CN103645450A - 一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法及装置，该方法的步骤如下：（1）确定荧光光谱的激发波长；（2）确定荧光检测波长；（3）放入样品；（4）根据步骤（1）的测试结果，产生波长为λ_ex的脉冲激光；（5）利用脉冲激光激发磁敏物质产生荧光；（6）荧光经分光后被光电倍增管转化为电信号；（7）监测脉冲激光信号和光电倍增管信号，得到样品的时间分辨动态荧光光谱；（8）调节磁场强度，重复上述步骤，得到一系列时间分辨动态荧光光谱；（9）取出样品，测量样品位置处中心区域磁场强度；（10）对荧光曲线进行多阶拟合，并依据荧光寿命变化对磁效应作出评价。该装置用来实施上述方法。本发明具有原理简单、操作简便、效果好等优点。

Description

一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法和装置

技术领域

本发明主要涉及到表征物质磁效应的技术领域，特指一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法和装置。

背景技术

一切物质都具有磁性，只不过不同物质的磁性有很大的差异，有的物质磁性强，有的物质磁性弱。物质的磁性将在其周围空间产生磁场，因此又可以进一步论断，任何空间都存在着磁场，只不过有的地方磁场强，有的地方磁场弱。这表明磁性和磁现象具有普遍性和极其丰富的内涵。正因为如此，磁性和磁现象得到极其广泛的应用。例如，生物磁效应就是目前高新技术中活跃的领域之一。生物磁效应是指不同的生物（如微生物、植物、动物和人）及不同生物层次（如生物分子、细胞、组织和活体）在磁场的作用下所发生的不同程度的变化。根据磁场强度，将生物磁效应分为强磁场效应、地磁场效应和极弱磁场效应。高于0.1mT的属于强磁场，低于100nT的属于极弱磁场或近零磁场，介于其中的称为地磁场。

表征物质磁效应的手段很多，但基本原则都是依据各种物理磁现象，比如利用霍尔效应，测量导体中的垂直于磁场和电流方向的两个端面之间电势差随外加磁场强度的变化；利用磁阻效应或巨磁阻效应，测量金属或半导体的电阻值随外加磁场的变化；利用法拉第电磁感应定律，首先用磁敏材料做成磁芯，在其表面缠绕线圈，然后往线圈中通上重复的脉冲电流，使磁芯磁化，测量断开电流瞬间，线圈两端的感应电压；利用巨磁阻效应，通过阻抗分析仪测量不同磁场强度下物质的阻抗值；利用磁电效应，测量外加不同电场强度下物质的磁化强度M或不同外加磁场强度下物质的电极化强度；利用磁致伸缩效应，通过悬臂梁法表征不同磁场强度下物质的尺寸变化；利用压磁效应，测量不同压力下物质的磁导率μ；利用磁光效应，使一束偏振光通过磁敏介质，然后在光束传播方向施加外磁场，检测光通过偏振面的旋转角度；利用磁流变效应，借助磁耦合动态力学分析仪测试物质在不同磁场强度下的剪切模量和损耗因子。

但这些手段对生化样品都不适用。近年来，虽有报道通过测量酶活性随外加磁场度变化来表征酶的磁效应，但耗时较长、灵敏度较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题就在于：针对现有技术存在的技术问题，本发明提供一种原理简单、操作简便、能够利用时间分辨荧光光谱技术对蛋白及其他磁敏物质的磁效应进行表征的方法及装置，解决了不能检测生化磁敏物质对磁场的响应问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法，其步骤如下：

（1）确定荧光光谱的激发波长；利用紫外/可见分光光度计测定样品在200～800nm的吸收曲线，找到样品最强特征吸收峰对应峰位，即为被测样品的最佳激发波长，结合激光器工作条件确定实际激发波长λ_ex；

（2）确定荧光检测波长；利用稳态荧光光谱仪测定样品在激发波长λ_ex作用下的稳态荧光发射光谱曲线，找到最强发射峰对应峰位，并参考样品的特征荧光峰峰位，确定被测样品的检测波长λ_em；

（3）放入样品；

（4）根据步骤（1）的测试结果，通过脉冲激光器产生波长为λ_ex的脉冲激光；

（5）利用步骤（4）产生的脉冲激光激发磁敏物质产生荧光；

（6）将单色仪波长固定为λ_em，样品被激发后发射的荧光经单色仪分光后被光电倍增管转化为电信号；

（7）监测脉冲激光信号和光电倍增管信号，得到样品的时间分辨动态荧光光谱；

（8）调节样品位置中心区域磁场强度，重复上述步骤（4）～（7）操作，得到一系列时间分辨动态荧光光谱；

（9）取出样品，利用磁力仪测量样品位置处中心区域磁场强度；

（10）按照下式对荧光曲线进行多阶拟合：

$R\left(t\right)=A+\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{B}_i{e}^{-\frac{t}{{\mathrm{\τ}}_i}}---\left(2\right)$

${\mathrm{\α}}_i=\frac{B_i}{B_1+B_2+\·\·\·+B_i+\·\·\·B_n}\×100\%---\left(3\right)$

其中，R(t)为被激发后t时刻样品的荧光强度，A为背底，B_i为指前因子，t为激发与测量的间隔时间，τ_i为荧光组分i的荧光寿命，α_i为荧光组分i的百分含量；最终依据荧光寿命变化对样品的磁效应作出评价。

本发明进一步提供一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的装置，包括磁源系统、光路系统、数据采集系统和控制处理系统，所述磁源系统包括亥姆霍兹线圈、线圈电源和磁力仪，所述线圈电源与亥姆霍兹线圈连接；所述光路系统包括激光器电源、脉冲激光器、样品池以及各种滤光片，所述激光器电源与脉冲激光器相连；所述数据采集系统包括单色仪、光电倍增管和数字存储式示波器，所述数字存储式示波器与光电倍增管连接；所述控制处理系统包括总控制器和计算机，所述总控制器分别与激光器电源、单色仪、光电倍增管、数字存储式示波器相连，所述计算机与总控制器相连。

作为本发明的进一步改进：

所述亥姆霍兹线圈放置在样品室内，所述样品池放置在亥姆霍兹线圈的中心区域。

所述单色仪放置在样品池一侧、并与所述脉冲激光器的激发光源成90°夹角的位置。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法和装置，原理简单、操作简便、效果好，解决了生化样品磁效应表征的困难；采用瞬态荧光光谱，其灵敏度较常规的光谱测量方法高出2～4个数量级，并且检测下限通常可达0.1～0.001μg·cm^-3，因此对样品的需求量非常小。

附图说明

图1是本发明利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法流程示意图。

图2是本发明利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的装置结构原理示意图。

图3是在具体应用实例中不同磁场强度下鸽子隐花色素蛋白的时间分辨荧光光谱。

图例说明：

1、亥姆霍兹线圈；2、线圈电源；3、磁力仪；4、激光器电源；5、脉冲激光器；6、样品池；7、总控制器；8、光电倍增管；9、数字存储式示波器；10、计算机；11、样品室；12、单色仪。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

因为大多数的生物组织都有荧光结构，所以为了丰富生物样品磁效应的表征方法，本发明设计了利用荧光光谱技术来表征样品磁效应的方法和装置。荧光是辐射跃迁的一种，是激发态分子失活到多重性不变的低能状态时所释放的辐射。通常使用的激发光为紫外线或X射线，发射的荧光则一般比入射光的波长要长，分布在可见光波段。激发光一旦停止，发光现象也随之立即消失。

根据自由基对机理，具有电子激发态的物质在受到光、电、热等外界条件激发后，会发生电子跃迁，使得原本自旋配对的一对基态电子（S₀）变为两个单电子的激发态（自由基），其自旋态可能是反平行（单重态S₁）或平行（三重态T₁），其不再抵消的自旋磁矩将与外加磁场发生相互作用，所产生的附加能量形成能级分裂，即Zeeman分裂，促使

转换，转换效率与外加磁场有关；上述激发态是不稳定的，将迅速恢复到原本的稳定基态，显然其回归过程的动力学参数会因外磁场而发生改变。也就是说，激发态寿命会受磁场强度影响。激发态寿命的定义是激发态失活到初始时的1/e所需要的时间，其中激发单重态（S₁）的寿命τ_s就等于物质的荧光寿命τ_f，τ_f等于荧光强度衰减为初始的1/e所需要的时间，即：

τ_f=τ_S   （1）

物质的荧光寿命可以通过对荧光衰减曲线进行拟合得到。所以，通过测试物质的时间分辨荧光光谱，配合强度可调的人工磁场，得出物质的荧光寿命随磁场强度变化用以表征物质磁效应在理论上是可行的。

如图1所示，本发明的一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法，其步骤如下：

（1）确定荧光光谱的激发波长。利用紫外/可见分光光度计测定样品在200～800nm的吸收曲线，找到样品最强特征吸收峰对应峰位，即为被测样品的最佳激发波长，结合激光器工作条件确定实际激发波长λ_ex；

（2）确定荧光检测波长。利用稳态荧光光谱仪测定样品在激发波长λ_ex作用下的稳态荧光发射光谱曲线，找到最强发射峰对应峰位，并参考样品的特征荧光峰峰位，确定被测样品的检测波长λ_em；

（3）将待测样品放入样品池6内；

（4）根据步骤（1）的测试结果，通过多倍频使脉冲激光器5产生波长为λ_ex的脉冲激光；

（5）脉冲激光激发磁敏物质产生荧光；

（6）将单色仪12波长固定为λ_em，样品被激发后发射的荧光经单色仪12分光后被光电倍增管8转化为电信号；

（7）通过数字存储式示波器9同时监测脉冲激光信号和光电倍增管信号，得到样品的时间分辨动态荧光光谱；

（8）通过改变线圈内电流调节样品池6中心区域磁场强度，重复上述步骤（4）～（7）操作，得到一系列时间分辨动态荧光光谱；

（9）取出样品，利用磁力仪3测量样品池6中心区域磁场强度；

（10）按照下式（2）对荧光曲线进行多阶拟合：

$R\left(t\right)=A+\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{B}_i{e}^{-\frac{t}{{\mathrm{\τ}}_i}}---\left(2\right)$

${\mathrm{\α}}_i=\frac{B_i}{B_1+B_2+\·\·\·+B_i+\·\·\·B_n}\×100\%---\left(3\right)$

其中，R(t)为被激发后t时刻样品的荧光强度，A为背底，B_i为指前因子，t为激发与测量的间隔时间，τ_i为荧光组分i的荧光寿命，α_i为荧光组分i的百分含量。最终依据荧光寿命变化对样品的磁效应作出评价。

如图2所示，本发明的一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的装置，包括：磁源系统、光路系统、数据采集系统和控制处理系统，其中磁源系统包括亥姆霍兹线圈1、线圈电源2和磁力仪3，线圈电源2与亥姆霍兹线圈1连接；光路系统包括激光器电源4（驱动电源）、脉冲激光器5、样品池6以及各种滤光片，激光器电源4与脉冲激光器5相连；数据采集系统包括单色仪12、光电倍增管8和数字存储式示波器9，数字存储式示波器9与光电倍增管8连接；控制处理系统包括总控制器7和计算机10（其上集成有设备驱动软件、数据采集软件和数据处理软件），总控制器7分别与激光器电源4、单色仪12、光电倍增管8、数字存储式示波器9相连，计算机10与总控制器7相连。亥姆霍兹线圈1放置在样品室11内，样品池6放置在亥姆霍兹线圈1的中心区域，并保证所测样品位于亥姆霍兹线圈1产生的磁场均匀区内。

本实施例中，为避免激发光干扰检测结果，单色仪12应放置在样品池6一侧、与脉冲激光器5的激发光源成90°夹角的位置。

由此可见，本发明依据上述方法，以脉冲激光器5作为激发光源，用亥姆霍兹线圈1提供人工磁场，通过对线圈内电流强度进行调节，产生满足强度要求的磁场；然后，测量发光物质在不同磁场强度下的荧光发光强度随时间的变化，通过比较曲线之间的差别，可以判定物质是否具有磁效应，以帮助深入分析激发态失活的动力学过程及其受磁场强度的影响，得出磁场与物质内部光引发自由基对的作用机制，这是研究磁敏物质内部物理机理、指导新材料制备的一种重要方法。

具体而言，在使用时首先利用紫外/可见分光光度计确定荧光测试激发波长和检测波长。然后，利用线圈电源2（如：高精度线性恒流电源）驱动亥姆霍兹线圈1，产生恒定均匀的人工磁场，利用磁力仪测量样品池6中心区域磁场强度。接下来，利用激光器电源4使脉冲激光器5产生脉冲激光，激发样品使其发出荧光，经固定波长的单色仪12分光后被光电倍增管8转换为电信号；并通过数字存储式示波器9同时监测脉冲激光信号和光电倍增管信号，得到时间分辨动态荧光光谱；最后，通过计算机10和总控制器7对单色仪12的扫描过程进行控制、对数字存储式示波器9的输出信号进行采集，利用计算机10对采集的数据进行拟合处理。由此可见，本发明磁源系统产生外加磁场的强度可调，动态荧光光谱采集和数据处理均由计算机10控制完成。

以一个具体实际应用为例，对本发明做详细说明。

在该实例中，具体步骤如下：

（1）确定荧光光谱的激发波长。用移液枪移取350μL隐花色素纯化蛋白PBS溶液（137mMNaCl、2.7mM KCl、10mM磷酸盐缓冲液，pH=7.3），注入容积为370μL的石英比色皿（1cm×1.5mm），将比色皿放入紫外/可见分光光度计样品池6夹具，保证狭缝朝向入射光一面，利用紫外/可见分光光度计测定蛋白在200～800nm的吸收曲线，结果蛋白上关键辅基分子的最强特征吸收峰位于400nm，考虑到脉冲激光器5倍频后可以产生的波长分别1064nm、532nm、355nm、266nm、213nm，所以设定实际激发波长λ_ex=355nm；

（2）确定荧光检测波长。将装有蛋白样品的比色皿放入稳态荧光光谱仪样品室11，保证狭缝朝向激发光一面，利用稳态荧光光谱仪测定蛋白在λ_ex=355nm激发波长下的稳态荧光发射光谱曲线，找到最强发射峰位于520nm，并参考样品的特征荧光峰峰位，确定检测波长λ_em=520nm；

（3）将装有蛋白样品的比色皿放入上述装置的样品池6夹具内，保证狭缝朝向激发光一面；

（4）计算机10发出指令，使脉冲激光器5产生波长为355nm、频率为100Hz、脉宽为0.1ns、脉冲能量为30mJ左右的脉冲激光；

（5）脉冲激光激发隐花色素蛋白溶液产生荧光；

（6）将单色仪12波长固定为520nm，样品被激发后发射的荧光经单色仪12分光后被光电倍增管8转化为电信号；

（7）通过数字存储式示波器9同时监测脉冲激光信号和光电倍增管信号，得到样品的时间分辨动态荧光光谱；

（8）设定线圈电流为0.1A，重复4～7步操作，得到第二条时间分辨动态荧光光谱，如图3所示；

（9）取出样品，利用磁力仪3测量样品池6中心区域磁场强度，结果如表1所示；

表1线圈内电流强度与样品池中心区域磁场强度的对应关系

（10）按照下式（2）对荧光曲线进行多阶拟合：

$R\left(t\right)=A+\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{B}_i{e}^{-\frac{t}{{\mathrm{\τ}}_i}}---\left(2\right)$

${\mathrm{\α}}_i=\frac{B_i}{B_1+B_2+\·\·\·+B_i+\·\·\·B_n}\×100\%---\left(3\right)$

其中，R(t)为被激发后t时刻样品的荧光强度，A为背底，B_i为指前因子，t为激发与测量的间隔时间，τ_i为荧光组分i的荧光寿命，α_i为荧光组分i的百分含量。拟合结果如表2所示，依据荧光寿命变化对样品的磁效应作出评价：隐花色素蛋白具有磁敏特性，能够感应μT级地磁场强度的变化。

表2不同外加磁场强度下纯化蛋白荧光寿命的拟合值

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的方法，其步骤如下：

（1）确定荧光光谱的激发波长；利用紫外/可见分光光度计测定样品在200～800nm的吸收曲线，找到样品最强特征吸收峰对应峰位，即为被测样品的最佳激发波长，结合激光器工作条件确定实际激发波长λ_ex；

（2）确定荧光检测波长；利用稳态荧光光谱仪测定样品在激发波长λ_ex作用下的稳态荧光发射光谱曲线，找到最强发射峰对应峰位，并参考样品的特征荧光峰峰位，确定被测样品的检测波长λ_em；

（3）放入样品；

（4）根据步骤（1）的测试结果，通过脉冲激光器产生波长为λ_ex的脉冲激光；

（5）利用步骤（4）产生的脉冲激光激发磁敏物质产生荧光；

（6）将单色仪波长固定为λ_em，样品被激发后发射的荧光经单色仪分光后被光电倍增管转化为电信号；

（7）监测脉冲激光信号和光电倍增管信号，得到样品的时间分辨动态荧光光谱；

（8）调节样品位置中心区域磁场强度，重复上述步骤（4）～（7）操作，得到一系列时间分辨动态荧光光谱；

（9）取出样品，利用磁力仪测量样品位置处中心区域磁场强度；

（10）按照下式对荧光曲线进行多阶拟合：

$R\left(t\right)=A+\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{B}_i{e}^{-\frac{t}{{\mathrm{\τ}}_i}}---\left(2\right)$

${\mathrm{\α}}_i=\frac{B_i}{B_1+B_2+\·\·\·+B_i+\·\·\·B_n}\×100\%---\left(3\right)$

其中，R(t)为被激发后t时刻样品的荧光强度，A为背底，B_i为指前因子，t为激发与测量的间隔时间，τ_i为荧光组分i的荧光寿命，α_i为荧光组分i的百分含量；最终依据荧光寿命变化对样品的磁效应作出评价。

2.一种利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的装置，其特征在于，包括磁源系统、光路系统、数据采集系统和控制处理系统，所述磁源系统包括亥姆霍兹线圈（1）、线圈电源（2）和磁力仪（3），所述线圈电源（2）与亥姆霍兹线圈（1）连接；所述光路系统包括激光器电源（4）、脉冲激光器（5）、样品池（6）以及各种滤光片，所述激光器电源（4）与脉冲激光器（5）相连；所述数据采集系统包括单色仪（12）、光电倍增管（8）和数字存储式示波器（9），所述数字存储式示波器（9）与光电倍增管（8）连接；所述控制处理系统包括总控制器（7）和计算机（10），所述总控制器（7）分别与激光器电源（4）、单色仪（12）、光电倍增管（8）、数字存储式示波器（9）相连，所述计算机（10）与总控制器（7）相连。

3.根据权利要求2所述的利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的装置，其特征在于，所述亥姆霍兹线圈（1）放置在样品室（11）内，所述样品池（6）放置在亥姆霍兹线圈（1）的中心区域。

4.根据权利要求2所述的利用时间分辨荧光光谱表征物质磁效应的装置，其特征在于，所述单色仪（12）放置在样品池（6）一侧、并与所述脉冲激光器（5）的激发光源成90°夹角的位置。

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