CN103642855A - 一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种柠檬酸生产发酵工艺，其特点是在柠檬酸发酵过程中，向发酵罐中流加蛋白酶，使培养基中的蛋白质水解成小分子肽类、氨基酸等菌种能快速利用的氮源。本发明不仅可以提高发酵液中菌种可直接利用的氨基酸含量，还可以使与蛋白结合的淀粉颗粒充分溶出，降低发酵液粘度，提高发酵液中氧的传递效率，加快菌种产酸，解决了目前柠檬酸生产中发酵的初期菌种利用蛋白质的效果差的不足，缩短发酵周期，降低残总糖和发酵粮耗，提高企业的经济效益。

Description

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产柠檬酸的方法，尤其涉及一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法。

背景技术

柠檬酸，学名2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，分子式C₆H₈O₇ (无水物)，是一种广泛地应用于食品，医药和化工领域的有机酸。随着经济的发展，各行各业对柠檬酸的需求量将稳步上升，当然各企业面对的挑战与机遇也越来越多。主要用于食品工业、医药业、化学工业, 并且在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中也有十分广阔的应用。

目前，柠檬酸发酵生产中存在发酵初期菌种利用蛋白质的效果差，菌种生长过慢，发酵产酸速度较慢，菌种过度消耗碳源，发酵残总糖偏高，糖酸转化率偏低，发酵周期偏长、能耗高，设备利用率低等不足之处，严重制约了柠檬酸行业的发展。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，提高了发酵产酸速率、缩短了发酵周期，又能提高产酸和转化率，解决了目前柠檬酸生产中发酵的初期菌种利用蛋白质的效果差的不足，特别是菌种能快速利用的氨基酸不足，造成菌种生长过慢，发酵产酸延滞，发酵周期偏长、能耗高和设备利用率低等问题。

本发明的具体步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉；

（2）将步骤（1）所得的玉米粉加水调浆，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入5-30个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将步骤（2）所得的玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，得液化液；

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积2.5-10%的液化液，投入种子罐中，加入氮源，每升发酵液中加入0.05-0.5g氮源，在80-121℃消毒15-30分钟后，降温至30-38℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养26-32h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积10-25%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液过滤得过滤清液；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积65-80%的过滤清液投入发酵罐中，80-121℃消毒15-30分钟后，降温至35-38℃；

（8）将步骤（4）中培养好的发酵液转移到发酵罐中，向发酵罐中流加蛋白酶，蛋白酶的添加量为每克干基5-30个酶单位，干基为发酵液中的纯干物质，35-38℃通风搅拌至发酵终了。

首先，将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后的玉米粉过60目筛透过率为60%以上，若玉米粉粒度过大，不利于液化；若玉米粉粒度过小，会给粉碎工序增加较大的难度，增加电耗和工作量，所以粉碎后的玉米粉60目的透过率在60%以上时利于液化并且节约成本。加水调浆，调浆后玉米粉的质量分数为10-35%，在此质量分数内便于进行液化反应且节约成本，玉米粉的质量分数过高造成料液输送困难，难于液化；过低造成液化喷射所用蒸汽消耗增加，增加生产成本。pH为5.0-7.8，由于pH过高或过低都会使得淀粉酶的活性受到抑制，不利于后期的液化，导致玉米渣中残留的淀粉较多，造成部分的淀粉的损失，引起资源的浪费，所以通过添加少量柠檬酸母液或者生石灰对玉米粉调浆的pH进行调节，调节后控制在5.0-7.8，在此范围内取得最佳的实验效果。并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入5-30个酶单位的耐高温α-淀粉酶，加入过多造成生产成本增加，加入过少使得液化效果较差，得玉米粉浆。

将玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，得液化液，第一次喷射液化主要是促进淀粉酶与淀粉的迅速作用，使得淀粉初步液化，为了保证淀粉酶和稳定性都较高，有利于淀粉的液化，第一次喷射液化温度为95-97℃，第二次喷射液化主要是高温条件下蛋白质的凝聚和难溶性淀粉酶颗粒的膨胀溶出，降低了液化液的粘度，有利于后续的过滤，为了促进蛋白质的凝聚和难溶性淀粉酶颗粒的膨胀溶出，第二次喷射液化温度为125-130℃，在液化层流罐中维持1-6个小时，若维持时间过短则反应不完全，若维持时间过长则造成时间的浪费，液化DE值为10-35%，通过控制适当的液化层流时间来控制最终的液化DE值，液化DE值偏低说明液化效果差，料液发粘，不利于过滤和发酵溶氧的提高；液化DE值偏高说明液化过头，可能造成非发酵性糖类产生偏多，不利于菌种利用产酸，因此控制液化DE值为10-35%时实验效果最佳。

取上述占最终发酵液总体积2.5-10%的液化液，通过控制液化液加量控制种子液培养的有机氮源含量，体积过高菌种生产过于旺盛，过低菌种生长较差，投入种子罐中，加入氮源，采用蒸汽升温至80-121℃，若温度过高会对培养基中的营养物质造成破坏，若温度过低造成消毒不彻底，容易引起染菌，经多次实验确定以上温度范围可以取得最佳实验效果，蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒，穿透力强，灭菌彻底的特点，适合工业化生产。消毒15-30分钟，高温消毒条件下时间过长会造成培养基中的营养物质被破坏，不利于菌种吸收利用，时间过短造成消毒不彻底，容易引起染菌，因此消毒15-30分钟为最佳消毒时间。降温至30-38℃，温度过高会抑制甚至杀死孢子，温度过低孢子萌发的慢。接入黑曲霉孢子悬浮液，本申请中所用菌种为黑曲霉，生产中即以黑曲霉孢子悬浮液作为菌种，编号为Co827，由天津工业微生物研究所购买所得，采用孢子悬浮液易于生产操作，防止孢子逸出，黑曲霉孢子悬浮液的接入量为本领域的常规用量即可。进行培养基培养26-32h，培养时间过长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；培养时间过短，种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。每升发酵液中加入0.01-0.05g氮源，氮源是菌种合成细胞物质（蛋白质、氨基酸、核酸、维生素等）和调节代谢的营养基础物质，氮源含量过低菌种生长缓慢，不利于菌种快速进入产酸阶段；氮源含量过高菌种生长容易过于旺盛，以生长为主而不利于菌种进入产酸阶段和积累柠檬酸，产酸率不高，选择以上氮源加入量可以取得最佳实验效果；本过程中，由于液化液可以直接作为有机氮源使用，所以只需要加入无机氮源即可，无机氮源选自硫酸铵、磷酸氢铵、尿素、硝酸铵、柠檬酸铵中的一种或其混合物。

取上述占最终发酵液总体积10-25%的液化液投入发酵罐，通过添加适当的液化液来控制发酵液中有机氮的含量，体积过高菌种生长过于旺盛，产酸偏低，转化率差；体积过低菌种生长缓慢，造成发酵周期偏长；

将上述剩余的液化液过滤得过滤清液；

取上述占最终发酵总体积65-80%的过滤清液投入发酵罐中，通过添加适当的液化过滤液来控制发酵液中有机氮的含量，体积过高氮源含量偏低，菌种生长过于缓慢，造成发酵周期偏长；体积过高菌种生长过于旺盛，造成发酵产酸偏低，转化率低，80-121℃消毒，若温度过高会对培养基中的营养物质造成破坏，若温度过低造成消毒不彻底，容易引起染菌，经多次实验确定以上温度范围可以取得最佳实验效果。消毒15-30分钟，高温消毒条件下时间过长会造成培养基中的营养物质被破坏，不利于菌种吸收利用，时间过短造成消毒不彻底，容易引起染菌，因此消毒15-30分钟为最佳消毒时间之后降温至35-38℃，温度过高会抑制甚至杀死孢子，温度过低孢子萌发的慢。

将上述培养基中培养好的发酵液转移到发酵罐中，向发酵罐中流加蛋白酶，蛋白酶的添加量为每克干基5-30个酶单位，35-38℃通风搅拌至发酵终了。

发酵过程中，本发明采用流加蛋白酶的方式来进行柠檬酸发酵，主要是因为在不同的发酵阶段料液的pH不同，需要考虑流加不同的蛋白酶，本发明中采用流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的一种或两种，流加速度为4-10kg/h，随着发酵的进行，黑曲霉自身通过代谢产生部分蛋白酶，若流加速度过快，蛋白酶浓度急速增加会抑制菌种代谢生长；若流加速度过慢又达不到水解发酵液中蛋白质的作用，影响菌种生长及快速代谢利用氨基酸、小分子肽类物质等，因此将流加速度控制在4-10kg/h可以取得最佳试验效果。流加时间为1-8h，这主要是因为蛋白酶作用的最佳pH范围在2.5-8.0之间，随发酵进行料液pH逐渐降低，在8h时料液pH已经降到2.5以下，已经超出蛋白酶作用的最佳范围，因此将流加时间控制在1-8h。当流加两种蛋白酶时选择先流加中性蛋白酶再流加酸性蛋白酶，这主要是因为流加初期pH值较高，这个阶段中性蛋白酶的活性高，随发酵的进行pH值降低，酸性蛋白酶的活性高，选择以上顺序可以保证两种蛋白酶发挥最佳的活性。通过流加蛋白酶能加快发酵液中蛋白质物质的水解，提高发酵液中氨基酸、小分子肽类物质的含量，有利于菌种快速的吸收利用，加快菌种的生长与产酸。若蛋白酶的添加量过低蛋白质的水解效果较差，起不到明显的促进菌种生长的作用，而添加量过大会造成成本的上升，所以本发明中蛋白酶的添加量为每克干基5-30个酶单位。本发明中的中性蛋白酶为苏柯汉（潍坊）生物有限公司提供的SUKAPro NE中性蛋白酶，酶活力为50000U/mL，适用pH范围为6.0-8.0，温度为10-60℃；酸性蛋白酶为山东隆大生物工程有限公司提供的真菌酸性蛋白酶，酶活力为50000U/mL或100000U/mL，适用pH范围为2.5-6.0，温度为30-50℃，上述中性蛋白酶和真菌酸性蛋白酶均为市售商品。

由于温度过低，菌种生长代谢速度缓慢，导致发酵周期过长；温度过高会对菌种生长、代谢产生不利影响，导致产生其他的杂酸、代谢物质，给后续的提取增加负担，所以发酵温度控制在35-38℃。当发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）为0-0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）为0-1.0%时即为发酵终了可终止发酵。最终的发酵液可以采用常用的钙盐法提取其中的柠檬酸。

本发明所述的最终发酵总体积是根据实际生产过程中发酵罐的体积确定的。

发酵过程中正常产酸量采用酸碱滴定法，以氢氧化钠作为标准液，酚酞作为指示剂进行测定。具体步骤如下：

1、试剂和溶液 

1.1 氢氧化钠：c（NaOH）=0.1429mol/L因氢氧化钠标准滴定液需标定，浓度以标定浓度c为准，系数=c/0.1429

1.2 酚酞：10g/L乙醇溶液 

2、检测方法 

 吸取1mL待测料液于三角瓶中，加水50mL，加2滴酚酞指示剂，用c(NaOH ) =0.1moL/L 氢氧化钠滴定至溶液呈粉红色，半分钟内不褪色为终点。

3、结果计算：

以质量比分数表示柠檬酸的含量按下式计算：

X% =V×c/0.1429

式中，V为滴定消耗氢氧化钠标准溶液的体积，读取结果应保留2位小数。

两次平行测定酸度之差不大于0.1%，取其算术平均值为测定结果。

4、取样及样品预处理： 

发酵过程产酸，每隔4小时在发酵罐取样口取样，先将取样杯用醪液冲洗两次，然后取醪液约300mL，取样杯里放250目滤网滤掉菌丝体，吸取清液检测。临近放罐时加大取样频次。

还原糖的量采用以下具体步骤进行测定： 

1、试剂：

1.1 费林甲液：30gCuSO₄加蒸馏水1000mL溶液。

1.2 费林乙液：100g酒石酸钾钠，加108gNaOH、8g黄血盐加蒸馏水配制成 1000mL溶液。

1.3 标准葡萄糖溶液：精确称取1g无水葡萄糖，加5mL浓盐酸配制成1000mL溶液。

1.4 次甲基蓝：4g/L乙醇溶液

2、检测方法：

于250mL三角瓶中，加费林甲、乙液各5mL，吸取发酵液0.1mL放入，加次甲基蓝指示剂1滴，用标准葡萄糖滴定至蓝色消失为终点。同时作空白试验。 

3、结果计算： 

以质量百分数表示的总糖含量（X₁）按下式计算： 

X₁ =V ₀ -V ₁

式中： 

V ₁为滴定试样时用去葡萄糖标准溶液的体积/mL； 

V ₀为空白实验时用去葡萄糖标准溶液的体积/mL；

4、取样及样品预处理：

发酵过程还原糖检测，每隔8小时在发酵罐取样口取样，取样杯里放250目滤网滤掉菌丝体，吸取清液检测。

另外，本发明中液化液过滤后的玉米糖渣可以用于生产高蛋白饲料，而发酵液过滤后的菌丝体可以用来提取壳聚糖或柠檬酸糟饲料。

综上所述，本发明将采用目前普遍采用的连续喷射液化工艺进行液化，同时通过流加中性蛋白酶或酸性蛋白酶中的一种或两种，并调整相应的生产参数与之适应，加快菌种吸收利用氮源的速度，促进菌种的生长和产酸，提高了整体发酵强度，缩短了发酵周期，达到了节能降耗的效果，为柠檬酸行业的发展指明方向；同时，玉米糖渣具有较高的附加值，可以用于生产高蛋白饲料，而发酵液过滤后的菌丝体可以用来提取壳聚糖或生产柠檬酸糟饲料，同样具有可观的经济效益，具有良好的市场前景，既减少了对环境的污染，变废为宝，又能创造良好的经济效益，综合提高了企业的竞争力和经济效益。本发明中添加的蛋白酶是黑曲霉自身生长过程中产生的一种酶类代谢物，本发明中通过流加蛋白酶是在不补充碳源、氮源前提下通过外加酶来促进菌种的生长代谢和产酸，从而达到高产酸、高转化率、低粮耗的目的。

具体实施方式

实施例1

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透过率为75%；

（2）将玉米粉加水调浆至质量分数为10%，pH值为6.22，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入5个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将上述玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，第一次喷射温度为95℃，第二次喷射温度为125℃，在液化层流罐中维持1.5个小时，液化DE值为22.2%； 

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积2.5%的液化液，投入种子罐中，加入硫酸铵，每升发酵液中加入0.05g硫酸铵，在121℃消毒30分钟后，降温至32℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养，培养26h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积20%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液采用板框过滤机过滤得过滤清液，过滤得玉米糖渣用于生产高蛋白饲料；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积70%的过滤清液投入发酵罐中，100℃消毒30分钟后，降温至37℃；

（8）向步骤（7）中的培养基中流加中性蛋白酶至发酵罐中，流加速度为5kg/h，流加6h，35℃通风搅拌至发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）低于0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）低于1.0%，即为发酵终了，中性蛋白酶的添加量为每克干基5个酶单位。

发酵液送至提取车间采用钙盐法提取发酵液中的柠檬酸，发酵液过滤后的菌丝体用来生产柠檬酸糟饲料。

实施例2

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透过率为80%；

（2）将玉米粉加水调浆至质量分数为20%，pH值为5.0，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入10个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将上述玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，第一次喷射温度为96℃，第二次喷射温度为128℃，在液化层流罐中维持1个小时，液化DE值为10%； 

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积7.5%的液化液，投入种子罐中，加入硫酸铵和硝酸铵，每升发酵液中加入0.04g硫酸铵和0.06g硝酸铵，在100℃消毒20分钟后，降温至30℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养，培养32h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积15%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液采用板框过滤机过滤得过滤清液，过滤得玉米糖渣用于生产高蛋白饲料；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积75%的过滤清液投入发酵罐中，80℃消毒20分钟后，降温至36℃；

（8）向步骤（7）中的培养基中流加酸性蛋白酶至发酵罐中，流加酸性蛋白酶8h，流加速度为5kg/h，36℃通风搅拌至发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）低于0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）低于1.0%，即为发酵终了，酸性蛋白酶的添加量为每克干基20个酶单位。

发酵液送至提取车间采用钙盐法提取发酵液中的柠檬酸，发酵液过滤后的菌丝体用来提取壳聚糖。

实施例3

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透过率为67.5%；

（2）将玉米粉加水调浆至质量分数为30%，pH值为5.92，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入15个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将上述玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，第一次喷射温度为95℃，第二次喷射温度为130℃，在液化层流罐中维持3.5个小时，液化DE值为35%； 

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积10%的液化液，投入种子罐中，加入柠檬酸铵和磷酸氢铵，每升发酵液中加入0.25g柠檬酸铵和0.05g磷酸氢铵，在121℃消毒15分钟后，降温至38℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养，培养27h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积20%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液采用板框过滤机过滤得过滤清液，过滤得玉米糖渣用于生产高蛋白饲料；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积70%的过滤清液投入发酵罐中，90℃消毒30分钟后，降温至37℃；

（8）向步骤（7）中的培养基中流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶至发酵罐中，先流加中性蛋白酶2h，流加速度为5kg/h，再流加酸性蛋白酶6h，流加速度为5kg/h，37℃通风搅拌至发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）低于0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）低于1.0%，即为发酵终了，中性蛋白酶的添加量为每克干基5个酶单位，酸性蛋白酶的添加量为每克干基15个酶单位。

发酵液送至提取车间采用钙盐法提取发酵液中的柠檬酸，发酵液过滤后的菌丝体用来生产柠檬酸糟饲料。

实施例4

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透过率为60%；

（2）将玉米粉加水调浆至质量分数为35%，pH值为7.8，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入30个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将上述玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，第一次喷射温度为97℃，第二次喷射温度为125℃，在液化层流罐中维持6个小时，液化DE值为10%； 

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积7.5%的液化液，投入种子罐中，加入尿素、柠檬酸铵和磷酸氢铵，每升发酵液中加入0.1g尿素、0.1g柠檬酸铵和0.05g磷酸氢铵，在90℃消毒25分钟后，降温至32℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养，培养28h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积25%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液采用板框过滤机过滤得过滤清液，过滤得玉米糖渣用于生产高蛋白饲料；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积65%的过滤清液投入发酵罐中，121℃消毒25分钟后，降温至37℃；

（8）向步骤（7）中的培养基中流加酸性蛋白酶至发酵罐中，流加酸性蛋白酶12h，流加速度为5kg/h，38℃通风搅拌至发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）低于0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）低于1.0%，即为发酵终了，酸性蛋白酶的添加量为每克干基30个酶单位。

发酵液送至提取车间采用钙盐法提取发酵液中的柠檬酸，发酵液过滤后的菌丝体用来提取壳聚糖。

实施例5

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透过率为68%；

（2）将玉米粉加水调浆至质量分数为25%，pH值为6.17，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入20个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将上述玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，第一次喷射温度为95℃，第二次喷射温度为128℃，在液化层流罐中维持2个小时，液化DE值为21.2%； 

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积5%的液化液，投入种子罐中，加入柠檬酸铵和磷酸氢铵，每升发酵液中加入0.35g柠檬酸铵和0.15g磷酸氢铵，在111℃消毒30分钟后，降温至37℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养，培养30h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积15%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液采用板框过滤机过滤得过滤清液，过滤得玉米糖渣用于生产高蛋白饲料；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积75%的过滤清液投入发酵罐中，111℃消毒30分钟后，降温至37℃；

（8）向步骤（7）中的培养基中流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶至发酵罐中，先流加中性蛋白酶1h，流加速度为10kg/h，再流加酸性蛋白酶5h，流加速度为4kg/h，37℃通风搅拌至发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）低于0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）低于1.0%，即为发酵终了，中性蛋白酶的添加量为每克干基5个酶单位，酸性蛋白酶的添加量为每克干基10个酶单位。

发酵液送至提取车间采用钙盐法提取发酵液中的柠檬酸，发酵液过滤后的菌丝体用来生产柠檬酸糟饲料。

实施例6

一种柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透过率为71%；

（2）将玉米粉加水调浆至质量分数为27%，pH值为6.05，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入15个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将上述玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，第一次喷射温度为95℃，第二次喷射温度为127℃，在液化层流罐中维持3个小时，液化DE值为25%； 

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积5%的液化液，投入种子罐中，加入硫酸铵、柠檬酸铵和磷酸氢铵，每升发酵液中加入0.1g硫酸铵、0.25g柠檬酸铵和0.10g磷酸氢铵，在121℃消毒30分钟后，降温至38℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养，培养29h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积15%的液化液投入发酵罐；

（6）将步骤（3）中剩余的液化液采用板框过滤机过滤得过滤清液，过滤得玉米糖渣用于生产高蛋白饲料；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积80%的过滤清液投入发酵罐中，90℃消毒30分钟后，降温至37℃；

（8）向步骤（7）中的培养基中流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶至发酵罐中，先流加中性蛋白酶2h，流加速度为7.5kg/h，再流加酸性蛋白酶5h，流加速度为6kg/h，37℃通风搅拌至发酵罐正常产酸每小时的质量体积分数（W柠檬酸/V发酵液）低于0.1%，还原糖的质量体积分数（W还原糖/V发酵液）低于1.0%，即为发酵终了，中性蛋白酶的添加量为每克干基10个酶单位，酸性蛋白酶的添加量为每克干基15个酶单位。

发酵液送至提取车间采用钙盐法提取发酵液中的柠檬酸，发酵液过滤后的菌丝体用来提取壳聚糖。

将实施例1-6的各项指标与现有技术进行对比，发现本发明的各项指标明显优于现有技术，结果如表1：

	发酵周期（h）	产酸（%）	转化率（%）	发酵指数（g/L·h）
					现有技术	60.7	16.67	95.28	2.74
实施例1	54	18.07	101.52	3.35
					实施例2	56	18.57	102.03	3.32
实施例3	59	20.45	101.24	3.47
					实施例4	62	20.71	98.62	3.34
实施例5	52	17.97	102.67	3.46
					实施例6	54	18.93	102.32	3.51

综上所述，本发明柠檬酸发酵过程流加蛋白酶的方法，采用目前普遍采用的连续喷射液化工艺进行液化，同时通过流加中性蛋白酶或酸性蛋白酶中的一种或两种，并调整相应的生产参数与之适应，加快菌种吸收利用氮源的速度，促进菌种的生长和产酸，提高了整体发酵强度，缩短了发酵周期，提高了产酸量和转化率，达到了节能降耗的效果；同时，玉米糖渣具有较高的附加值，可以用于生产高蛋白饲料，而发酵液过滤后的菌丝体可以用来提取壳聚糖或生产柠檬酸糟饲料，既减少了对环境的污染，变废为宝，又能创造良好的经济效益，综合提高了企业的竞争力和经济效益。

Claims (7)

1.一种柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：其步骤为：

（1）将玉米粉碎制备玉米粉；

（2）将步骤（1）所得的玉米粉加水调浆，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克玉米粉加入5-30个酶单位的耐高温α-淀粉酶，得玉米粉浆；

（3）将步骤（2）所得的玉米粉浆输送至喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，得液化液；

（4）取步骤（3）中占最终发酵液总体积2.5-10%的液化液，投入种子罐中，加入氮源，每升发酵液中加入0.05-0.5g氮源，在80-121℃消毒15-30分钟后，降温至30-38℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行培养基培养26-32h；

（5）取步骤（3）中占最终发酵液总体积10-25%的液化液投入发酵罐； 

（6）将步骤（3）中剩余的液化液过滤得过滤清液；

（7）取步骤（6）中占最终发酵总体积65-80%的过滤清液投入发酵罐中，80-121℃消毒15-30分钟后，降温至35-38℃；

（8）将步骤（4）中培养好的发酵液转移到发酵罐中，向发酵罐中流加蛋白酶，蛋白酶添加量为每克干基5-30个酶单位，干基为发酵液中的纯干物质，35-38℃通风搅拌至发酵终了。

2.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：步骤（1）所述的粉碎后的玉米粉过60目筛透过率为60%以上。

3.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：步骤（2）所述的玉米粉调浆后玉米粉的质量分数为10-35%。

4.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：步骤（2）所述的玉米粉调浆后pH为5.0-7.8。

5.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：步骤（3）所述的第一次喷射温度为95-97℃，第二次喷射温度为125-130℃，在液化层流罐中维持1-6个小时，液化DE值为10-35%。

6.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：步骤（4）所述的氮源为无机氮源，选自硫酸铵、磷酸氢铵、尿素、硝酸铵、柠檬酸铵中的一种或其混合物。

7.根据权利要求1所述的柠檬酸生产发酵工艺，其特征在于：步骤（8）所述的蛋白酶为中性蛋白酶、酸性蛋白酶中的一种或两种，流加速度为4-10kg/h，流加时间为1-8h。