发明优选的等渗剂是NaCl和甘露醇。NaCl的优选浓度为150mM。更优选的等渗剂是甘露醇，优选的浓度范围在4.3%-5.5%（w/v）之间，更优选在约5.0%（w/v）。

 为了防止或抑制促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液的微生物生长，本发明在促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液中加入适量的防腐剂，以保证溶液的稳定性和促胰岛素活性。防腐剂为抗微生物剂的化合物。本发明使用的防腐剂包括但不限于以下化合物：间甲酚、对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲醇、间苯二酚和其他类似的防腐剂。优选的防腐剂是间甲酚。间甲酚使用浓度为2.0 mg/mL至8.0 mg/mL，最优选浓度为约2.7 mg/mL。

为增加促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA的溶解度和稳定性，增加促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA的药物活性，本发明在促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液中加入适量的增溶剂。本发明使用的增溶剂是F68（泊洛沙姆Poloxamer，为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物）。浓度小范围为0.1%-0.8%（w/v），优选的浓度为0.1%（w/v）。

为更好增加促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA蛋白的稳定性，本发明还在促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液中加入其它一些保护剂，如辛酸钠（如在生物制剂人血白蛋白就含有辛酸钠，作为非活性成分，用于保护蛋白）、EDTA（乙二胺四乙酸）。辛酸钠的浓度范围为5-10 mM，优选的浓度为5 mM。EDTA浓度范围为1-5mM，优选的浓度为1mM。

为了提高促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA在水剂中的稳定性，本发明优选的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液制剂的配方为：Exendin-4-HSA融合蛋白的浓度是10mg/mL，磷酸盐缓冲液的浓度为约10mM，甘露醇浓度约为5.0%（w/v），F68浓度为0.1%（w/v），EDTA的浓度为1mM，辛酸钠的浓度为5mM，间甲酚的浓度为2.7mg/mL，pH在7.0左右。

本发明的有益效果：可以有效提高促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA在水剂中的稳定性，延长该药物的保存期和适用性，从而提高其治疗2型糖尿病和肥胖症的治疗价值。应用本发明的配方制成的水剂注射液，在25℃保存达90天，促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA药物活性仍然保持在规定的活性范围内；在2-8℃保存超过90天，促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA药物活性仍然保持在规定的范围内。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：不同促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA溶液的配方

配制鉴定样品1-16(均含有10mg/mL Exendin-4-HSA融合蛋白)，其中T表示0.01%吐温80，E表示1mM EDTA，F表示Poloxamer188，又叫F68，M表示甘露醇，G表示甘氨酸，AC为醋酸缓冲液，PB为磷酸缓冲液。

实施例2：不同配方溶液中促胰岛素分泌肽Exendin-4-HSA融合蛋白2-8℃、25℃保存1个月的稳定性研究

将实施例1中不同配方Exendin-4-HSA融合蛋白溶液在2-8℃、25℃放置1个月，通过分子筛大小HPLC检测各种Exendin-4-HSA融合蛋白溶液在2-8℃、25℃条件下保存1个月后蛋白主峰变化的百分比。

分子筛大小排阻HPLC方法：将样品注射到预先经1×PBS （pH 7.4）和10%（v/v）乙腈流动缓冲液（A-泵缓冲液）预平衡的TSK-gel G3000 SWxl (7.8×300mm ID 5μm)柱上。用无梯度缓冲液以0.5mL/min的流速洗柱，在214 nm处检测蛋白质主峰的含量。分别获得Exendin-4-HSA融合蛋白溶液主峰，和Exendin-4-HSA融合蛋白标准原液主峰，计算两者的百分比。含量下降率为100%减去Exendin-4-HSA融合蛋白溶液主峰与Exendin-4-HSA融合蛋白标准原液主峰的百分比。具体结果如表1

表1  Exendin-4-HSA融合蛋白溶液2-8℃、25℃保存1个月稳定性的变化

根据表中数据，25℃放置时，含量下降率超过5% 的规定为不合格配方，不再继续进行下阶段的稳定性试验。通过一个月的稳定性考察，获得7个配方（配方包括2、4、9、10、12、15、16）含量下降率未超过5%，溶液配方优选出磷酸缓冲液，包含F68、EDTA，、辛酸钠、间甲酚。此获得7个配方作为候选配方继续进行下一次稳定性研究观察的配方。

实施例3：Exendin-4-HSA融合蛋白溶液条件在2-8℃、25℃放置二个月的稳定性研究。具体方法同实施例2，结果如表2.

表2 Exendin-4-HSA融合蛋白溶液2-8℃、25℃保存2个月稳定性的变化

根据表中数据，25℃放置时含量下降率超过5% 的规定为不合格配方，不再继续进行下阶段的稳定性试验。通过2个月的稳定性考察，获得3个配方（配方包括10、15、16）含量下降率未超过5%，该3个配方作为候选配方继续进行下一次稳定性研究观察。

实施例4：Exendin-4-HSA融合蛋白溶液条件在2-8℃、25℃放置三个月的稳定性研究。具体方法如实施例2，结果如表3

表3 Exendin-4-HSA融合蛋白溶液2-8℃、25℃保存3个月稳定性的变化

根据表中数据，25℃放置时含量下降率超过5% 的规定为不合格配方，不再继续进行下阶段的稳定性试验。通过3个月的稳定性考察，获得2个配方（配方包括15、16）含量下降率未超过5%，优选配方16号作为Exendin-4-HSA融合蛋白溶液（注射液）稳定性配方。

Claims (8)

1.一种促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于包含治疗有效成分Exendin-4-HSA融合蛋白，在磷酸盐缓冲液中，加入甘露醇，F68，EDTA，辛酸钠，间甲酚，控制溶液pH 7.0；

Exendin-4-HSA融合蛋白的浓度为0.25-100mg/mL，

磷酸盐缓冲液的浓度为5-20mM，

甘露醇浓度w/v为4.3%-5.5%，

F68浓度w/v为0.1%-0.8%，

EDTA的浓度为1-5mM，

辛酸钠的浓度为5-10mM，

间甲酚的浓度为2-8mg/mL。

2.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中治疗有效成分Exendin-4-HSA融合蛋白的浓度为10mg/mL。

3.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中磷酸盐缓冲液的浓度为10mM。

4.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中甘露醇浓度w/v为5.0%。

5.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中F68浓度w/v为0.1%。

6.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中EDTA的浓度为1mM。

7.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中辛酸钠的浓度为5mM。

8.根据权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白Exendin-4-HSA溶液稳定制剂，其特征在于其中间甲酚的浓度为2.7mg/mL。