CN103642931A - 一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法。该方法包括下列步骤：对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断；以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断；分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒；将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞；培养植物组织细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响。该方法能够快速鉴定uORF对翻译水平影响。

Description

一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法。

背景技术

真核生物mRNA 5′转录起始点和开放性阅读框（open reading frame,ORF）的起始密码子ATG之间的核苷酸序列被称作5′非编码区。mRNA5′非编码区中存在的上游开放性阅读框(upstream open reading frame,uORF)在基因的翻译水平上的调控具有重要作用，一些uORF对下游开放性阅读框有抑制调控作用，而有一部分uORF则控制着mRNA的稳定性^［1］。尽管测序表明，许多真核生物序列中存在uORF对下游开放性阅读框翻译的影响研究，但局限于少部分基因。体内和离体实验表明uORF参与细胞生长调控，特别是通过细胞翻译能力的调控，一部分uORF能抑制ORF的翻译，也有一些对ORF影响不大，相反，有一些uORF能促进ORF翻译。序列中这些uORF对翻译水平影响的研究，对我们了解翻译水平的基因表达调控具有重要意义。

Imai等发现^［2］拟南芥acl5基因缺失的转基因植物表现出植株矮小的症状，而且SAC51基因的uORF若提前终止翻译，则会引起下游开放性阅读框的翻译水平上升。Wiese等^［3］研究发现在拟南芥AtbZIP11基因存在蔗糖引起的翻译抑制(SIRT)特性，且它的抑制翻译调控依赖于5′未翻译区域。42个氨基酸编码的一个uORF片段控制了下游主开放性阅读框的翻译作用，从而导致细胞内蔗糖浓度的变化以应对外界环境胁迫。

在瞬时基因表达方法中，基因枪导入法是一种比较快速有效的手段之一。通过基因枪将含有uORF片段的重组质粒DNA，打入植物组织细胞，再测定其相对荧光素酶活性，从而鉴定uORF对其翻译水平的影响。该方法的应用在分子水平鉴定uORF的作用具有重要作用。

参考文献：

［1］Tran M.K.,Schultz C.J.&Baumann U.(2008)Conserved upstream open reading framesin higher plants.BMC Genomics 9,361.

［2］Imai A.,Hanzawa Y.,Komura M.,Yamamoto K.T.,Komeda Y.&Takahashi T.(2006)The dwarf phenotype of the Arabidopsis acl5 mutant is suppressed by a mutation in anupstream ORF of a bHLH gene.Development 133,3575–3585.

［3］Wiese A.,Elzinga N.,Wobbes B.&Smeekens S.(2004)A conserved upstream openreading frame mediates sucrose-induced repression of translation.The Plant Cell 16,1717–1729.

发明内容

本发明的目的在于为鉴定植物基因中uORF片段对翻译水平的影响问题，提供一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法，该方法包括下列步骤：

a.对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断；

b.以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断；

c.分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒；

d.将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞；

e.培养植物组织细胞（经过22℃温室培养24小时后），用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响，即uORF对下游开放性阅读框影响。

所述的方法，其中目的基因为AtHsfB1、tbz17或AtPAO3，对应的uORF片段的序列分别为SEQ ID No:1，SEQ ID No:2，SEQ ID No:3。

所述的方法，其中步骤b中定点突变是将Met的密码子ATG突变为Leu密码子TTG，或者将ATG突变为CTG或GTG。原理就是不让启动子ATG启动。

所述的方法，其中步骤a中对目的基因的uORF片断进行扩增的方法为：

以植物幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，根据目的基因的uORF片段碱基序列，设计上游引物与下游引物，以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，扩增未突变uORF片段。片段可连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定。

所述的方法，其中步骤b中对目的基因的uORF片断进行人工定点突变并扩增的方法为：

根据定点突变的uORF片段的碱基序列，设计上游引物，下游引物同未突变uORF片断的下游引物，以未突变的uORF片段为模板，用高保真酶进行PCR反应，扩增突变的uORF片段。片段可连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定。

所述的方法，其中步骤c中构建重组质粒采用的表达载体为pGL3-Basic。可分别用KpnI和SmaI双酶切的未突变和突变片段与KpnI和SmaI双酶切的表达载体pGL3-Basic连接，转化，提取阳性质粒，测序验证。

所述的方法，其中步骤d中将重组质粒采用基因枪方法导入植物组织细胞的方法为：通过基因枪PDS-1000/He(Bio-Rad)的动力系统，将吸附重组质粒的直径为0.8-1.0μM优选为1.0μM的金粉粒子，打入植物组织细胞。

所述的方法，其中步骤e中比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，二者差异在两倍以上，则说明uORF对目的基因翻译水平的影响，反之，则没有影响。突变型高于未突变型两倍以上说明uORF起抑制作用，突变型低于未突变型两倍以上说明uORF起增强作用。

本发明的有益效果：

本发明提供的方法得到突变的uORF片段，采用基因枪技术导入植物细胞，测定其相对荧光素酶活性，从而鉴定uORF对翻译水平的影响。通过利用本方法可快速鉴定基因中5′未翻译区域对下游的翻译过程所起的作用，为研究5′未翻译区域的片段在蛋白质翻译过程的作用机理提供基础。所有的uORF都可以用这种方法来鉴定其对翻译水平的影响，如果这个uORF具有保守性，那么它的影响作用将比较明显；反之，如果这个uORF不具有保守性，那么突变或者不突变，它的活性基本不变，也就是说，uORF没有影响作用。

附图说明

图1为未突变的uORF片段琼脂糖凝胶电泳分析。

图中M：DNA Marker；1.AtHsfB1的uORF；2.tbz17的uORF；3.AtPAO3的uORF。

图2为突变后的uORF片段琼脂糖凝胶电泳分析。

图中M：DNA Marker；1.AtHsfB1的uORF；2.tbz17的uORF；3.AtPAO3的uORF。突变后的uORF片段与未突变的uORF片段长度一致。

图3植物表达载体pGL3-Basic图谱。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1：拟南芥热休克转录因子基因AtHsfB1的uORF对其翻译的影响作用鉴定。

拟南芥热休克转录因子基因AtHsfB1的uORF片段，该片段的序列为SEQ ID No.1。

1、对AtHsfB1的uORF片段进行人工突变的快速PCR定点突变方法，步骤如下：

1)拟南芥热休克转录因子基因AtHsfB1的uORF片段的克隆

以提取的拟南芥幼嫩叶片为材料，取500mg嫩叶，按照Trizol RNA提取试剂盒(Takara)说明书方法提取叶片总RNA，按照PrimeScript反转录试剂盒(Takara)取0.5μgRNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照AtHsfB1的uORF片段碱基序列（SEQ ID No:1），用Primer 5软件设计引物扩增uORF片段(未突变)。

上游引物AtHsfB1-F:5′-CTTGGTACCATGGAAGAAACCAAACGA-3′（SEQ IDNo:4）

下游引物AtHsfB1-R:5′-CTTCCCGGGGCAACTAAAAAGCAAGAG-3′（SEQ IDNo:5）

以幼嫩叶片的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

50μl反应体系：10×PCR Buffer 5.0μl,HsfB1的上下游引物（SEQ ID No:4和SEQ IDNo:5）各1.0μl(10μM)，dNTP mix 2.5μL(2.5mM)，cDNA模板1.0μl，ddH₂O 39.3μl，TaqDNA Polymerase 0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec,反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH 5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

2)拟南芥热休克转录因子AtHsfB1的uORF片段的定点突变

根据uORF片段的碱基序列和定点突变要求(ATG突变为TTG)，Primer 5软件设计上游引物扩增突变的uORF片段(下游引物同上)。

上游引物AtHsfB1-Ft:5′-CTTGGTACCTTGGAAGAAACCAAACGA-3′（SEQ IDNo:6）

以未突变的uORF片段为模板，用EX Taq高保真酶（TaKaRa公司，中国大连）进行PCR反应。

50μl反应体系：10×PCR Buffer 5.0μl,AtHsfB1的上下游引物（SEQ ID No:6和SEQID No:5）各1.0μl(10μM)，dNTP mix 2.5μl(2.5mM)，未突变的uORF片段模板1.0μl，ddH₂O 39.3μl，Taq DNA Polymerase 0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，后95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec,反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD 18-T Simple载体（TaKaRa公司，下同），转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

2、分别构建含有未突变uORF片断及突变uORF片断的重组质粒：用KpnI和SmaI双酶切分别连接有未突变片断及突变片断的pMD 18-T Simple，与KpnI和SmaI双酶切的表达载体pGL3-Basic（荧光素酶报告基因质粒，其中包含一个荧光素酶报告基因，在前面插入突变或未突变的片段来检查报告基因表达情况，可以用荧光素酶活性来判断荧光素酶报告基因表达情况，Promega公司）构建重组质粒，酶切体系40μl：10×H Buffer4.0μl，ddH₂O 18μl，pMD 18-T Simple（连接有未突变片断或突变片断）15μl，KpnI和SmaI各1.5μl；37℃反应2h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收质粒pGL3-Basic大片段和uORF小片段。用T₄连接酶连接两个回收产物，连接反应体系10μl：10×Ligase Buffer 4.0μl，pGL3-Basic大片段2.5μl，uORF小片段2.5μl，T₄DNA连接酶1.0μl；16℃过夜连接反应，取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选单克隆，待菌落PCR验证后，扩大培养，提取质粒pGL3-Basic-uORF，进行酶切和测序验证。植物表达重组质粒构建成功。

3、将2.0μg pGL3-Basic-uORF质粒与25μl金粉（直径1.0μM）溶液，10μl亚精胺(0.1M)充分混合，将干燥的混合物至于9.0MPa(1100psi)载物膜上，通过基因枪PDS-1000/He(Bio-Rad)的动力系统，打入拟南芥叶片组织细胞。

4、植物组织经过22℃温室培养24小时后，收集植物组织并用组织捣碎机在低温下磨成粉末，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司，中国上海)测定拟南芥热休克转录因子的uORF相对荧光素酶活性。检测方法按试剂盒说明书进行操作，经过比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，结果显示突变型的荧光素酶活性(6.74μgprotein^-1,min^-1)远高于未突变型的荧光素酶活性(1.42μg protein^-1,min^-1)，二者差异在两倍以上，说明AtHsfB1的uORF对下游的翻译过程有着抑制作用。

实施例2：烟草碱性亮氨酸蛋白基因tbz17的uORF对其翻译的影响作用鉴定。

烟草碱性亮氨酸蛋白基因tbz17的uORF片段，该片段的序列为SEQ ID No.2。

1、对tbz17的uORF片段进行人工突变的快速PCR定点突变方法,步骤如下：

1)烟草碱性亮氨酸蛋白基因tbz17的uORF片段的克隆

以提取的烟草幼嫩叶片为材料，取500mg嫩叶，按照Trizol RNA提取试剂盒(Takara)说明书方法提取叶片总RNA，按照PrimeScript反转录试剂盒(Takara)取0.5μgRNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照tbz17的uORF片段碱基序列（SEQ ID No:2），用Primer 5软件设计引物扩增uORF片段(未突变)。

上游引物tbz17-F:5′-TCTGGTACCATGACATACGCTATCCAG-3′（SEQ ID No:7）

下游引物tbz17-R:5′-CTTCCCGGGTCATGAAATTTCGTAGAA-3′（SEQ ID No:8）

以幼嫩叶片的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

50μl反应体系：10×PCR Buffer 5.0μl tbz17的上下游引物（SEQ ID No:7和SEQ IDNo:8）各1.0μl(10μM)，dNTP mix 2.5μl(2.5mM)，cDNA模板1.0μl，ddH₂O 39.3μl，TaqDNA Polymerase 0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，后95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec,反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

2)烟草碱性亮氨酸蛋白基因tbz17的uORF片段的定点突变

根据uORF片段的碱基序列和定点突变要求(ATG突变为TTG)，Primer 5软件设计上游引物扩增突变的uORF片段(下游引物同上)。

上游引物tbz17-Ft:5′-TCTGGTACCTTGACATACGCTATCCAG-3′（SEQ ID No:9）

以未突变的uORF片段为模板，用EX Taq高保真酶进行PCR反应,

50μl反应体系：10×PCR Buffer 5.0μl，tbz17的上下游引物（SEQ ID No:9和SEQ IDNo:8）各1.0μl(10μM)，dNTP mix 2.5μl(2.5mM)，未突变的uORF片段模板1.0μl，ddH₂O39.3μl，Taq DNA Polymerase 0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，后95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec,反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD 18-TSimple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

2、分别构建含有未突变uORF片断及突变uORF片断的重组质粒：用KpnI和SmaI双酶切分别连接有未突变片断及突变片断的pMD 18-T Simple，与KpnI和SmaI双酶切的表达载体pGL3-Basic构建重组质粒，酶切体系40μl：10×H Buffer 4.0μl，ddH₂O 18μl，pMD 18-T Simple（连接有未突变片断或突变片断）15μl，KpnI和SmaI各1.5μl；37℃反应2h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收质粒pGL3-Basic大片段和uORF小片段。用T4连接酶连接两个回收产物，连接反应体系10μl：10×LigaseBuffer4.0μl，pGL3-Basic大片段2.5μl，uORF小片段2.5μl，T₄DNA连接酶1.0μl；16℃过夜连接反应，取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选阳性单克隆扩大培养，提取质粒pGL3-Basic-uORF，进行酶切和测序验证。植物表达重组质粒构建成功。

3、将2.0μg pGL3-Basic-uORF质粒与25μl金粉（直径1.0μM）溶液，10μl亚精胺(0.1M)充分混合，将干燥的混合物至于9.0MPa(1100psi)膜上，通过基因枪PDS-1000/He(Bio-Rad)的动力系统，打入植物组织细胞。

4、植物组织经过22℃温室培养24小时后，收集植物组织并用组织捣碎机在低温下磨成粉末，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)测定其相对荧光素酶活性。检测方法按试剂盒说明书进行操作，经过比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，结果显示突变型的荧光素酶活性(0.98μg protein^-1,min^-1)远低于未突变型的荧光素酶活性(4.19μg protein^-1,min^-1)，二者差异在两倍以上，说明tbz17的uORF对下游翻译过程起着增强作用。

实施例3：拟南芥多胺氧化酶基因AtPAO3的uORF对其翻译的影响作用鉴定。

拟南芥多胺氧化酶基因AtPAO3的uORF片段，该片段的序列为SEQ ID No.3。

1、对AtPAO3的uORF片段进行人工突变的快速PCR定点突变方法，步骤如下：

1)拟南芥多胺氧化酶基因AtPAO3的uORF片段的克隆

以提取的拟南芥幼嫩叶片为材料，取500mg嫩叶，按照Trizol RNA提取试剂盒(Takara)说明书方法提取叶片总RNA,按照PrimeScript反转录试剂盒(Takara)取0.5ugRNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照AtPAO3的uORF片段碱基序列（SEQ ID No:3），用Primer 5软件设计引物扩增uORF片段(未突变)。

上游引物AtPAO3-F:5′-CGCGGTACCATGAATTTTTTTAGAAAA-3′（SEQ IDNo:10）

下游引物AtPAO3-R:5′-CTTCCCGGGACAATGAACGGAGTAATT-3′（SEQ IDNo:11）

以幼嫩叶片的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

50μl反应体系：10×PCR Buffer 5.0μl，AtPAO3的上下游引物（SEQ ID No:10和SEQID No:11）各1.0μl(10μM)，dNTP mix 2.5μl(2.5mM)，cDNA模板1.0μl，ddH₂O 39.3μl，Taq DNA Polymerase 0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，后95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

2)拟南芥多胺氧化酶基因AtPAO3的uORF片段的定点突变

根据uORF片段的碱基序列和定点突变要求(ATG突变为TTG)，Primer 5软件设计上游引物扩增突变的uORF片段(下游引物同上)。

上游引物AtPAO3-Ft:5′-CGCGGTACCTTGAATTTTTTTAGAAAA-3′（SEQ IDNo:12）

以未突变的uORF片段为模板，用EX Taq高保真酶进行PCR反应。

50μl反应体系：10×PCR Buffer5.0μL，AtPAO3的上下游引物（SEQ ID No:12和SEQ ID No:11）各1.0μl(10μM)，dNTP mix 2.5μl(2.5mM)，未突变的uORF片段模板1.0μl，ddH₂O 39.3μL，Taq DNA Polymerase 0.2μL；PCR程序：95℃预变性4min，后95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec,反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD 18-T Simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。

2、分别构建含有未突变uORF片断及突变uORF片断的重组质粒：用KpnI和SmaI双酶切分别连接有未突变片断及突变片断的pMD 18-T Simple，与KpnI和SmaI双酶切的表达载体pGL3-Basic构建重组质粒，酶切体系40μl：10×H Buffer 4.0μl，ddH₂O 18μl，pMD 18-T Simple（连接有未突变片断或突变片断）15μl，KpnI和SmaI各1.5μl；37℃反应2h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收质粒pGL3-Basic大片段和uORF小片段。用T₄连接酶连接两个回收产物，连接反应体系10μl：10×LigaseBuffer 4.0μL，pGL3-Basic大片段2.5μL，uORF小片段2.5μl，T₄DNA连接酶1.0μl；16℃过夜连接反应，取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选阳性单克隆扩大培养，提取质粒pGL3-Basic-uORF，进行酶切和测序验证。植物表达重组质粒构建成功。

将2.0μg pGL3-Basic-uORF重组质粒，25μl直径1.0μM的金粉粒子，10μl亚精胺(0.1M)充分混合，将干燥的混合物至于9.0MPa(1100psi)膜上，通过基因枪PDS-1000/He(Bio-Rad)的动力系统，打入植物组织细胞。

植物组织经过22℃温室培养24小时后，收集植物组织并用组织捣碎机在低温下磨成粉末，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)测定其相对荧光素酶活性。检测方法按试剂盒说明书进行操作，经过比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，结果显示突变型的荧光素酶活性(4.58μg protein^-1,min^-1)远高于未突变型的荧光素酶活性(0.89μg protein^-1,min^-1)，二者差异在两倍以上，说明AtPAO3的uORF对下游的翻译过程有着抑制作用。

Claims (8)

1.一种快速鉴定uORF对翻译水平影响的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

a.对目的基因的uORF片断进行扩增，得未突变的uORF片断；

b.以未突变的uORF片段为模板，对目的基因的uORF片断进行定点突变并扩增，得突变的uORF片断；

c.分别将未突变的uORF片断和突变的uORF片断构建重组质粒；

d.将上述重组质粒采用基因枪方法分别导入植物组织细胞；

e.培养植物组织细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，鉴定uORF对目的基因翻译水平的影响，即uORF对下游开放性阅读框影响。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于目的基因为AtHsfB1、tbz17或AtPAO3，对应的uORF片段的序列分别为SEQ ID No:1，SEQ ID No:2，SEQ ID No:3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中定点突变是将Met的密码子ATG突变为Leu密码子TTG，或者将ATG突变为CTG或GTG。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中对目的基因的uORF片断进行扩增的方法为：

以植物幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，根据目的基因的uORF片段碱基序列，设计上游引物与下游引物，以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，扩增未突变uORF片段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中对目的基因的uORF片断进行人工定点突变并扩增的方法为：

根据定点突变的uORF片段的碱基序列，设计上游引物，下游引物同未突变uORF片断的下游引物，以未突变的uORF片段为模板，用高保真酶进行PCR反应，扩增突变的uORF片段。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中构建重组质粒采用的表达载体为pGL3-Basic。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中将重组质粒采用基因枪方法导入植物组织细胞的方法为：通过基因枪PDS-1000/He(Bio-Rad)的动力系统，将吸附重组质粒的直径为0.8-1.0μM优选为1.0μM的金粉粒子，打入植物组织细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e中比较突变型与未突变型的相对荧光素酶活性，二者差异在两倍以上，则说明uORF对目的基因翻译水平的影响，反之，则没有影响。

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