CN109486872A - 一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法 - Google Patents

一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，其特点是在柠檬酸发酵过程中，向发酵液中流加钙剂，包括但不仅限于碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙等，使一部分柠檬酸转化为柠檬酸氢钙，降低了发酵液中柠檬酸浓度，从而减弱了柠檬酸对关键酶‑磷酸果糖激酶的抑制；同时pH的相对升高缓解了菌种对低酸的耐受，使得相关关键酶活性相对提高，加快了产酸速度，缩短了发酵周期。在发酵过程中产生的柠檬酸氢钙在高浓度柠檬酸条件下是可溶的，发酵结束后随发酵液除去菌体后，进入传统的钙盐提纯法。本发明打破了传统柠檬酸发酵不控pH的界限，使得合成柠檬酸关键酶活性相对提高，加快了产酸速度，缩短了发酵周期，而且相对提高了发酵液产物终浓度，更有利于后提取工艺，最终提高了企业的经济效益。

Description

一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法
技术领域
本发明涉及柠檬酸发酵领域，具体涉及一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法。
背景技术
柠檬酸，是一种非常重要的有机酸，学名2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，分子式C6H8O7(无水物)，无臭，有令人愉悦的酸味，是一种广泛地应用于食品，医药和化工领域的有机酸。随着经济的发展，各行各业对柠檬酸的需求量稳步上升，主要用于食品工业、医药业和化学工业,并且在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中也有十分广泛的应用，主要被用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂和除腥脱臭剂等。
目前，柠檬酸发酵生产中存在着发酵过程中随着柠檬酸的积累，pH的降低，导致合成柠檬酸关键酶活性降低，产酸高峰期维持时间短，导致发酵周期长、发酵液最终浓度较低，从而导致能耗高，设备利用率低等问题，严重制约了柠檬酸行业的发展。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法来控制pH，使一部分柠檬酸转化为柠檬酸氢钙，降低了柠檬酸浓度，从而减弱了柠檬酸对关键酶-磷酸果糖激酶的抑制；同时pH的相对升高缓解了菌种对低酸的耐受，使得相关关键酶活性相对提高，最终加快了产酸速度，缩短了发酵周期，提高了最终发酵液产物的浓度。
本发明的具体步骤为：
(1)配制钙剂浆液，121℃灭菌30分钟，得到无菌钙剂浆液，待用；
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，随着发酵进行，发酵液pH降低，当发酵周期在8h后，pH降低至2.1-2.3时，开始流加钙剂浆液，使pH维持在2.1-2.3；
(3)当发酵达时间达到24h后，控制钙剂浆液流加速度使pH维持在1.9-2.1；
(4)发酵时间达到32h后停止流加钙剂浆液，至发酵终止。
步骤(1)所述的钙剂选自碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙中的一种或多种，所述钙剂浆液中钙剂的含量为30-60g/100mL溶液。之所以控制在上述浓度范围，主要考虑到钙剂浆液的流动性及对发酵液的稀释作用，浓度太高流动性差，流加困难，浓度太低又会造成对发酵液的稀释作用。
配发酵液时，将总糖含量控制在18-19.5g/100mL溶液，常规发酵液初始糖度最高控制在18-18.5g/100mL溶液，因为如果初始糖度太高，最终柠檬酸浓度也相应变高，高浓度的柠檬酸对菌种有抑制作用，即菌种存在对柠檬酸浓度的耐受性；而本发明在发酵过程中加入了钙剂，将一部分柠檬酸转变成了柠檬酸氢钙，即在菌种对柠檬酸浓度耐受性不变的情况下，可以提高发酵初始总糖度，这样就使最终柠檬酸盐浓度相应提高。
发酵开始后，随着柠檬酸的生成，同时伴随着pH的降低，当发酵周期为8h左右，对应pH在2.1-2.3时，柠檬酸合成的关键酶：磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和柠檬酸合酶活性较高，菌种进入产酸高峰期，但随着产酸的增多，pH的降低，造成柠檬酸合成关键酶的活性降低，因此产酸速度逐渐减慢。柠檬酸是磷酸果糖激酶的抑制剂，随着柠檬酸的积累，柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制作用逐渐增强，这也是导致产酸速度减慢的一个重要原因。因此本发明在发酵周期达到8h后，特别是在8-24h，pH降低至2.1-2.3时，开始流加钙剂浆液，使pH维持在2.1-2.3；此时柠檬酸合成关键酶处于一种相对较高的活性，同时柠檬酸浓度的降低减弱了柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制作用，最终使得产酸速度得以维持。
随着发酵周期的增长，24-32h时，菌种的整体活性都有所降低，产酸速度也有所下降，而通过流加钙剂浆液，使pH维持在1.9-2.1更有利于产酸。随着整体酶活性的降低，柠檬酸合酶活性降得更快，而pH维持在1.9-2.1相比pH维持在2.1-2.3时柠檬酸合酶活性更高。这是因为柠檬酸合成的关键酶：磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和柠檬酸合酶三种酶共同参与合成柠檬酸，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶在pH为2.1-2.3时活力最高，而柠檬酸合酶在pH为1.9-2.1时活力最高；8-24h，pH维持在2.1-2.3和24-32h,pH维持在1.9-2.1时三种关键酶的整体活力较高。因此整体来看，产酸速度相对更高，所以当发酵周期在24-32h，控制钙剂浆液流加速度使pH维持在1.9-2.1。
32h后菌种逐渐进入衰亡期，酶活已经不是限制产酸速度的因素，因此停止不加钙剂浆液，使pH自然下降，至发酵终止。
由于本发明加入了钙剂产生了柠檬酸氢钙，因此检测产物的方法采用高效液相色谱法。同时检测关键酶的酶活。通过检测发酵中间16h、24h、32h的柠檬酸盐含量和相关酶活，以及放罐时柠檬酸盐含量、转化率、周期、残糖等来判定工艺的优势。
本发明测定柠檬酸盐含量的高效液相色谱方法，步骤如下：
试剂：
(1)溶剂：水，过滤后的二次蒸馏水
(2)流动相：0.5％的H3PO4/KH2PO2缓冲液，pH为2.81,含2.5％乙腈
(3)柠檬酸标准品：纯度99.5％
(4)柠檬酸标准溶液：准确称取柠檬酸标准品，精确至0.001g，用过滤后的二次蒸馏水将标准品溶解，转移、定容至50mL容量瓶中，混匀后贴标签备用。
(5)柠檬酸标准工作液：将上述标准品储备液稀释适当的3个倍数，得到三个不同浓度的系列，在给定的色谱条件下，每一浓度样品进样三次，然后绘制出标准工作曲线。
仪器：
(1)液相色谱：单元泵，可变波长检测器，化学工作站
(2)色谱柱：ODS反相柱150mm*4.6mm(I D).5um填充颗粒
(3)进样器：20微升微量进样针
(4)色谱条件：流动相0.5％的H3PO4/KH2PO2缓冲液，pH为2.81,含2.5％乙腈。流量：1.0mL/min柱温：40℃检测波长：206nm进样量：5μL保留时间3.5min。
测定步骤：
(1)样品溶液制备：称取发酵清液，明确至0.01g，用二次蒸馏水将其溶于50mL容量瓶，定容至刻度，混匀后，用0.45μm滤膜的过滤器将其过滤至样品瓶中，贴上标签备用。
(2)测定：在以上色谱条件下，运行仪器和测试方法，待基线稳定后，按标准溶液、样品顺序进样。
(3)计算：根据标准溶液绘制的标准曲线进行外标法定量，保留时间和相应因子均由标准液确定。
综上所述，本发明针对发酵过程中柠檬酸积累及pH降低造成柠檬酸合成关键酶活性的降低，从而导致产酸速度下降的现象，在发酵过程中通过流加钙剂的方法，使一部分柠檬酸转化为柠檬酸氢钙，降低了柠檬酸浓度，从而减弱了柠檬酸对关键酶-磷酸果糖激酶的抑制；同时pH的相对升高缓解了菌种对低酸的耐受，使得相关关键酶活性相对提高，最终加快了产酸速度，缩短了发酵周期。在发酵过程中产生的柠檬酸氢钙在高浓度柠檬酸条件下是可溶性的，随发酵液除去菌体后，提取方法与传统的钙盐提纯法相同。本发明打破了传统柠檬酸发酵不控pH的界限，使合成柠檬酸关键酶活性提高，缓解了菌种对低酸的耐受性，加快了产酸速度，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，提高了发酵液产物终浓度，达到了节能降耗的效果。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不以任何方式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
下述实施例中关键酶活性测定方法如下：
取发酵液，在4℃、10000rpm下离心15min收获菌体，用相应柠檬酸溶液清洗2次，然后悬浮于同样的柠檬酸溶液中，用超声波破碎仪破碎细胞，间隔30s共计5min。离心除去细胞碎片，得到的上清液即为粗酶液，可即刻或暂保存于-20℃冰箱，用于酶活的测量。所有的实验操作均在冰浴中进行。
酶活的测量在控温30℃的分光光度计中进行。所有的反应混合物加入到光程为1cm的石英比色皿中，通过最后加入细胞抽提液或者底物引发反应，反应终体积为1mL。NAD+、NADH、NADP+和NADPH的检测波长为340nm；乙酰辅酶A的检测波长为412nm，定义每单位酶活为每分钟每毫克蛋白质转化1μmo l底物为特定产物所需的酶量。
酶活的具体测量方法如下:
(1)磷酸果糖激酶(Pfk):柠檬酸溶液(pH同发酵液)，0.05mMATP，5mM MgC12，1mMEDTA，0.25mMNADH，0.25mM F6P，0.5U醛缩酶，0.5U 3-磷酸甘油醛脱氢酶，0.5U磷酸丙糖异构酶。
(2)丙酮酸激酶(pyk，EC 2.7.1.40):柠檬酸溶液(pH同发酵液)，5mMADP，1mM DTT，10mM KCl，15mM MgC12，0.5mM PEP，0.25mM NADH，10U乳酸脱氢酶。
(3)柠檬酸合酶(Cs):柠檬酸溶液(pH同发酵液)，8mM乙酰-CoA，l0mM草酰乙酸钠,10mM DTNB。
实施例1
一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，其步骤为：
(1)配制碳酸钙浆液，用碳酸钙加水调浆至碳酸钙含量为50g/100mL溶液，121℃灭菌30min，得到无菌碳酸钙浆液，待用。
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，初始总糖含量为18.5g/100mL溶液，当发酵周期在8-24h，pH降低至2.1时，此时进入产酸高峰期，开始流加碳酸钙浆液，使pH维持在2.1；
(3)当发酵周期在24-32h，控制碳酸钙浆液流加速度使pH维持在1.9；
(4)发酵周期在32h后停止流加碳酸钙浆液，至发酵终止。
发酵结束后通过板框压滤除去菌体，柠檬酸氢钙及柠檬酸溶液经传统钙盐提取法处理。
实施例2
一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，其步骤为：
(1)配制氢氧化钙浆液，用氢氧化钙加水调浆至氢氧化钙含量为40g/100mL溶液，121℃灭菌30min，得到无菌氢氧化钙浆液，待用。
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，初始总糖含量为19g/100mL溶液，当发酵周期在8-24h，pH降低至2.2时，此时进入产酸高峰期，开始流加氢氧化钙浆液，使pH维持在2.2；
(3)当发酵周期在24-32h，控制氢氧化钙浆液流加速度使pH维持在2.0；
(4)发酵周期在32h后停止流加氢氧化钙浆液，至发酵终止。
发酵结束后通过板框压滤除去菌体，柠檬酸氢钙及柠檬酸溶液经传统钙盐提取法处理。
实施例3
一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，其步骤为：
(1)配制氢氧化钙浆液，用氧化钙加水调浆至氧化钙含量为35g/100mL溶液，121℃灭菌30min，得到无菌氢氧化钙浆液，待用。
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，初始总糖含量为19.1g/100mL溶液，当发酵周期在8-24h，pH降低至2.2时，此时进入产酸高峰期，开始流加氢氧化钙浆液，使pH维持在2.2；
(3)当发酵周期在24-32h，控制氢氧化钙浆液流加速度使pH维持在2.0；
(4)发酵周期在32h后停止流加氢氧化钙浆液，至发酵终止。
发酵结束后通过板框压滤除去菌体，柠檬酸氢钙及柠檬酸溶液经传统钙盐提取法处理。
实施例4
一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，其步骤为：
(1)配制碳酸钙浆液，用碳酸钙、氢氧化钙和氧化钙按重量比1:1:1加水调浆至三种钙剂含量为55g/100mL溶液，121℃灭菌30min，得到无菌混合钙剂浆液，待用。
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，初始总糖含量为19.2g/100ml溶液，当发酵周期在8-24h，pH降低至2.3时，此时进入产酸高峰期，开始流加混合钙剂浆液，使pH维持在2.3；
(3)当发酵周期在24-32h，控制混合钙剂浆液流加速度使pH维持在2.1；
(4)发酵周期在32h后停止流加混合钙剂浆液，至发酵终止。
发酵结束后通过板框压滤除去菌体，柠檬酸氢钙及柠檬酸溶液经传统钙盐提取法处理。比较例1
现有柠檬酸发酵技术，其步骤为：
(1)取适量蒸馏水，121℃灭菌30min，得到无菌水，待用。
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，初始总糖含量为18.5g/100mL溶液，发酵中按实施例1的补加钙剂浆液量及时间流加无菌水；至发酵终止。
比较例2
现有柠檬酸发酵技术，其步骤为：
(1)取适量蒸馏水，121℃灭菌30min，得到无菌水，待用。
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，初始总糖含量为19g/100mL溶液，发酵中按实施例2的补加钙剂浆液量及时间流加无菌水；至发酵终止。
取发酵过程16h、24h、32h的发酵液，分别检测pH、产酸速率及柠檬酸关键酶—磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和柠檬酸合酶的酶活。结果如表1。结果显示：16h、24h和32h时控制pH较不控pH，产酸及关键酶酶活都偏高。
表1发酵过程相关参数对比
将实施例1-4的各项指标与比较例1-2现有技术进行对比，发现本发明的各项指标明显优于现有技术，结果如表2:
表2本发明与现有技术的各项指标对比
综上所述，本发明提供的柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，采用分阶段控制不同pH的策略，降低了柠檬酸浓度，从而减弱了柠檬酸对关键酶-磷酸果糖激酶的抑制；同时pH的相对升高缓解了菌种对低酸的耐受，使得相关关键酶活性相对提高，促进菌种产酸，提高了整体发酵强度，缩短了发酵周期，提高了产酸量和转化率，提高了设备的利用率；同时，相对提高了最终发酵液的产物浓度，更有利于后提取工艺，综合提高了企业的竞争力和经济效益。

Claims (3)

1.一种柠檬酸发酵过程中流加钙剂的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)配制钙剂浆液，121℃灭菌30分钟，得到无菌钙剂浆液，待用；
(2)发酵罐接入种子液进行发酵，随着发酵进行，发酵液pH降低，当发酵周期在8h后，pH降低至2.1-2.3时，开始流加钙剂浆液，使pH维持在2.1-2.3；
(3)当发酵时间达到24h后，控制钙剂浆液流加速度使pH维持在1.9-2.1；
(4)发酵时间达到32h后停止流加钙剂浆液，至发酵终止。
2.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵过程中流加钙剂的工艺，其特征在于：步骤(1)所述的钙剂选自碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙中的一种或多种，所述钙剂浆液中钙剂的含量为30-60g/100mL溶液。
3.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵过程中流加钙剂的工艺，其特征在于：步骤(2)所述的发酵初始总糖的含量为18-19.5g/100mL溶液。
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